本发明涉及一种壳寡糖在制备缓解酒精性神经损伤的功能性食品中的应用，属于功能食品技术领域。
背景技术：
胎儿酒精综合症(fasd)是胎儿酒精暴露引起的一系列神经发育损害，是欧美国家可预防严重智力残疾的主要诱因。胎儿酒精谱系综合症的症状包括胎儿出生前后发育迟缓，面部缺损或畸变，中枢神经系统发育异常等。产前酒精暴露对发育中的神经系统造成影响包括皮质厚度、脑容量和神经活动的降低，损害基底神经节，小脑，海马和前额叶皮层等大脑区域的发育，从而破坏学习和记忆能力。胎儿酒精综合症目前无法根治，酒精对中枢神经系统的损害是永久的，临床上多使用一般精神药物进行治疗，对中枢神经系统直接进行作用，但长期应用易引起明显依赖性，对人体健康有明显影响。
壳寡糖是由壳聚糖经化学或酶解后获得，研究发现壳寡糖具有的多种生理活性如抗氧化，抗炎作用等，使其对乙酰胆碱酯酶、β-分泌酶、tau蛋白等活性物质都有一定程度的影响，壳寡糖的分子量与应用技术效果之间关系密切，但窄分布壳寡糖在制备酒精性神经损伤的功能性食品中的应用及其具体作用机制尚未报道，影响其进一步的推广应用。
技术实现要素：
为解决上述技术问题，本发明提供一种壳寡糖在制备缓解酒精性神经损伤的功能性食品中的应用，本发明通过采用相对分子量为1299的壳寡糖对酒精诱导的神经损伤sd大鼠幼鼠进行治疗，通过提高脑神经营养因子、改善脑组织病理学，降低超氧化物歧化酶、提高总抗氧化能力，影响神经细胞的凋亡进程，进而影响认知能力与学习记忆能力。
本发明的第一个目的是提供一种壳寡糖在制备缓解酒精性神经损伤的功能性食品中的应用，所述壳寡糖的相对分子量为1200-1300。
进一步地，所述的壳寡糖的聚合度为6-7。
进一步地，所述的壳寡糖的脱乙酰度为80-90％。
进一步地，所述的壳寡糖的用量为0.04-0.045g/kg。
进一步地，所述的酒精性神经损伤的功能性食品为提高脑神经营养因子、改善脑组织病理学的功能性食品。
进一步地，所述的酒精性神经损伤的功能性食品为降降低超氧化物歧化酶、提高总抗氧化能力的功能性食品。
进一步地，所述的酒精性神经损伤的功能性食品为影响神经细胞的凋亡进程，进而影响认知能力与学习记忆能力的修复与改善的功能性食品。
本发明的第二个目的是提供一种缓解酒精性神经损伤的功能性食品，所述的功能性食品包含相对分子量为1200-1300的壳寡糖。
本发明的有益效果是：
本发明中采用的壳寡糖剂量更为接近人体推荐摄入量，利用相对分子量为1299，脱乙酰度为85％的壳寡糖，每日剂量45mg/kg/d，可以缓解酒精暴露导致的脑神经损伤。
由于本发明中所采用的壳寡糖分子量分布较为集中，其缓解脑神经损伤的机制研究更为明确，通过提高脑神经营养因子、改善脑组织病理学，降低超氧化物歧化酶、提高总抗氧化能力，影响神经细胞的凋亡进程，进而对认知能力与学习记忆能力的进行修复与改善。
附图说明
图1所示为窄分布壳寡糖对酒精诱导的脑神经损伤大鼠幼鼠的体重和脑重指数的影响结果图。
图2所示为窄分布壳寡糖对酒精诱导的脑神经损伤大鼠幼鼠脑神经营养因子的影响。
图3所示为窄分布壳寡糖对酒精诱导的脑神经损伤大鼠幼鼠对超氧化物歧化酶、总抗氧化能力的影响结果图。
图4所示为窄分布壳寡糖对酒精诱导的脑神经损伤大鼠幼鼠脑组织形态的影响结果图。
图5所示为特定剂量的窄分布壳寡糖对酒精诱导的脑神经损伤大鼠幼鼠认知与记忆能力的影响结果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实验材料：
药品与试剂：
壳寡糖：平均分子量为1299的壳寡糖；脑神经营养因子elisa检测试剂盒、超氧化物歧化酶试剂盒、总抗氧化能力试剂盒：南京建成生物工程研究所；苏木精、伊红。
仪器：
4k15冷冻型大容量离心机：德国sigma公司；uv-1800紫外可见分光光度计：日本岛津公司；m5酶标仪：美国moleculardevices公司；pm2245徕卡手动转轮切片机：德国徕卡公司；dk0-8d恒温水浴锅；金坛市新航仪器厂；超低温冷冻冰箱：日本三洋电机公司；wtl-6k迷你离心机：湖南湘仪离心机仪器有限公司；eclipse尼康显微镜：日本尼康公司。
实验方法：
选取新生spf级sd新生大鼠36只(购自北京斯贝福动物中心)，按体重随机分为对照组(control)、模型组(etoh)及壳寡糖给药组(etoh cos)共3组，每组12只，共36只，尽量每组都有相同数量的雌性和雄性。通过灌胃法进行新生大鼠乙醇给药，pd5-pd9给药5天，5.25g/kg/d，分两次给药。壳寡糖组给药为pd5-pd9，给药5天，45mg/kg/天，模型组给予同体积溶剂。溶剂在pd5早上9点进行第一次灌胃，将幼仔与母鼠分开并称重，称重需在加热垫上进行，注意保暖。正常组不进行任何处理，模型组与壳寡糖组每天进行两次酒精给药，壳寡糖组在第一次酒精给药前90min内进行壳寡糖给药。酒精模型组给予每日5.25g/kg乙醇，分两次给药，浓度为20％乙醇溶液，由95％食品级酒精配置。第二次给药在第一次给药后2h。每次灌胃完成后将幼仔归还给母鼠，幼鼠自由进食进水。实验过程每天称取幼鼠体重，并记录幼鼠精神状态等一般情况。
pd28-pd35(每只鼠体重为95～105g)进行水迷宫试验，利用morris水迷宫实验测大鼠的学习记忆能力，实验过程包括5d的隐藏平台潜伏期实验和1d空间探索实验，每组随机选取5只大鼠进行水迷宫实验[33-34]。
隐藏平台实验第1、2天，先引导大鼠站立于平台上10s，以帮助大鼠熟悉和记忆平台位置，然后在1、2、3、4象限，让大鼠面向水池壁入水。记录大鼠在60s内寻找隐藏平台所需时间(即逃避潜伏期)，同时记录大鼠所经过的游泳距离、游泳路线。若入水后60s大鼠未能找到平台，则将其轻轻从水中拖上平台，并停30s，然后进行下一次训练。每只大鼠从四个入水点分别放入水池为一次训练，两次训练之间间隔30s。
第5天撤除平台进行空间探索实验，任选一个入水点将大鼠放入水中，大鼠在水中游泳60s，测定大鼠在目标象限(原平台所在象限)的停留时间，以及穿越平台次数。
产后第十天称重，于冰上取出大鼠幼鼠脑组织用生理盐水清洗后并称重，脑器官指数＝脑质量(mg)/大鼠幼鼠体重(g)×100％，将组织在-80℃下储存直至测定各项指标。各组随机抽取3只大鼠，在称取终体重后，用4％多聚甲醛进行心腔内灌注后，取脑并固定1d，待进行脑组织形态学检测。
脑器官指数＝脑质量(mg)/幼鼠体重(g)×100％
病理检测：
对有数脑组织切片进行he染色并观察情况：
在4％多聚甲醛溶液中固定24小时后，将组织块移至包埋盒中脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、烤片，he染色后，于光学显微镜下观察。
统计学方法：
采用spss17.0统计软件中的one-wayanova方法对实验数据进行多重比较、差异显著性检验分析。
实施例1：窄分布壳寡糖酒精诱导的脑神经损伤大鼠幼鼠的体重和脑重指数的影响
在大鼠幼鼠饲喂每一天进行体重称量、计算与第一天的体重变化程度，并记录大鼠精神状态等情况。图1所示为窄分布壳寡糖对酒精诱导的脑神经损伤大鼠幼鼠的体重和脑重指数的影响结果图。参考图1可知，本发明壳寡糖灌胃后在第2天就能够极显著改善酒精诱导的脑神经损伤大鼠幼鼠的体重下降、精神萎靡等情况，经壳寡糖干预后脑器官指数降低，与正常组无差别(p＞0.05)。
实施例2：窄分布壳寡糖对对酒精诱导的脑神经损伤大鼠幼鼠脑神经营养因子和神经递质乙酰胆碱水平变化的影响
bdnf是神经营养因子家族的重要成员，在中枢神经系统中发挥重要作用。参考图2可知，与正常组相比，酒精诱导的脑神经损伤大鼠幼鼠模型组大鼠幼鼠的脑神经营养因子bdnf水平相比对照组显著下降，且有极显著差异(p＜0.01)。而壳寡糖治疗组的脑神经营养因子bdnf水平相比模型组有明显的上升，且有极显著差异(p＜0.01)，壳寡糖具有较好的提高bdnf水平作用。乙酰胆碱(ach)是中枢胆碱能系统中重要的神经递质之一，其主要功能是维持意识的清醒，对认知和学习记忆能力有重要影响。模型组大鼠幼鼠的乙酰胆碱水平相比对照组显著下降，且有极显著差异(p＜0.01)，说明酒精暴露导致大鼠幼鼠体内乙酰胆碱水平明显降低，壳寡糖治疗组的乙酰胆碱水平相比模型组有所上升，有显著差异(p＜0.01)，说明壳寡糖能够使酒精暴露导致ach水平的下降受到明显抑制。
实施例3：窄分布壳寡糖酒精诱导的脑神经损伤大鼠幼鼠超氧化物歧化酶、总抗氧化能力水平的影响
氧化损伤在fasd的发病机制中起着重要作用，超氧化物歧化酶(sod)的活力水平和总抗氧化能力(t-aoc)水平能够评价酒精诱导的脑神经损伤大鼠幼鼠的氧化损伤水平。
参考图3可知，模型组较正常组sod和t-aoc水平明显降低(p<0.01)，说明酒精暴露使大鼠幼鼠脑部神经有较严重的氧化损伤，壳寡糖干预组较模型组的sodt-aoc含量明显提高(p<0.01)，说明壳寡糖可以提高sd大鼠幼鼠脑组织中的抗氧化能力和其清除自由基的能力。
实施例4：窄分布壳寡糖对酒精诱导的脑神经损伤大鼠幼鼠脑组织形态的影响结果
图4所示为各组在pd10时，新生大鼠的脑组织海马区he染色情况。从图中可以看出：正常组神经细胞则排列紧密，层次清除，细胞结构完整、细胞核清晰。模型组相比正常组海马区神经细胞有明显的的固缩变性，细胞核深染难以辨认，排列不规则，部分神经细胞出现坏死变形，细胞间隔变大，说明酒精暴露导致大鼠幼鼠脑组织形态损伤明显。壳寡糖干预组相比模型组只有有小部分神经细胞出现固缩变性，变形坏死情况，但大部分神经细胞结构完整、细胞核可辨。
实施例5：窄分布壳寡糖酒精诱导的脑神经损伤大鼠幼鼠认知与记忆能力的影响结果
图5所示为特定剂量的窄分布壳寡糖对酒精诱导的脑神经损伤大鼠幼鼠认知与记忆能力的影响结果图。从图中可以看出：训练第一天各组平台潜伏期时间相差较小，无显著性差异。从d3和d5中可以看出在后4天的训练中，各组大鼠逃避潜伏期的时间逐渐下降，其中正常组下降较明显，说明正常组大鼠幼鼠的学习记忆能力在训练中得到了提高。在d5的训练中，壳寡糖以及正常组与模型组比较，大鼠逃避潜伏期时间显著缩短，具有显著性差异(p＜0.01)，且壳寡糖干预组的逃避潜伏时间与正常组的逃避潜伏时间相近，无显著性差异(p＞0.05)。实验结果显示，壳寡糖具有显著缩短脑损伤sd大鼠幼鼠的逃避潜伏期时间作用，这表明壳寡糖在训练的过程中可能对提高sd大鼠幼鼠的空间记忆力能力和学习能力有一定的效果。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
1.一种壳寡糖在制备缓解酒精性神经损伤的功能性食品中的应用，其特征在于，所述壳寡糖的相对分子量为1200-1300。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的壳寡糖的聚合度为6-7。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的壳寡糖的脱乙酰度为80-90％。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的壳寡糖的用量为0.04-0.045g/kg。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的缓解酒精性神经损伤的功能性食品为提高脑神经营养因子、改善脑组织病理学的功能性食品。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的缓解酒精性神经损伤的功能性食品为降降低超氧化物歧化酶、提高总抗氧化能力的功能性食品。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的缓解酒精性神经损伤的功能性食品为影响神经细胞的凋亡进程，进而影响认知能力与学习记忆能力的修复与改善的功能性食品。
8.一种缓解酒精性神经损伤的功能性食品，其特征在于，所述的功能性食品包含相对分子量为1200-1300的壳寡糖。
技术总结