本发明属于生物工程和保健品制备技术领域，具体涉及一种新型降血脂功能红曲粉的制备方法。
背景技术：
亚油酸乙酯是一种无色至淡黄色油状液体，具有降低血液中胆固醇和血脂作用的物质，主要用作制药原料，防治动脉粥样硬化症。亚油酸乙酯与亚油酸结构上相似，具有降低血脂、软化血管、降低血压、促进微循环的作用，但亚油酸直接食用会刺激咽喉，而亚油酸乙酯是由亚油酸与低级醇所生成的酯，在体内易水解，而且有机酯性质稳定，更易于保存。
目前，亚油酸乙酯的生产方法主要是通过化学法和酶法来制备。亚油酸乙酯常用制备工艺是把大豆油或葵花籽油中的亚油酸甘油酯转化为亚油酸，再通过酯化作用与乙醇脱水缩合成亚油酸乙酯，其催化活性高，价廉易得，但存在诸如设备腐蚀严重、污染环境等问题，而且亚油酸在酯化过程中易发生氧化，分子中不饱和双键被破坏致使酯化产物亚油酸乙酯的碘值下降，其质量难以保证。亚油酸乙酯也可用酶法来制备，而酶催化法由于酶源有限，成本高，酯化得率不理想尚未能实现工业化生产。亚油酸乙酯还在酒体以及成熟的水果中被检测到，其含量较少，酒体中约为5-10mg/l，水果中约为100-150μg/g。利用微生物发酵法直接生产亚油酸乙酯未见报道。
本发明旨在利用红曲菌发酵生产一种富含亚油酸乙酯的新型降血脂功能红曲粉。现有功能红曲主要富含monacolink，monacolink降血脂效果较好，但其结构不稳定，容易转化为内酯式结构。本发明利用酯化能力较强的紫色红曲菌z505，液态发酵生产亚油酸乙酯，是一种新的亚油酸乙酯的生产方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种新型降血脂功能红曲粉的制备方法，该方法利用谷物类为原料进行红曲菌液态发酵，制备的功能红曲粉中亚油酸乙酯含量高，具有降血脂的功能。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种新型降血脂功能红曲粉的制备方法，包括以下步骤：将紫色红曲菌(monascuspurpureus)z505种子液接种到发酵培养基中进行培养，所得发酵液经过滤、冻干、粉碎，得到具有降血脂功能的功能红曲粉。其中，所述的紫色红曲菌(monascuspurpureus)z505，其于2019年3月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址中国.武汉.武汉大学，保藏编号为cctccno：m2019162。
优选的，所述的紫色红曲菌z505种子液通过包括以下步骤的方法制备得到：将红曲菌接入到斜面培养基中，在30℃下培养6-9d，得到一级种子；将斜面培养基中的一级种子刮取后接种于二级种子培养基中，于30℃、200rpm下振荡培养2-3d，得到二级种子，二级种子作为种子液用于接种到发酵培养基中进行培养。其中，斜面培养基的配方优选为：葡萄糖6％，蛋白胨2％，可溶性淀粉3％，琼脂3％，余量为水，ph5-6；二级种子培养基的配方优选为：谷物类2-4％，黄豆粉1-2％，葡萄糖1-2％，蛋白胨1-2％，磷酸二氢钾0.1-1％，硫酸镁0.01-0.1％，余量为水，ph5-6。更为优选的，二级种子培养基的配方为：谷物类2％，黄豆粉1％，葡萄糖1％，蛋白胨1％，磷酸二氢钾0.5％，七水硫酸镁0.05％，余量为水，ph5-6。
优选的，所述的发酵培养基的配方为：谷物类4-8％，黄豆粉1-3％，硫酸铵0.2-1％，磷酸二氢钾0.1-1％，硫酸镁0.01-0.1％，氯化钾0.01-0.1％，硫酸亚铁0.0001-0.001％，硫酸锰0.001-0.005％，硫酸锌0.0001-0.001％，余量为水，ph5-6。更为优选的，所述的发酵培养基的配方为：谷物类5％，黄豆粉1％，硫酸铵0.5％，磷酸二氢钾0.5％，硫酸镁0.05％，氯化钾0.05％，硫酸亚铁0.0005％，硫酸锰0.003％，硫酸锌0.0005％，余量为水，ph5-6。
上述配方中各组分浓度为质量百分比浓度。
优选地，上述斜面培养基、二级种子培养基、发酵培养基的ph调节剂为乳酸。
优选的，所述的培养条件优选为：先在24-30℃、150-250rpm下培养1-2d，再在18-24℃、140-180rpm下培养3-7d。
优选的，所述的紫色红曲菌z505种子液接种到发酵培养基中的接种量为8％-12％(v/v)。
优选的，上述谷物类原料选用大米粉、薏米粉、黑米粉等谷物中的一种或多种。
一种新型降血脂功能红曲粉，通过上述方法制备得到。该新型降血脂功能红曲粉可用于食品或保健品中。
本发明还提供一种高产亚油酸乙酯的红曲菌，以及一种微生物发酵生产亚油酸乙酯的方法。
一种高产亚油酸乙酯的红曲菌，为保藏编号为cctccno：m2019162的紫色红曲菌(monascuspurpureus)z505。
一种微生物发酵生产亚油酸乙酯的方法，为利用上述紫色红曲菌z505进行发酵生产亚油酸乙酯。
本发明具有以下优点和有益效果：
本发明从多株酯化力较强的红曲菌中筛选出高产亚油酸乙酯的紫色红曲菌z505为出发菌株，以营养全面而丰富的谷物类原料作为发酵底物，在添加有多种无机盐的复合配方中低温发酵培养，所得发酵液中亚油酸乙酯的含量为307.41mg/l，所得功能红曲粉中亚油酸乙酯的含量为14.90mg/g。采用谷物类原料作为发酵底物不仅成本低廉，且不受季节及地域的限制。
本发明制备的新型功能红曲粉，是一款富含亚油酸乙酯、具有降血脂功能的产品，可用于食品以及保健品中。
附图说明
图1是本发明以大米、黄豆为原料，经紫色红曲菌z505发酵所得的红曲菌发酵液使用气相色谱质谱联用仪所检测的图谱；图中：1.乙酸丁酯，2.苯乙醇，3.棕榈酸，4.棕榈酸乙酯，5.亚油酸，6.亚油酸乙酯。
具体实施方式
为更好的理解本发明，下面的实施例是对本发明的进一步说明，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1：菌种的筛选
以实验室现有的多株具有较强酯化能力的红曲菌菌种(z505、gn、h4000等)为研究对象，进行红曲菌斜面种子活化，液态种子培养以及液态发酵培养，获得红曲菌发酵液，再经过过滤、冻干、粉碎得到功能红曲粉，利用气相色谱质谱联用仪测定其亚油酸乙酯含量。
斜面培养基：葡萄糖6g、蛋白胨2g、可溶性淀粉3g、琼脂3g，加热溶解于100ml水中，用乳酸调节ph值为5.38，分装于试管中，约8ml/管，115℃、30min灭菌。
二级种子培养基：称取切成小块的鲜红薯块10g、葡萄糖2g、蛋白胨0.6g、磷酸二氢钾0.3g、硫酸镁0.2g，加水100ml，用乳酸调节ph为5.39，121℃、20min灭菌。
发酵培养基：称取切成小块的鲜红薯块20g、葡萄糖2g、酵母粉0.14g、蛋白胨0.8g、磷酸二氢钾0.1g、硫酸镁0.05g，硫酸锌0.1g、碳酸钙0.1g，加入100ml水中，用乳酸调节ph为5.32，于121℃灭菌20min。
(1)将不同红曲菌分别接种到斜面培养基中，在30℃培养箱中培养7d，得到一级种子。
(2)将斜面培养基中的一级种子刮取后分别接种于二级种子培养基中，于30℃、200rpm条件下培养2d，得到二级种子。
(3)将二级种子以10％(v/v)的接种量分别接入到发酵培养基中，在30℃、200rpm条件下培养6d，得到红曲菌发酵液，再经过过滤、冻干、粉碎得到红曲粉。测定红曲菌发酵液和红曲粉中的亚油酸乙酯含量，结果见表1。
表1不同菌种产亚油酸乙酯的情况
由实施例1中筛选出产亚油酸乙酯能力突出的紫色红曲菌菌株z505，并以此菌株进行下面的实验。紫色红曲菌菌株z505已于2019年3月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址中国.武汉.武汉大学，保藏编号为cctccno：m2019162。
实施例2：
斜面培养基：同实施例1。
二级种子培养基：原料2g，黄豆粉1g，葡萄糖2g，蛋白胨1g，加水100ml，用乳酸调节ph值在5.3-5.6之间，于115℃灭菌30min。
发酵培养基：原料5g，黄豆粉2g，硫酸镁0.05g，磷酸二氢钾0.5g，加水100ml，用乳酸调节ph值在5.5-5.8之间，于121℃灭菌20min。
所述谷物类原料分别为大米粉、薏米粉、黑米粉、紫薯粉、红薯粉、新鲜红薯，二级种子培养基和发酵培养基中的谷物类原料相同。按照实施例1中的方法将得到的二级种子以10％(v/v)的接种量接入到发酵培养基中，分别在20℃、200rpm和30℃、200rpm条件下发酵培养7d，获得红曲菌发酵液，再经过过滤、冻干、粉碎得到功能红曲粉，利用气相色谱质谱联用仪测定亚油酸乙酯含量，结果见表2。
表2z505利用不同原料产亚油酸乙酯的情况
由实施例2可以知道紫色红曲菌z505利用谷物类低温发酵得到亚油酸乙酯的含量相对较高，下述实验将进一步利用谷物进行低温发酵。
实施例3：
(1)斜面培养基：同实施例1。
(2)接种红曲菌，进行斜面培养：将紫色红曲菌z505接入到斜面培养基中，在30℃下培养7d，得到一级种子。
(3)配制二级种子培养基：称取大米粉2g、黄豆粉1g、葡萄糖1g、蛋白胨1g、磷酸二氢钾0.5g、硫酸镁0.05g，加水100ml，用乳酸调节ph值为5.43，121℃灭菌20min。
(4)接种红曲菌，进行二级种子培养：将斜面培养基中的一级种子刮取后接种于二级种子培养基中，于30℃、200rpm下振荡培养2d，得到二级种子。
(5)配制发酵培养基：称取大米粉5g、黄豆粉1g、硫酸铵0.5g、磷酸二氢钾0.5g、硫酸镁0.05g、氯化钾0.05g、硫酸亚铁0.0005g、硫酸锰0.003g、硫酸锌0.0005g，加入100ml水中，用乳酸调节ph值为5.46，121℃灭菌20min，制得发酵培养基。
(6)接种红曲菌，进行液态发酵培养：将二级种子接种入发酵培养基中，在24℃、200rpm发酵2d，然后在20℃、150rpm下振荡培养5d，得红曲菌发酵液，再经过过滤、冻干、粉碎得到功能红曲粉。
经检测红曲菌发酵液中亚油酸乙酯的含量为255.77mg/l，新型功能红曲粉中亚油酸乙酯的含量为12.40mg/g。
实施例4：
(1)斜面培养基：同实施例1。
(2)接种红曲菌，进行斜面培养：将紫色红曲菌种z505接入到斜面培养基中，在30℃下培养7d，得到一级种子。
(3)配制二级种子培养基：称取大米粉2g、黄豆粉1g、葡萄糖1g、蛋白胨1g、磷酸二氢钾0.5g、硫酸镁0.05g，加水100ml，用乳酸调节ph值为5.43，121℃灭菌20min。
(4)接种红曲菌，进行二级种子培养：将斜面培养基中的一级种子刮取后接种于二级种子培养基中，于30℃、200rpm下振荡培养2d，得到二级种子。
(5)配制发酵培养基：称取大米粉5g、黄豆粉1g、硫酸铵0.5g、磷酸二氢钾0.5g、硫酸镁0.05g、氯化钾0.05g、硫酸亚铁0.0005g、硫酸锰0.003g、硫酸锌0.0005g，加入100ml水中，用乳酸调节ph值为5.44，121℃灭菌20min，制得发酵培养基。
(6)接种红曲菌，进行液态发酵培养：将二级种子以10％(v/v)的接种量接入到发酵培养基中，在30℃、200rpm发酵2d，然后在20℃、200rpm下振荡培养3d，得红曲菌发酵液，再经过过滤、冻干、粉碎得到功能红曲粉。
经检测红曲菌发酵液中亚油酸乙酯的含量为307.41mg/l，功能红曲粉中亚油酸乙酯的含量为14.90mg/g。
图1为以大米、黄豆为原料发酵所得的红曲菌发酵液使用气相质谱联用仪所检测的图谱，由气质图谱可知，红曲菌发酵液中主要由乙酸丁酯、苯乙醇、棕榈酸、棕榈酸乙酯、亚油酸和亚油酸乙酯等化合物组成，且亚油酸乙酯的含量高。
以上所述是本发明的优选实施方式而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和变动，这些改进和变动也视为本发明的保护范围。
1.一种降血脂功能红曲粉的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：将紫色红曲菌(monascuspurpureus)z505种子液接种到发酵培养基中进行培养，所得发酵液经过滤、冻干、粉碎，得到具有降血脂功能的功能红曲粉；其中，所述的紫色红曲菌z505的保藏编号为cctccno：m2019162。
2.根据权利要求1所述的降血脂功能红曲粉的制备方法，其特征在于：所述的发酵培养基的配方为：谷物类4-8％，黄豆粉1-3％，硫酸铵0.2-1％，磷酸二氢钾0.1-1％，硫酸镁0.01-0.1％，氯化钾0.01-0.1％，硫酸亚铁0.0001-0.001％，硫酸锰0.001-0.005％，硫酸锌0.0001-0.001％，余量为水，ph5-6。
3.根据权利要求2所述的降血脂功能红曲粉的制备方法，其特征在于：所述的谷物类为大米粉、薏米粉、黑米粉中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的降血脂功能红曲粉的制备方法，其特征在于：所述的培养的条件为：先在24-30℃、150-250rpm下培养1-2d，再在18-24℃、140-180rpm下培养3-7d。
5.根据权利要求1所述的降血脂功能红曲粉的制备方法，其特征在于：所述的紫色红曲菌z505种子液通过包括以下步骤的方法制备得到：将红曲菌接入到斜面培养基中，在30℃下培养6-9d，得到一级种子；将斜面培养基中的一级种子刮取后接种于二级种子培养基中，于30℃、200rpm下振荡培养2-3d，得到二级种子，二级种子作为种子液用于接种到发酵培养基中进行培养。
6.根据权利要求5所述的降血脂功能红曲粉的制备方法，其特征在于：
所述的斜面培养基的配方为：葡萄糖6％，蛋白胨2％，可溶性淀粉3％，琼脂3％，余量为水，ph5-6；
所述的二级种子培养基的配方为：谷物类2-4％，黄豆粉1-2％，葡萄糖1-2％，蛋白胨1-2％，磷酸二氢钾0.1-1％，硫酸镁0.01-0.1％，余量为水，ph5-6。
7.一种降血脂功能红曲粉，其特征在于：通过权利要求1-6任一项所述的制备方法得到。
8.权利要求7所述的降血脂功能红曲粉在食品或保健品中的应用。
9.一种高产亚油酸乙酯的红曲菌，其特征在于：为保藏编号为cctccno：m2019162的紫色红曲菌(monascuspurpureus)z505。
10.一种微生物发酵生产亚油酸乙酯的方法，其特征在于：所述的方法为利用权利要求9所述的紫色红曲菌z505进行发酵生产亚油酸乙酯。
技术总结