本发明属于糖类药物合成技术领域，涉及糖类物质的化学酶合成方法，尤其是一种唾液酸乳糖糖苷和/或类似物、合成方法及应用。
背景技术：
流感病毒的神经氨酸酶(na)是a型和b型流感病毒的第2个主要的表面蛋白，由胞质区和穿膜区组成的高聚体，有一细长的茎部和球状的头部，它的n-末端嵌入在病毒的包膜中。x-线衍射技术揭示了na的酶活性位点及抗原决定簇。唾液酸(sialicacid,sa)是na的天然受体，它通过分子结构的某些部位与酶活中心的某些氨基酸相互作用而与na牢固结合。据报道研究发现，位于酶活中心的三个带正电荷的氨基酸，即精氨酸118,精氨酸292及精氨酸371，可与sa的羟基结合，另一个重要的部位是酶活中心的两个带负电的氨基酸残基(谷氨酸119及谷氨酶227)。在流感病毒na的三维结构被确定后,其分子催化位点也被确定。na能水解sa与邻位的糖残基之间的α-糖苷键。na的底物特异性取决于sa的种类以及sa与半乳糖之间的糖苷键的类型。禽流感病毒的na优先水解sia(α2→3)gal，而人类病毒的na不仅能水解sia(α2→3)gal糖苷键，而且能水解sia(α2→6)gal糖苷键。na的作用位点通过x-线衍射技术确定后，产生了大量酶与sa底物的分子结构研究。以na为靶点的唾液酸类似物成为寻找抗流感药物的新的研究领域。
经实验证明，对唾液酸的c5位进行修饰是研究唾液酸酶底物特异性的有效手段。人流感病毒和禽流感a菌株等多种流感病毒对于c5”位修饰的唾液酸糖苷水解结果显示，c5位的取代基不同，水解效率表现出显著性差异。这些结果对设计针对特定流感毒株的新型抗病毒药物有很大帮助，但是高效和大量获得这些糖苷仍然是一个难题。虽然近年来，化学糖苷化获得了快速的进展；但依然没有一个统一有效地普适性方法。化学合成唾液酸糖苷及其类似物通常需要冗繁的保护及脱保护步骤，路线长，收率低下。尤其是九碳糖唾液酸，由于其自身独特结构，不仅容易形成分子内氢键，且在c1位的羧基、c3位的脱氧、c5位的氮杂原子取代均降低了糖环上的电子密度，使得唾液酸糖苷键的构建成为糖合成领域的经典挑战。目前，通过糖基转移酶来催化的酶法合成也面临以下几方面的困难：一是反应往往需要价格昂贵的活性糖为中间体，二是反应的催化往往需要多酶体系，而相应酶的获得又比较困难；三是使用的系列酶往往有较强的底物专一性，底物适用性窄难，以耐受非天然的修饰。值得一提的是，近年来发现的细菌来源的唾液酸转移酶能在重组大肠杆菌中大量表达，而且容易纯化，具有表达量高、底物适应性宽等优点。因此，本发明考虑充分结合化学合成和酶法合成的各自优点，使用细菌来源的系列酶，运用化学酶法合成策略来合成唾液酸化乳糖糖苷及其类似物，方便抗病毒类药物的研究。
通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种唾液酸乳糖糖苷和/或类似物、合成方法及应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种唾液酸乳糖糖苷和/或类似物，其通式如下：
其中：
r1，选自氢原子、α-或β-构型丝氨酸残基、α-或β-苏氨酸残基、叠氮取代烷基、巯基取代烷基、α-或β-构型取代烷基；
r2，选自氟原子、氢原子、叠氮、羟基、氮乙酰基；
r3，选自氟原子、氢原子、乙酰基、羟基；
r4，选自氟原子、氢原子、乙酰基、羟基；
r5，选自氢原子、乙酰基、甲酰基、甲氧酰基、苯甲酰基、对氟苯甲酰基、对甲氧基苯甲酰基、对氯苯甲酰基、1,3-苯并二茂磺酰基、4-苯基苯甲酰基、氟乙酰基、丙酰基、氮乙酰基、氮丙酰基、氮三氟乙酰基、氮叠氮乙酰基；
r6，选自氟原子、氢原子、乙酰基、羟基。
而且，其名称为
化合物[2,3,4,6-四-o-乙酰基-β-d-吡喃半乳糖]-[1→4]-2,3,6-三-o-乙酰基-β-d-吡喃葡萄糖-三氯乙酰亚胺酯；
或者，为化合物(β-d-吡喃半乳糖)-(1→4)-3-叠氮丙基-β-d-吡喃葡萄糖；
或者，为化合物[5-n-神经氨酸]-(2→3)-(β-d-吡喃半乳糖)-(1→4)-3-叠氮丙基-β-d-吡喃葡萄糖
而且，其结构式为如下中的一种：
如上所述的唾液酸乳糖糖苷和/或类似物的合成方法，包括如下步骤：
⑴选用通式ⅰ所示的乳糖受体和/或其类似物：
其中：
r1，选自氢原子、α-或β-构型丝氨酸残基、α-或β-苏氨酸残基、叠氮取代烷基、巯基取代烷基、α-或β-构型取代烷基、三氯乙酰亚胺酯；
r2，选自氟原子、氢原子、叠氮、羟基、氮乙酰基；
r3，选自氟原子、氢原子、乙酰基、羟基；
r4，选自氟原子、氢原子、乙酰基、羟基；
⑵利用对糖环羟基的保护和脱保护操作以及糖苷化反应将通式ⅰ所示的化合物引入叠氮链，然后脱除保护基；
将乳糖和/或其类似物与回流中的醋酐和醋酸钠溶液反应，即将羟基用乙酰基进行保护；之后在四氢呋喃和/或甲醇体系中，加入醋酸铵对酰化产物还原端的c1-位乙酰基团进行离去，得到中间体；然后在冰浴条件下，加入三氯乙腈和dbu，室温反应获得三氯乙酰亚胺酯；随后在3-氯-1-丙醇及三氟化硼乙醚条件下进行糖苷化反应，制备乳糖糖苷；然后，在四丁基氟化铵和叠氮基三甲基硅烷条件下，将氯原子置换成叠氮；最后在甲醇/甲醇钠的条件下将乙酰基脱去，得到乳糖受体和/或其类似物；
⑶利用一釜三酶法在通式ⅰ所示的化合物中引入唾液酸类似物；
将1.0当量的乳糖受体和/或其类似物、1.0～20.0当量的氮乙酰甘露糖和/或其类似物、1.0～10.0当量的丙酮酸钠、1.0～20.0当量的ctp即胞苷三磷酸、5.0～100mm的mgcl2和10～500mm、ph5.0～10.5的tris-hcl缓冲液配制水溶液，加入醛缩酶、cmp-唾液酸合成酶和α2,3唾液酸转移酶，从而实现一釜三酶法的唾液酸化；之后使用聚丙烯酰胺凝胶p2柱进行纯化，最终得到唾液酸化乳糖和/或其类似物，即得唾液酸乳糖糖苷和/或类似物。
而且，所述步骤⑶中一釜三酶法反应时间为5分钟～30小时；一釜三酶法的反应温度为0～37℃，转速为0～240rpm；所述酶反应的停止方法是向反应中加入等体积的4℃无水乙醇并在4℃下培育0～30分钟；
或者，所述步骤⑶中一釜三酶法唾液酸化中用到的酶是细菌来源的醛缩酶pmaldolase、neisseriameningitidescmp-sialicacidsynthetase(nmcss)和pasteurellamultocidasialyltransferase1(pmst1)，反应时间为8～10h。
如上所述的唾液酸乳糖糖苷和/或类似物的合成方法，包括如下步骤：
将唾液酸化乳糖和/或其类似物溶于dmf中，在氩气保护下，加入1～1.5当量的酸，1～1.5当量hobt、1～1.5当量edc、1.2～2.0当量三乙胺，室温搅拌12h；或者将唾液酸化乳糖和/或其类似物溶于无水甲醇，加入2.0～4.0当量三乙胺，1.5～3.0当量的1,3-苯并二茂磺酰氯、苯甲酰氯；或者将唾液酸化乳糖和/或其类似物溶于无水甲醇，加入1.0～3.0当量的三乙胺，1.0～3.0当量的氟乙酸乙酯；薄层色谱法检测反应完成后，旋蒸浓缩，快速硅胶柱得到系列唾液酸c5”-位衍生的唾液酸乳糖糖苷化合物，即得唾液酸乳糖糖苷和/或类似物。
而且，所述酸为对甲氧基苯甲酸、对氟苯甲酸、胡椒酸、苯并呋喃-6-羧酸、4-苯基苯甲酸或1-金刚烷酸；
或者，快速柱分离纯化时使用3：1的乙酸乙酯/甲醇。
如上所述的唾液酸乳糖糖苷和/或类似物在制备或作为神经氨酸酶抑制剂方面中的应用。
如上所述的唾液酸乳糖糖苷和/或类似物的合成方法在制备或作为神经氨酸酶抑制剂方面中的应用。
如上所述的唾液酸乳糖糖苷和/或类似物的合成方法在制备或作为神经氨酸酶抑制剂方面中的应用。
本发明取得的优点和积极效果为：
1、本发明将化学法的灵活性和酶法的高区域选择性及高效性相结合，可简捷、高效和快速得到了系列唾液酸乳糖苷及其类似物，为神经氨酸酶抑制剂的设计和制备筛选提供了有效的方法。
2.本发明将化学合成法的灵活性和酶法合成的高区域选择性和高效性相结合，简化了合成路线，而且具有反应条件温和、收率高及易于控制的优点，尤其是本合成中应用的三种酶均是细菌来源的酶，具有表达量高、底物适应性宽、可溶性表达和易于纯化的特点。解决了目前化学合成唾液酸糖苷所面临的底物反应活性低、合成步骤繁多、收率低等不足。
3.本发明在唾液酸c-5位进行修饰，合成了系列新颖化合物，对神经氨酸酶抑制剂类抗病毒药物的研制和开发具有重要意义。
附图说明
图1为本发明中化合物10在氘代甲醇中的核磁氢谱图；
图2为本发明中化合物10在氘代甲醇中的核磁碳谱图；
图3为本发明中化合物12在氘代甲醇中的核磁氢谱图；
图4为本发明中化合物12在氘代甲醇中的核磁碳谱图；
图5为本发明中化合物12在氘代甲醇中的核磁氟谱图；
图6为本发明中化合物15在氘代甲醇中的核磁氢谱图；
图7为本发明中化合物15在氘代甲醇中的核磁碳谱图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明，下属实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所用各物质质量均为常规使用质量。
一种唾液酸乳糖糖苷和/或类似物，其通式如下：
其中：
r1，选自氢原子、α-或β-构型丝氨酸残基、α-或β-苏氨酸残基、叠氮取代烷基、巯基取代烷基、α-或β-构型取代烷基；
r2，选自氟原子、氢原子、叠氮、羟基、氮乙酰基；
r3，选自氟原子、氢原子、乙酰基、羟基；
r4，选自氟原子、氢原子、乙酰基、羟基；
r5，选自氢原子、乙酰基、甲酰基、甲氧酰基、苯甲酰基、对氟苯甲酰基、对甲氧基苯甲酰基、对氯苯甲酰基、1,3-苯并二茂磺酰基、4-苯基苯甲酰基、氟乙酰基、丙酰基、氮乙酰基、氮丙酰基、氮三氟乙酰基、氮叠氮乙酰基；
r6，选自氟原子、氢原子、乙酰基、羟基。
较优地，其名称为：
化合物[2,3,4,6-四-o-乙酰基-β-d-吡喃半乳糖]-[1→4]-2,3,6-三-o-乙酰基-β-d-吡喃葡萄糖-三氯乙酰亚胺酯；
或者，为化合物(β-d-吡喃半乳糖)-(1→4)-3-叠氮丙基-β-d-吡喃葡萄糖；
或者，为化合物[5-n-神经氨酸]-(2→3)-(β-d-吡喃半乳糖)-(1→4)-3-叠氮丙基-β-d-吡喃葡萄糖
较优地，其结构式为如下中的一种：
如上所述的唾液酸乳糖糖苷和/或类似物的合成方法，包括如下步骤：
⑴选用通式ⅰ所示的乳糖受体和/或其类似物：
其中：
r1，选自氢原子、α-或β-构型丝氨酸残基、α-或β-苏氨酸残基、叠氮取代烷基、巯基取代烷基、α-或β-构型取代烷基、三氯乙酰亚胺酯；
r2，选自氟原子、氢原子、叠氮、羟基、氮乙酰基；
r3，选自氟原子、氢原子、乙酰基、羟基；
r4，选自氟原子、氢原子、乙酰基、羟基；
⑵利用对糖环羟基的保护和脱保护操作以及糖苷化反应将通式ⅰ所示的化合物引入叠氮链，然后脱除保护基；
将乳糖和/或其类似物与回流中的醋酐和醋酸钠溶液反应，即将羟基用乙酰基进行保护；之后在四氢呋喃和/或甲醇体系中，加入醋酸铵对酰化产物还原端的c1-位乙酰基团进行离去，得到中间体；然后在冰浴条件下，加入三氯乙腈和dbu，室温反应获得三氯乙酰亚胺酯；随后在3-氯-1-丙醇及三氟化硼乙醚条件下进行糖苷化反应，制备乳糖糖苷；然后，在四丁基氟化铵和叠氮基三甲基硅烷条件下，将氯原子置换成叠氮；最后在甲醇/甲醇钠的条件下将乙酰基脱去，得到乳糖受体和/或其类似物；
⑶利用一釜三酶法在通式ⅰ所示的化合物中引入唾液酸类似物；
将1.0当量的乳糖受体和/或其类似物、1.0～20.0当量的氮乙酰甘露糖和/或其类似物、1.0～10.0当量的丙酮酸钠、1.0～20.0当量的ctp即胞苷三磷酸、5.0～100mm的mgcl2和10～500mm、ph5.0～10.5的tris-hcl缓冲液配制水溶液，加入醛缩酶、cmp-唾液酸合成酶和α2,3唾液酸转移酶，从而实现一釜三酶法的唾液酸化；之后使用聚丙烯酰胺凝胶p2柱进行纯化，最终得到唾液酸化乳糖和/或其类似物，即得唾液酸乳糖糖苷和/或类似物。
较优地，所述步骤⑶中一釜三酶法反应时间为5分钟～30小时；一釜三酶法的反应温度为0～37℃，转速为0～240rpm；所述酶反应的停止方法是向反应中加入等体积的4℃无水乙醇并在4℃下培育0～30分钟；
或者，所述步骤⑶中一釜三酶法唾液酸化中用到的酶是细菌来源的醛缩酶pmaldolase、neisseriameningitidescmp-sialicacidsynthetase(nmcss)和pasteurellamultocidasialyltransferase1(pmst1)，反应时间为8～10h。
如上所述的唾液酸乳糖糖苷和/或类似物的合成方法，包括如下步骤：
将唾液酸化乳糖和/或其类似物溶于dmf中，在氩气保护下，加入1～1.5当量的酸，1～1.5当量hobt、1～1.5当量edc、1.2～2.0当量三乙胺，室温搅拌12h；或者将唾液酸化乳糖和/或其类似物溶于无水甲醇，加入2.0～4.0当量三乙胺，1.5～3.0当量的1,3-苯并二茂磺酰氯、苯甲酰氯；或者将唾液酸化乳糖和/或其类似物溶于无水甲醇，加入1.0～3.0当量的三乙胺，1.0～3.0当量的氟乙酸乙酯；薄层色谱法检测反应完成后，旋蒸浓缩，快速硅胶柱得到系列唾液酸c5”-位衍生的唾液酸乳糖糖苷化合物，即得唾液酸乳糖糖苷和/或类似物。
较优地，所述酸为对甲氧基苯甲酸、对氟苯甲酸、胡椒酸、苯并呋喃-6-羧酸、4-苯基苯甲酸或1-金刚烷酸；
或者，快速柱分离纯化时使用3：1的乙酸乙酯/甲醇。
如上所述的唾液酸乳糖糖苷和/或类似物在制备或作为神经氨酸酶抑制剂方面中的应用。
如上所述的唾液酸乳糖糖苷和/或类似物的合成方法在制备或作为神经氨酸酶抑制剂方面中的应用。
如上所述的唾液酸乳糖糖苷和/或类似物的合成方法在制备或作为神经氨酸酶抑制剂方面中的应用。
上述唾液酸乳糖糖苷及其类似物的化学酶法合成方法，包括以下步骤：
(1)选用通式ⅰ所示的乳糖受体和/或其类似物：
其中：
r1，选自氢原子、α-或β-构型丝氨酸残基、α-或β-苏氨酸残基、叠氮取代烷基、巯基取代烷基、α-或β-构型取代烷基；
r2，选自氟原子、氢原子、叠氮、羟基、氮乙酰基；
r3，选自氟原子、氢原子、乙酰基、羟基；
r4，选自氟原子、氢原子、乙酰基、羟基；
(2)利用“一釜三酶”法合成唾液酸化乳糖类似物，所述唾液酸采用唾液酸和/或其类似物，所述“一釜三酶”法唾液酸化中用到的三种酶分别指醛缩酶、cmp-唾液酸合成酶和α2,3唾液酸转移酶；
所述唾液酸化乳糖类似物的通式ⅱ为：
r1，选自氢原子、α-或β-构型丝氨酸残基、α-或β-苏氨酸残基、叠氮取代烷基、巯基取代烷基、α-或β-构型取代烷基；
r2，选自氟原子、氢原子、叠氮、羟基、、氮乙酰基；
r3，选自氟原子、氢原子、乙酰基、羟基；
r4，选自氟原子、氢原子、乙酰基、羟基；
r6，选自氟原子、氢原子、乙酰基、羟基；
(3)将通式ⅱ与有机酸或酰氯试剂进行缩合反应，合成一系列c5”-位修饰的唾液酸乳糖糖苷化合物：
r1，选自氢原子、α-或β-构型丝氨酸残基、α-或β-苏氨酸残基、叠氮取代烷基、巯基取代烷基、α-或β-构型取代烷基；
r2，选自氟原子、氢原子、叠氮、羟基、氮乙酰基；
r3，选自氟原子、氢原子、乙酰基、羟基；
r4，选自氟原子、氢原子、乙酰基、羟基；
r5，选自氢原子、乙酰基、甲酰基、甲氧酰基、苯甲酰基、对氟苯甲酰基、对甲氧基苯甲酰基、对氯苯甲酰基、1,3-苯并二茂磺酰基、4-苯基苯甲酰基、氟乙酰基、丙酰基、氮乙酰基、氮丙酰基、氮三氟乙酰基、氮叠氮乙酰基；
r6，选自氟原子、氢原子、乙酰基、羟基；
较优地，所述步骤(1)中的乳糖受体和/或其类似物i采用以下方法合成：
将乳糖和/或其类似物与回流中的醋酐和醋酸钠溶液反应，即将羟基用乙酰基进行保护；之后在四氢呋喃和/或甲醇体系中，加入醋酸铵对酰化产物还原端的c1-位乙酰基团进行离去，得到中间体；然后在冰浴条件下，加入三氯乙腈和dbu，室温反应获得三氯乙酰亚胺酯；随后在3-氯-1-丙醇及三氟化硼乙醚条件下进行糖苷化反应，得到含有1-氯丙基的乳糖糖苷；然后在四丁基氟化铵和叠氮基三甲基硅烷条件下将氯原子置换成叠氮；最后在甲醇及甲醇钠的条件下将乙酰基脱去，得到乳糖受体和/或其类似物。最终反应完成采用薄层色谱tlc(ea：ch3oh：h2o：hoac＝4：2：1：0.5)检测。
较优地，所述步骤(2)中的唾液酸化乳糖和/或其类似物的合成方法：
将1.0当量的乳糖受体和/或其类似物、1.0～20.0当量的氮乙酰甘露糖和/或其类似物、1.0～10.0当量的丙酮酸钠、1.0～20.0当量的ctp(胞苷三磷酸)、5.0～100mm的mgcl2和10～500mm、ph5.0～10.5的tris-hcl缓冲液配制水溶液，加入醛缩酶、cmp-唾液酸合成酶和α2,3唾液酸转移酶，从而实现“一釜三酶”法唾液酸化；之后使用聚丙烯酰胺凝胶柱p2进行纯化，最终得到唾液酸化乳糖和/或其类似物。
较优地，所述步骤(1)中乳糖受体和/或其类似物i采用以下方法合成：
将乳糖和/或其类似物分批加入到回流中的醋酐(10.0～50.0当量)和醋酸钠(1.0～10.0当量)的溶液中进行酰化反应，反应时长2～10h。之后将酰化后的产物溶解于四氢呋喃/甲醇(体积比1:1)体系中，加入醋酸铵(1.2～10.0当量)对酰化产物还原端的c1-位乙酰基团进行离去，得到中间体，然后将这个中间体溶于无水二氯甲烷中，冰浴条件下，加入三氯乙腈(2.0～30.0当量)和dbu(0.1～2.0当量)，室温搅拌2～12h，获得三氯乙酰亚胺酯中间体。取1.0当量三氯乙酰亚胺酯和1.2～10.0当量的3-氯-1-丙醇，加入到茄形瓶中，加入无水二氯甲烷作溶剂，取与反应物等质量的
较优地，所述步骤(2)中的唾液酸化乳糖和/或其类似物的合成方法：
取上步的乳糖受体和/或其类似物(1.0当量)、n-乙酰甘露糖和/或其类似物(1.0～20.0当量)、1.0～10.0当量的丙酮酸钠、ctp(胞苷三磷酸)(1.0～20.0当量)、mgcl2(5.0～100mm)和tris-hcl缓冲液(10～500mm，ph5.0～10.5)配制水溶液，加入醛缩酶、cmp-唾液酸合成酶(h.yuandx.chen,org.lett.,2006,8,2393-2396.；h.yu,h.a.chokhawala,s.huangandx.chen,nat.protoc.,2007,1,2485-2492)和一种唾液酸转移酶pmst1(h.yu,h.chokhawala,r.karpel,b.wu,j.zhang,y.zhang,q.jiaandx.chen,j.am.chem.soc.,2005,127,17618-17619)，跟踪监测反应，用茴香醛显色，反应完成后，加入等体积的甲醇溶液，在4℃环境下，静置半小时。随后将反应液在4℃，12000r/min条件下离心30分钟，收集浓缩上清液。最后用聚丙烯酰胺p2柱进行分离纯化，得到唾液酸化乳糖和/或其类似物。
较优地，所述步骤(3)唾液酸c5”-位进行衍生的唾液酸乳糖糖苷的合成方法：
将c5-氨基唾液酸化乳糖和/或其类似物(1.0当量)溶于dmf中，在氩气保护下，加入1～1.5当量的酸(对甲氧基苯甲酸、对氟苯甲酸、胡椒酸、苯并呋喃-6-羧酸、4-苯基苯甲酸、1-金刚烷酸等)，1～1.5当量hobt、1～1.5当量edc、1.2～2.0当量三乙胺，室温搅拌12h；或者将唾液酸化乳糖和/或其类似物(1.0当量)溶于无水甲醇，加入2.0～4.0当量三乙胺，1.5～3.0当量的1,3-苯并二茂磺酰氯、苯甲酰氯；或者将唾液酸化乳糖和/或其类似物溶于无水甲醇，加入1.0～3.0当量的三乙胺，1.0～3.0当量的氟乙酸乙酯；薄层色谱法检测反应完成后，旋蒸浓缩，快速硅胶柱得到系列唾液酸c5”-位衍生的唾液酸乳糖糖苷。
具体地，通过如下实施例来具体说明：
1、化学法合成乳糖受体和/或其类似物
乳糖受体和/或其类似物的合成：
反应式如下：
[2,3,4,6-四-o-乙酰基-β-d-吡喃半乳糖]-[1→4]-1,2,3,6-四-o-乙酰基-β-d-吡喃葡萄糖，即化合物2的制备：
将无水naoac(9.7g，4.0当量)加至250ml圆底烧瓶中，然后加入50ml醋酐，150℃加热回流，然后向回流液中分四次等量加入乳糖，即化合物1(10g，29.55mmol)，每次2.5g。反应混合液回流3h后，待冷却后减压蒸馏，然后加入乙酸乙酯/饱和碳酸氢钠溶液进行萃取，静置分层后收集有机相，重复三次，再用饱和氯化钠水溶液萃取三次，之后加入无水硫酸钠干燥，减压蒸馏，得到β-全乙酰化乳糖粗品，用硅胶柱层析分离纯化(pe：ea＝1：1)，得到化合物2(18.9g，95％)。
[2,3,4,6-四-o-乙酰基-β-d-吡喃半乳糖]-[1→4]-2,3,6-三-o-乙酰基-β-d-吡喃葡萄糖，即化合物3的制备：
取全乙酰化乳糖2(15g，22.23mmol)于250ml圆底烧瓶中，然后加入四氢呋喃/甲醇(体积比为1:1)50ml，充分搅拌溶解后，加入醋酸铵(6.86g，4.0当量)，室温搅拌过夜，薄层色谱tlc(pe：ea＝1:1)监测反应进度，直到原料全部转化为产物后，减压浓缩，用乙酸乙酯/水萃取，收集有机相，加入无水硫酸钠干燥，减压浓缩除去乙酸乙酯，利用硅胶柱层析进行分离纯化(pe：ea＝1：1)，得到化合物3(13.6g，96％)。
[2,3,4,6-四-o-乙酰基-β-d-吡喃半乳糖]-[1→4]-2,3,6-三-o-乙酰基-β-d-吡喃葡萄糖-三氯乙酰亚胺酯，即化合物4的制备：
取化合物3(10g，15.81mmol)溶于40ml无水二氯甲烷中，在氩气保护0℃条件下，加入三氯乙腈(7.92ml，5.0当量)和dbu(0.78ml，0.2当量)，然后将反应液移至室温下搅拌5h，薄层色谱tlc(pe：ea＝1：2)监测反应进度，待反应完成后，旋蒸浓缩反应液，然后利用硅胶柱层析进行分离纯化(pe：ea＝2：1)，最终得到淡黄色粉末三氯乙酰亚胺酯4(11.1g，91％)。
[2,3,4,6-四-o-乙酰基-β-d-吡喃半乳糖]-[1→4]-2,3,6-三-o-乙酰基-3-氯丙基-β-d-吡喃葡萄糖，即化合物5的制备：
取三氯乙酰亚胺酯4(500mg，0.64mmol)，3-氯-1-丙醇(0.22mmol，4.0当量)，2ml无水二氯甲烷以及活化的粉末状
[2,3,4,6-四-o-乙酰基-β-d-吡喃半乳糖]-[1→4]-2,3,6-三-o-乙酰基-3-叠氮丙基-β-d-吡喃葡萄糖，即化合物6的制备：
取化合物5(200mg，0.3mmol)，溶于2ml乙腈中，再加入叠氮基三甲基硅烷(148μl，4.0当量)和四丁基氟化铵(308μl，4.0当量)，之后将反应混合液移入60℃油浴中搅拌过夜后，减压浓缩除去乙腈，硅胶柱层析分离纯化(pe：ea＝1：1)得到白色固体产物，即化合物6(193mg，96％)。13cnmr(101mhz,cdcl3)δ170.19,，169.66，169.04，101.04，100.54，77.38，77.12，76.80，76.21，72.68，71.61，70.95，70.65，69.08，66.52，61.92，60.81，47.91，28.94
(β-d-吡喃半乳糖)-(1→4)-3-叠氮丙基-β-d-吡喃葡萄糖，即化合物7的制备：
取化合物6(1.0g，1.4mmol)溶于5ml无水甲醇中，加入甲醇钠直至调节ph为9～10，室温反应2h，利用薄层色谱tlc(ea：meoh：h2o：acoh＝4：2：1：0.5)检测反应进度，待反应完全后，用阳离子树脂中和反应体系至中性，过滤，浓缩，产物经过硅胶柱层析进行分离纯化(ea：meoh＝1：1)，得到白色固体，即化合物7(557mg，95％)。13cnmr(101mhz,d2o)δ102.93,102.13,78.40,75.35,74.77,74.37,72.81,72.52,70.95,68.55,67.36,61.03,60.09,47.88,28.25.
2、“一釜三酶”法合成唾液酸化乳糖及其类似物
反应式如下：
“一釜三酶”法合成唾液酸化乳糖及其类似物的一般操作方法：
向50ml离心管中，加入化合物galβ1-4glcβpron37(30～100mg，1.0当量)、n-乙酰甘露糖或氨基甘露糖盐酸盐(1.5当量)、丙酮酸钠(5.0当量)、ctp(1.5当量)、tris-hcl缓冲液(100mm，ph8.5)和氯化镁(20mm)，加双蒸水调节总体积为10ml，振动搅匀后加入酶aldolase(0.6～0.8mg)，nmcss(0.6～1.2mg)和pmst1(0.4～0.8mg)，在37℃、140rpm条件下反应过夜，薄层色谱(ea：meoh：h2o：acoh＝4：2：1：0.5，v/v)，跟踪检测反应，用茴香醛显色，反应完成后，加入等体积的甲醇溶液，在4℃环境下，静置半小时，随后将反应液在4℃、12000r/min条件下离心30分钟，收集浓缩上清液，最后利用聚丙烯酰胺凝胶柱p2进行分离纯化，得到唾液酸化乳糖8及其类似物9。化合物8：1hnmr(400mhz,d2o)δ4.50(dd，j＝16.8,7.9hz，2h),4.11(dd，j＝9.9，2.9hz,1h),3.98(m，j＝11.1，4.5hz,3h),3.92-3.68(m，8h),3.65(dd,j＝6.3，2.9hz,3h),3.62-3.54(m,4h),3.45(t,j＝6.7hz,2h),3.36-3.27(m，2h),2.75(dd,j＝12.4,4.5hz,1h),2.02(s,3h),1.91(m,j＝6.5hz,2h),1.79(t,j＝12.1hz，1h).化合物9：1hnmr(400mhz,d2o)δ4.51(dd，j＝14.4,7.8hz，2h),4.11(dd，j＝9.8，3.2hz,1h),4.04-3.95(m，4h),3.94-3.89(m，2h),3.86-3.55(m,12h),3.47(t,j＝6.7hz,2h),3.37-3.29(m,1h),3.25(t,j＝10.2hz,1h),2.82(dd,j＝12.5,4.7hz,1h),1.92(m,j＝6.5hz,2h),1.82(t,j＝12.2hz,2h).13cnmr(101mhz,d2o)δ173.40,102.65,102.16,99.75,78.33,75.55,75.13,74.78,74.38,72.83,71.59,69.36,67.79,67.39,67.25,66.87,62.23,61.02,60.13,52.19,47.90,39.87,28.26.
3、系列c5”-位衍生的唾液酸乳糖糖苷的合成方法
(1)缩合反应
将化合物9(10～50mg)溶于dmf中，在氩气保护条件下，加入对甲氧基苯甲酸、对氟苯甲酸、胡椒酸、苯并呋喃-6-羧酸、4-苯基苯甲酸、1-金刚烷酸等酸(1～1.5当量)，hobt(1～1.5当量)，edc(1～1.5当量)，三乙胺(1.2～2.0当量)，室温搅拌12h。或者将唾液酸化乳糖和/或其类似物8溶于无水甲醇，加入2.0～4.0当量三乙胺，1.5～3.0当量的1,3-苯并二茂磺酰氯、苯甲酰氯，薄层色谱法检测反应完成后，旋蒸浓缩反应液，快速硅胶柱(乙酸乙酯：甲醇3:1)得到化合物10～16。
以下为通过缩合反应获得的化合物10～16的收率及结构信息：
[5-n-金刚烷酰胺基-3,5-二-脱氧-d-神经氨酸]-(2→3)-(β-d-吡喃半乳糖)-(1→4)-3-叠氮丙基-β-d-吡喃葡萄糖(10)
收率83％。1hnmr(400mhz,cd3od)δ4.46(d,j＝7.8hz,1h),4.31(t,j＝8.1hz,1h),4.05(t,j＝12.3hz,1h),4.02–3.84(m,7h),3.84–3.51(m,11h),3.51–3.40(m,4h),3.39–3.25(m,4h),2.87(dd,j＝8.5hz,1h),2.11–2.00(m,4h),1.97–1.87(m,8h),1.79(s,6h),1.31(s,4h).13cnmr(101mhz,cd3od)δ181.85,103.67,102.91,99.87,79.49,76.13,75.51,74.95,73.40,71.50,68.32,66.28,62.88,61.35,60.57,52.60,48.48,48.27,47.63,47.42,47.20,46.99,40.78,38.67,36.18,31.67,29.34,28.85,28.24.
[5-n-(3,4-亚甲二氧基苯甲酰基)-3,5-二-脱氧-d-神经氨酸]-(2→3)-(β-d-吡喃半乳糖)-(1→4)-3-叠氮丙基-β-d-吡喃葡萄糖(11)
收率57％。1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.53(d,j＝8.0hz,1h),7.41(s,1h),6.88(d,j＝8.0hz,1h),6.03(s,2h),4.43(d,j＝8.0hz,2h),4.30(d,j＝7.7hz,1h),4.18–3.83(m,9h),3.85–3.51(m,15h),3.45(t,j＝6.7hz,4h),2.86(dd,1h,3eq”),1.87(dt,j＝12.4,6.2hz,3h),1.29(s,4h).13cnmr(101mhz,cd3od)δ172.22,150.89,147.91,135.09,127.83,122.71,107.49,103.71,102.94,101.88,96.32,79.62,78.26,75.31,75.31,73.30,67.61,66.93,61.35,60.60,53.41,48.24,48.03,47.82,47.60,47.39,47.18,46.97,38.74,31.75,29.10,29.10.
[5-n-对氟苯甲酰基-3,5-二-脱氧-d-神经氨酸]–(2→3)-(β-d-吡喃半乳糖)-(1→4)-3-叠氮丙基-β-d-吡喃葡萄糖(12)
收率87％。1hnmr(400mhz,cd3od)δ8.01(dd,j＝8.4,5.4hz,2h),7.18(t,j＝8.7hz,2h),4.42(d,j＝7.7hz,1h),4.28(t,j＝8.9hz,1h),4.09–4.02(m,1h),4.01–3.75(m,9h),3.69–3.50(m,7h),3.43(dd,j＝15.4,8.6hz,3h),3.33–3.28(m,4h),3.24(t,j＝8.3hz,1h),2.92(dd,j＝11.3hz,1h,3eq”),1.86(dd,j＝12.9,6.4hz,2h),1.31–1.25(m,2h).13cnmr(101mhz,cd3od)δ169.30,166.23,163.74,130.15,130.11,115.05,114.83,103.65,102.91,99.69,79.46,76.21,75.56,74.99,73.30,71.50,69.50,68.61,67.72,66.26,62.57,61.38,60.57,53.27,40.68,29.34,28.84.19fnmr(376mhz,cd3od)δ-110.14.
[5-n-对甲氧基苯甲酰基-3,5-二-脱氧-d-神经氨酸]-(2→3)-(β-d-吡喃半乳糖)-(1→4)-3-叠氮丙基-β-d-吡喃葡萄糖(13)
收率83％。1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.91(d,j＝8.3hz,2h),6.99(d,j＝8.4hz,2h),4.46(d,j＝7.6hz,1h),4.31(d,j＝7.6hz,1h),4.08(t,j＝13.3hz,1h),3.95(dd,j＝14.0,8.3hz,5h),3.89–3.77(m,5h),3.73–3.52(m,7h),3.50–3.40(m,2h),2.94(dd,j＝11.2hz,1h,3eq”),1.88(dd,j＝13.0,6.5hz,2h),1.30(s,3h).
[5-n-(4-苯基苯甲酰基)-3,5-二-脱氧-d-神经氨酸]–(2→3)-(β-d-吡喃半乳糖)-(1→4)-3-叠氮丙基-β-d-吡喃葡萄糖(14)
收率73％。1hnmr(400mhz,cd3od)δ8.04(d,j＝8.2hz,2h),7.73(dd,j＝5.7,3.1hz,2h),7.68(d,j＝7.4hz,2h),7.65–7.61(m,1h),7.47(t,j＝7.5hz,2h),7.39(t,j＝7.3hz,1h),4.45(d,j＝7.8hz,1h),4.30(dd,j＝7.4,5.5hz,2h),4.14–4.01(m,3h),3.94(dt,j＝15.6,8.3hz,7h),3.76(dd,j＝12.7,8.9hz,1h),3.72–3.53(m,9h),3.45(dd,j＝15.2,8.3hz,3h),3.26(t,j＝8.3hz,1h),2.96(dd,j＝10.5hz,1h,3eq”),1.88(dt,j＝12.9,6.5hz,3h),1.76–1.70(m,2h).13cnmr(101mhz,cd3od)δ173.81,170.26,167.92,144.51,139.77,132.19,130.96,128.55,128.47,128.08,127.74,126.74,126.55,103.66,102.91,99.73,79.47,76.23,75.60,75.04,74.93,73.31,71.57,69.50,68.70,67.75,66.24,65.26,61.42,60.58,53.27,30.31,29.38,28.84,18.86.
[5-n-(苯并呋喃-6-酰胺基)-3,5-二-脱氧-d-神经氨酸]–(2→3)-(β-d-吡喃半乳糖)-(1→4)-3-叠氮丙基-β-d-吡喃葡萄糖(15)
收率79％。1hnmr(400mhz,cd3od)δ8.15(s,1h),7.93–7.85(m,2h),7.68(d,j＝8.2hz,1h),6.91(s,1h),4.42(d,j＝7.8hz,1h),4.29(d,j＝7.8hz,1h),4.11–3.99(m,4h),3.98–3.82(m,7h),3.77(dd,j＝12.3,8.7hz,1h),3.70–3.49(m,9h),3.43(dd,j＝14.9,8.1hz,3h),3.34(d,j＝7.1hz,1h),3.24(t,j＝8.3hz,1h),2.95(dd,j＝11.1hz,1h,3eq”),1.90–1.82(m,3h),1.32–1.25(m,1h).13cnmr(101mhz,cd3od)δ170.49,167.92,154.49,147.89,132.17,130.94,129.70,128.48,122.20,120.65,110.74,106.36,103.66,102.89,99.80,79.50,76.25,75.55,75.03,73.32,71.53,69.48,68.61,67.77,66.26,65.26,62.48,61.39,60.59,53.39,31.68,30.32,28.85,18.86.
[5-n-苯甲酰基-3,5-二-脱氧-d-神经氨酸]–(2→3)-(β-d-吡喃半乳糖)-(1→4)-3-叠氮丙基-β-d-吡喃葡萄糖(16)
收率75％。1hnmr(400mhz,cd3od)δ7.81(dd,j＝8.4,5.4hz,2h),7.18(t,j＝8.7hz,2h),4.52(d,j＝7.7hz,1h),4.26(t,j＝8.9hz,1h),4.05(m,1h),4.79(m,9h),3.69–3.50(m,7h),3.43(dd,j＝15.4,8.6hz,3h),3.33–3.28(m,4h),3.24(t,j＝8.3hz,1h),2.85(dd,j＝11.3hz,1h,3eq”),1.86(dd,j＝12.9,6.4hz,2h),1.37(m,3h).
(2)氨解反应
将唾液酸化乳糖和/或其类似物9溶于无水甲醇，加入1.0～3.0当量的三乙胺，1.0～3.0当量的氟乙酸乙酯，薄层色谱法检测反应完成后，旋蒸浓缩，快速硅胶柱(乙酸乙酯：甲醇3：1)得到化合物17。
以下为通过酯的氨解反应获得的化合物17的收率及结构信息：
[5-n-氟乙酰基-3,5-二-脱氧-d-神经氨酸]–(2→3)-(β-d-吡喃半乳糖)-(1→4)-3-叠氮丙基-β-d-吡喃葡萄糖(17)
收率57％。1hnmr(400mhz,cd3od)δ4.42(t,j＝11.7hz,1h),4.30(d,j＝7.8hz,1h),4.05(d,j＝8.8hz,1h),4.02–3.74(m,10h),3.72–3.51(m,8h),3.45(t,j＝6.8hz,3h),3.34(d,j＝6.3hz,1h),3.30–3.22(m,4h),2.82(dd,j＝10.2hz,1h,3eq”),1.87(dt,j＝12.9,6.5hz,2h),1.29(d,j＝3.3hz,6h).13cnmr(101mhz,cd3od)δ170.89,103.64,102.90,99.95,80.51,79.49,78.69,76.14,75.42,75.02,74.88,73.33,72.99,71.76,69.38,68.39,68.07,67.62,66.26,62.61,61.30,60.57,52.15,40.10,31.67,29.35,28.85,22.34.19fnmr(376mhz,d2o)δ-75.57.
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。
1.一种唾液酸乳糖糖苷和/或类似物，其特征在于：其通式如下：
其中：
r1，选自氢原子、α-或β-构型丝氨酸残基、α-或β-苏氨酸残基、叠氮取代烷基、巯基取代烷基、α-或β-构型取代烷基；
r2，选自氟原子、氢原子、叠氮、羟基、氮乙酰基；
r3，选自氟原子、氢原子、乙酰基、羟基；
r4，选自氟原子、氢原子、乙酰基、羟基；
r5，选自氢原子、乙酰基、甲酰基、甲氧酰基、苯甲酰基、对氟苯甲酰基、对甲氧基苯甲酰基、对氯苯甲酰基、1,3-苯并二茂磺酰基、4-苯基苯甲酰基、氟乙酰基、丙酰基、氮乙酰基、氮丙酰基、氮三氟乙酰基、氮叠氮乙酰基；
r6，选自氟原子、氢原子、乙酰基、羟基。
2.根据权利要求1所述的唾液酸乳糖糖苷和/或类似物，其特征在于：其名称为
化合物[2,3,4,6-四-o-乙酰基-β-d-吡喃半乳糖]-[1→4]-2,3,6-三-o-乙酰基-β-d-吡喃葡萄糖-三氯乙酰亚胺酯；
或者，为化合物(β-d-吡喃半乳糖)-(1→4)-3-叠氮丙基-β-d-吡喃葡萄糖；
或者，为化合物[5-n-神经氨酸]-(2→3)-(β-d-吡喃半乳糖)-(1→4)-3-叠氮丙基-β-d-吡喃葡萄糖。
3.根据权利要求1所述的唾液酸乳糖糖苷和/或类似物，其特征在于：其结构式为如下中的一种：
4.如权利要求1至3任一项所述的唾液酸乳糖糖苷和/或类似物的合成方法，其特征在于：包括如下步骤：
⑴选用通式ⅰ所示的乳糖受体和/或其类似物：
其中：
r1，选自氢原子、α-或β-构型丝氨酸残基、α-或β-苏氨酸残基、叠氮取代烷基、巯基取代烷基、α-或β-构型取代烷基、三氯乙酰亚胺酯；
r2，选自氟原子、氢原子、叠氮、羟基、氮乙酰基；
r3，选自氟原子、氢原子、乙酰基、羟基；
r4，选自氟原子、氢原子、乙酰基、羟基；
⑵利用对糖环羟基的保护和脱保护操作以及糖苷化反应将通式ⅰ所示的化合物引入叠氮链，然后脱除保护基；
将乳糖和/或其类似物与回流中的醋酐和醋酸钠溶液反应，即将羟基用乙酰基进行保护；之后在四氢呋喃和/或甲醇体系中，加入醋酸铵对酰化产物还原端的c1-位乙酰基团进行离去，得到中间体；然后在冰浴条件下，加入三氯乙腈和dbu，室温反应获得三氯乙酰亚胺酯；随后在3-氯-1-丙醇及三氟化硼乙醚条件下进行糖苷化反应，制备乳糖糖苷；然后，在四丁基氟化铵和叠氮基三甲基硅烷条件下，将氯原子置换成叠氮；最后在甲醇/甲醇钠的条件下将乙酰基脱去，得到乳糖受体和/或其类似物；
⑶利用一釜三酶法在通式ⅰ所示的化合物中引入唾液酸类似物；
将1.0当量的乳糖受体和/或其类似物、1.0～20.0当量的氮乙酰甘露糖和/或其类似物、1.0～10.0当量的丙酮酸钠、1.0～20.0当量的ctp即胞苷三磷酸、5.0～100mm的mgcl2和10～500mm、ph5.0～10.5的tris-hcl缓冲液配制水溶液，加入醛缩酶、cmp-唾液酸合成酶和α2,3唾液酸转移酶，从而实现一釜三酶法的唾液酸化；之后使用聚丙烯酰胺凝胶p2柱进行纯化，最终得到唾液酸化乳糖和/或其类似物，即得唾液酸乳糖糖苷和/或类似物。
5.根据权利要求4所述的唾液酸乳糖糖苷和/或类似物的合成方法，其特征在于：所述步骤⑶中一釜三酶法反应时间为5分钟～30小时；一釜三酶法的反应温度为0～37℃，转速为0～240rpm；所述酶反应的停止方法是向反应中加入等体积的4℃无水乙醇并在4℃下培育0～30分钟；
或者，所述步骤⑶中一釜三酶法唾液酸化中用到的酶是细菌来源的醛缩酶pmaldolase、neisseriameningitidescmp-sialicacidsynthetase和pasteurellamultocidasialyltransferase1，反应时间为8～10h。
6.如权利要求1至3任一项所述的唾液酸乳糖糖苷和/或类似物的合成方法，其特征在于：包括如下步骤：
将唾液酸化乳糖和/或其类似物溶于dmf中，在氩气保护下，加入1～1.5当量的酸，1～1.5当量hobt、1～1.5当量edc、1.2～2.0当量三乙胺，室温搅拌12h；或者将唾液酸化乳糖和/或其类似物溶于无水甲醇，加入2.0～4.0当量三乙胺，1.5～3.0当量的1,3-苯并二茂磺酰氯、苯甲酰氯；或者将唾液酸化乳糖和/或其类似物溶于无水甲醇，加入1.0～3.0当量的三乙胺，1.0～3.0当量的氟乙酸乙酯；薄层色谱法检测反应完成后，旋蒸浓缩，快速硅胶柱得到系列唾液酸c5”-位衍生的唾液酸乳糖糖苷化合物，即得唾液酸乳糖糖苷和/或类似物。
7.根据权利要求7所述的唾液酸乳糖糖苷和/或类似物的合成方法，其特征在于：所述酸为对甲氧基苯甲酸、对氟苯甲酸、胡椒酸、苯并呋喃-6-羧酸、4-苯基苯甲酸或1-金刚烷酸；
或者，快速柱分离纯化时使用3：1的乙酸乙酯/甲醇。
8.如权利要求1至3任一项所述的唾液酸乳糖糖苷和/或类似物在制备或作为神经氨酸酶抑制剂方面中的应用。
9.如权利要求4或5所述的唾液酸乳糖糖苷和/或类似物的合成方法在制备或作为神经氨酸酶抑制剂方面中的应用。
10.如权利要求6所述的唾液酸乳糖糖苷和/或类似物的合成方法在制备或作为神经氨酸酶抑制剂方面中的应用。
技术总结