本发明涉及中药活性成分的分离提纯技术领域，尤其涉及一种米杨噎苷a和b单体的分离纯化方法。
背景技术：
米杨噎(streblustonkinensis)属于桑科(moraceae)鹊肾树属(strebluslour.)属植物。鹊肾树属(strebluslour.)属于桑科(moraceae)植物。米杨噎常作为民间药用植物用于治疗疾病。经文献调研，到目前为止对米杨噎的化学成分及其生物活性的研究未见报道。基于米杨噎作为民间常用药用植物，为了更好的深入研究其中的成分，开发和利用该植物，寻找一种更好的提取率高、成本低和易于工业化生产的米杨噎苷a和b分离纯化工艺，能为米杨噎的特征生物活性研究奠定基础，为构效关系的研究提供前提。
技术实现要素：
针对目前还没有对米杨噎苷单体的分离纯化的问题，本发明提供一种米杨噎苷a和b单体的分离纯化方法。这种方法能有效除去米杨噎中的大量杂质，一次性可获取两个米杨噎苷，从而可为米杨噎苷类化合物的活性研究和单一成分的新药开发提供物质基础。
实现本发明目的的技术方案是：
一种米杨噎苷a和b单体的分离纯化方法，包括如下步骤：
1)将米杨噎叶用10-15个质量比的65-75％乙醇水溶液提取，回收提取液的乙醇后，余下的水部分用10倍蒸馏水稀释，得到米杨噎叶粗提物水溶液；
2)将步骤1)得到的粗提物水溶液进行d101型大孔吸附树脂柱层析，充分吸附后，用4-6个柱体积蒸馏水冲洗，去除未被吸附的杂质，再依次用各4-6个柱体积的20％-35％乙醇水溶液洗脱，弃去洗脱液，然后以4-6体积的38-45％乙醇水溶液洗脱，浓缩洗脱液，得到富含米杨噎苷a和b的洗脱部分；
3)用甲醇溶解步骤2)38％-45％乙醇水溶液洗脱部分样品，然后进行硅胶色谱柱层析，依次各用4-6个柱体积的3％-10％的二氯甲烷与体积比为97％-90％的甲醇混合液作为洗脱剂进行洗脱，弃去3％-5％的二氯甲烷与97％-95％的甲醇混合液洗脱液，收集10％的二氯甲烷与90％的甲醇混合液洗脱物；
4)将步骤3)中收集的10％的二氯甲烷与90％的甲醇混合液洗脱物进行高效液相色谱c18柱层析，获得米杨噎苷a和b，它们都是新的化合物，其结构式分别如下式所示：
步骤1)中所述的米杨噎叶的提取物由如下方法制得：将米杨噎叶粉碎、加入叶10-15倍质量的浓度为65-75％的乙醇水溶液，加热回流提取2-3次，减压浓缩、干燥，得米杨噎叶的提取物，这种提取方法可以将米杨噎叶中的大量杂质去除，确保提取物中主要含有苷、黄酮等成分。
步骤2)中所述的大孔树脂为聚苯乙烯树脂型大孔树脂。
步骤2)中所述大孔树脂的型号为d101，优选的大孔树脂吸附量大，洗脱容易，吸附动力学性能良好，对糖类、蛋白、无机酸、盐、碱、小分子亲水性有机物均不吸附，因而可将一般苷类物质与这些物质分离，在较短的时间内取得较好的分离效果。
步骤3)中所述硅胶色谱柱为正相硅胶色谱柱。
步骤3)中所述的纯化过程为：将步骤2)中38％-45％的乙醇水溶液洗脱、富含米杨噎苷a和b的样品用少量甲醇溶解，然后进行硅胶柱层析，依次用4-6个柱体积的3％-10％的二氯甲烷与97％-90％的甲醇混合液作为洗脱剂进行梯度洗脱。
步骤4)中所述的高效液相色谱的色谱柱为反相十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，规格为20×250mm，其填料的粒径为5.0μm，能够在较高的温度和较低的ph条件下使用，固定相不会发生相塌陷现象，可以长时间保持柱效，延长柱寿命。
高效液相色谱的检测条件为：
固定相：十八烷基硅烷基键合硅胶为填料的色谱柱；
检测波长：230nm；
流速：2.0～4.0ml/min；
柱温：25～35℃；
流动相：水为流动相a为85～80％，甲醇为流动相b为15～20％，洗脱，流动相a与流动相b的比例为体积比，在高效液相色谱分离准备过程中，色谱条件的选择非常重要，它直接影响物质色谱峰的保留时间、分离度等；色谱条件主要包括色谱柱(包括填料、柱长、柱温等)、流动相(包括成分、流速等)、检测器及检测波长、柱温等，本技术方案中的色谱条件，可使物质色谱峰的保留时间、峰形、分离效果等达到最佳化，实现了米杨噎苷单体的高效分离。
步骤4)中所述的将步骤3)中收集的10％的二氯甲烷与90％的甲醇混合液洗脱物进行高效液相色谱c18柱层析纯化过程为：将10％的二氯甲烷与90％的甲醇混合液洗脱物加入反相c18硅胶色谱柱中，用体积浓度为15-20％甲醇水溶液洗脱，分别得到米杨噎苷a和b单体化合物。
本技术方案中的米杨噎为桑科鹊肾树属属植物，药材部位为干燥叶。
米杨噎中除含有米杨噎苷外，还含有黄酮类、生物碱类、糖类、微量元素等非常复杂的成分，较难实现米杨噎苷与其他物质的分离，且米杨噎苷的含量很低，结构及理化性质很相似，很难通过简单的分离方法一次获得多个米杨噎苷的单体。
本技术方案中的米杨噎苷单体分离纯化的方法，针对米杨噎中存在的各组分的理化性质，能有效除去米杨噎中的大量杂质，获得纯度较高的米杨噎苷单体，可以实现米杨噎苷的目标制备，一次性可获取多个的已知活性的米杨噎苷，同时富集分离微量苷类，从而可以不断丰富苷类库，为苷类化合物的活性研究和单一成分的新药开发提供物质基础。
这种方法能有效除去米杨噎中的大量杂质，一次性可获取两个米杨噎苷，从而可为米杨噎苷类化合物的活性研究和单一成分的新药开发提供物质基础。
附图说明
图1为实施例中米杨噎苷a和b反相c18硅胶柱层析制备色谱图；
图2为实施例中米杨噎苷a的1hnmr谱图；
图3为实施例中米杨噎苷a的13cnmr谱图；
图4为实施例中米杨噎苷b的1hnmr谱图；
图5为实施例中米杨噎苷b的13cnmr谱图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的内容作进一步的阐述，但不是对本发明的限定。
实施例1：
一种米杨噎苷a和b单体的分离纯化方法，包括如下步骤：
1)取10kg干燥的米杨噎叶，加入10倍的原料质量比65％乙醇水溶液(体积比)，依次加热回流提取3次，时间为3小时、2小时、2小时，合并滤液，减压回收乙醇，得浸膏；
2)将步骤1)的浸膏用蒸馏水稀释50倍，经d101大孔吸附树脂色谱柱吸附，用4个柱体积蒸馏水洗冲洗，去除未被吸附的杂质，再依次用各4个柱体积的10％乙醇水溶液和30％乙醇水溶液洗脱，弃去洗脱液，然后以40％乙醇水溶液洗脱，浓缩洗脱液，得到富含米杨噎苷a和b的洗脱部分；
3)取步骤2)中所获得的40％乙醇洗脱物，经硅胶柱层析，依次各用4个柱体积的3％的二氯甲烷与97％的甲醇混合液、10％的二氯甲烷与90％的甲醇混合液(体积比)洗脱，弃去3％的二氯甲烷与97％的甲醇混合液(体积比)洗脱液，收集10％的二氯甲烷与90％的甲醇混合液洗脱物；
4)将步骤3)收集10％的二氯甲烷与90％的甲醇混合液洗脱物经过反相c18硅胶柱层析，以水-甲醇(80:20)为洗脱剂进行洗脱，得到第一化合物a(tr＝21.80min)和第二化合物b(tr＝26.45min)。
步骤4)中，高效液相色谱进行检测监控的条件为：
固定相：十八烷基硅烷基键合硅胶为填料的色谱柱；
检测器：紫外检测器；
检测波长：230nm；
流速：3.0ml/min；
柱温：25℃；
流动相：水为流动相a为80％，甲醇为流动相b为20％。
利用上述检测条件对得到的第一单体化合物a、第二单体化合物b进行检测，第一单体化合物a的纯度为99.5％，第二单体化合物b的纯度为99.7％。
实施例2:
一种米杨噎苷a和b单体的分离纯化方法，包括如下步骤：
1)取10kg干燥的米杨噎叶，加入12倍的73％乙醇水溶液(原料质量比)，依次加热回流提取3次，时间为3小时、2小时、2小时，合并滤液，减压回收乙醇，得浸膏；
2)取浸膏悬浮于50l水中，经d101大孔吸附树脂色谱柱吸附，用水清洗，然后用20％、50％乙醇洗脱，分别得到20％、50％乙醇洗脱物，50％乙醇洗脱物作为富含米杨噎苷a和b的米杨噎叶提取物；
3)取上述步骤2)中所获得的50％乙醇洗脱物625.0g，经硅胶柱层析，依次各用4个柱体积的4％的二氯甲烷与96％的甲醇混合液、10％的二氯甲烷与90％的甲醇混合液、(体积比)洗脱，弃去4％的二氯甲烷与96％的甲醇混合液洗脱液，收集10％的二氯甲烷与90％的甲醇混合液洗脱物；
4)将步骤3)收集10％的二氯甲烷与90％的甲醇混合液洗脱物经过反相c18硅胶柱层析，以水-甲醇(80:20)为洗脱剂进行洗脱，得到第一化合物a(tr＝21.82min)和第二化合物b(tr＝26.43min)。
步骤4)中，高效液相色谱的检测监控的条件与实施例1相同，不同的是流速为3.5ml/min，柱温为30℃。
利用上述检测条件对得到的第一单体化合物a、第二单体化合物b进行检测，第一单体化合物a的纯度为99.2％，第二单体化合物b的纯度为99.4％。
实施例3：
一种米杨噎苷a和b单体的分离纯化方法，包括如下步骤：
1)取10kg干燥的米杨噎叶，加入15倍的75％乙醇水溶液(原料质量比)，依次加热回流提取3次，时间为3小时、2小时、2小时，合并滤液，减压回收乙醇，得浸膏；
2)取步骤1)的浸膏悬浮于50l水中，经d101大孔吸附树脂色谱柱吸附，用水清洗，然后用20％、50％乙醇洗脱，分别得到20％、50％乙醇洗脱物，50％乙醇洗脱物作为富含米杨噎苷a和b的米杨噎叶提取物；
3)取上述步骤2)中所获得的50％乙醇洗脱物，经硅胶柱层析，依次各用4个柱体积的5％的二氯甲烷与95％的甲醇混合液、10％的二氯甲烷与90％的甲醇混合液、(体积比)，弃去5％的二氯甲烷与95％的甲醇混合液洗脱液，收集10％的二氯甲烷与90％的甲醇混合液洗脱物；
4)将步骤3)收集的10％的二氯甲烷与90％的甲醇混合液洗脱物经过反相c18硅胶柱层析，以水-甲醇(80:20)为洗脱剂进行洗脱，得到第一化合物a(tr＝21.81min)和第二化合物b(tr＝26.44min)。
步骤4)中，高效液相色谱的检测监控的条件与实施例1相同，不同的是流速为4.0ml/min，柱温为35℃。
利用上述检测条件对得到的第一单体化合物a、第二单体化合物b进行检测，第一单体化合物a的纯度为99.6％，第二单体化合物b的纯度为99.8％。
如图1、图2、图3、图4、图5所示，将得到的两个单体化合物经红外、质谱、核磁共振谱(1hnmr、13cnmr、dept、1h-1hcosy、hsqc、hmbc、roesy)、质谱(ms)和旋光度等光谱技术，鉴定了米杨噎苷a和b的结构，它们都是新化合物,米杨噎苷a和b的理化数据如下所示：
米杨噎苷a[4-(3-hydroxy-but-1-enyl)-3,4-dimethyl-2-(3,4,5-trihydroxy-6-hydroxymethyl-tetrahydro-pyran-2-yloxymethyl)-cyclohex-2-enone，streglycosidea]：无色油状物，溶于甲醇。hresims(positive)m/z:387.2012[m h] ,(calc.forc19h31o8,387.2019)；
米杨噎苷b[2-(4-p-tolyl-pentyloxy)-tetrahydro-pyran-3,4,5-triol，streglycosideb]：无色针状晶体，溶于甲醇。hresimsm/z355.1766[m hcoo]-(calcdforc18h27o7,355.1780).
1.一种米杨噎苷a和b单体的分离纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将米杨噎叶用10-15个质量比的65-75％乙醇水溶液提取，回收提取液的乙醇后，余下的水部分用10倍蒸馏水稀释，得到米杨噎叶粗提物水溶液；
2)将步骤1)得到的粗提物水溶液进行d101型大孔吸附树脂柱层析，充分吸附后，用4-6个柱体积蒸馏水冲洗，去除未被吸附的杂质，再依次用各4-6个柱体积的20％-35％乙醇水溶液洗脱，弃去洗脱液，然后以4-6个柱体积的38-45％乙醇水溶液洗脱，浓缩洗脱液，得到富含米杨噎苷a和b的洗脱部分；
3)用甲醇溶解步骤2)38％-45％乙醇水溶液洗脱部分样品，然后进行硅胶色谱柱层析，依次用各4-6个柱体积的3％-10％的二氯甲烷与97％-90％的甲醇混合液作为洗脱剂进行洗脱，弃去3％-5％的二氯甲烷与97％-95％的甲醇混合液洗脱液，收集10％的二氯甲烷与90％的甲醇混合液洗脱物；
4)将步骤3)中收集的10％的二氯甲烷与90％的甲醇混合液洗脱物进行高效液相色谱c18柱层析，获得米杨噎苷a和b，它们都是新的化合物，其结构式分别如下式所示：
2.根据权利要求1所述的米杨噎苷a和b单体的分离纯化方法，其特征在于，步骤1)中所述的米杨噎叶的提取物由如下方法制得：将米杨噎叶粉碎、加入叶10-15倍质量的浓度为65-75％的乙醇水溶液，加热回流提取2-3次，减压浓缩、干燥，得米杨噎叶的提取物。
3.根据权利要求1所述的米杨噎苷a和b单体的分离纯化方法，其特征在于，步骤2)中所述的大孔树脂为聚苯乙烯树脂型大孔树脂。
4.根据权利要求3所述的米杨噎苷a和b单体的分离纯化方法，其特征在于，步骤2)中所述大孔树脂的型号为d101。
5.根据权利要求1所述的米杨噎苷a和b单体的分离纯化方法，其特征在于，步骤3)中所述硅胶色谱柱为正相硅胶色谱柱。
6.根据权利要求1所述的米杨噎苷a和b单体的分离纯化方法，其特征在于，步骤3)中所述的纯化过程为：将步骤2)中38％-45％的乙醇水溶液洗脱、富含米杨噎苷a和b的样品用少量甲醇溶解，然后进行硅胶柱层析，依次用4-6个柱体积的3％-10％的二氯甲烷与97％-90％的甲醇混合液作为洗脱剂进行梯度洗脱。
7.根据权利要求1所述的米杨噎苷a和b单体的分离纯化方法，其特征在于，步骤4)中所述的高效液相色谱的色谱柱为反相十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，规格为20×250mm，其填料的粒径为5.0μm。
8.根据权利要求1所述的米杨噎苷a和b单体的分离纯化方法，其特征在于，步骤4)中所述的将步骤3)中收集的10％的二氯甲烷与90％的甲醇混合液洗脱物进行高效液相色谱c18柱层析纯化过程为：将10％的二氯甲烷与90％的甲醇混合液洗脱物加入反相c18硅胶色谱柱中，用体积浓度为15-20％甲醇水溶液洗脱，分别得到米杨噎苷a和b单体化合物。
技术总结