(一)技术领域
本发明涉及一种一步双水相萃取同时制备高纯度栀子苷、栀子黄的方法。
(二)
背景技术：
栀子是茜草科(rubiaceae)栀子属(gardenia)植物，是卫生部颁布的第一批药食两用资源。栀子为常绿灌木，广泛分布于亚热带地区，全世界约有250种，我国主要有栀子(gardeniajasminoidesellis)、匙叶栀子、狭叶栀子和海南栀子4个品种，分布余浙江、江西、安徽、台湾等地区。桅子苷、栀子黄为栀子最典型的两种活性成分，分别占桅子果实的12％、15％以上。栀子黄广泛用作传统中药和天然食用色素，栀子苷是栀子的主要药效物质基础之一，具有解热镇痛、抗脑缺血损伤、保肝利胆、抗炎、改善睡眠等功效。近年来栀子全干果价格偏低，经济效益大幅度下滑，因此，栀子综合加工利用的重要性日益凸显。
目前，国内外学者采用硅胶柱层析、大孔树脂和高速逆流等技术对栀子苷、栀子黄分离纯化进行了大量研究。硅胶柱层析法为正相色谱法，且栀子苷与栀子黄极性大，故不可逆吸附高，回收率低，需进行反复柱层析才能获得较高纯度单体，且分离重现性较低。大孔树脂法预处理难度大，有机残留物高，回收率低，其产品的安全问题亦不容忽视。高速逆流分离法虽也有一些报道，但有机溶剂消耗量大，分离度不高。更重要的是，目前的分离方法多集中在单一成分的富集，且仅强调单体纯度而忽略了回收率。
双水相操作简单，绿色高效，经济省时，易于放大。中国专利cn104356184a公开了一种以碳酸钠与异丙醇质量百分比10％配制双水相体系分离纯化栀子苷的方法。室温下按碳酸钠与异丙醇质量百分比10％配制双水相体系，加入浓缩的经栀子黄萃取后的残余液5ml，磁力搅拌40min，静置80min，经1500r/min离心30min，分离出栀子苷富集相，经真空浓缩干燥得栀子苷结晶粗品，但产品纯度、回收率没有给出。后序用8倍体积的乙酸乙酯进行重结晶得到栀子苷晶体，栀子苷的纯度为98.5％，栀子黄数据并未提及。中国专利cn105037461a采用多级双水相萃取，并结合助剂使用的方法，在反复萃取三次后实现了栀子苷，栀子黄的分离，重结晶后得到的栀子苷、栀子黄纯度分别为97.8％、95.5％，回收率分别为85.9％，86.8％。以上方法操作过程复杂，需反复萃取，同时需要助剂的辅助，难以实现栀子苷、栀子黄同步高效分离且得到高回收率的效果。
(三)
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明提供了一种利用有机试剂/盐双水相体系单步萃取实现栀子苷、栀子黄高收率及高纯度的同步分离的方法。
本发明采用的技术方案是：
一步双水相萃取同时制备高纯度栀子苷、栀子黄的方法，所述方法包括：
(1)栀子提取液制备：干栀子果粉碎、过筛，用足量50～60％异丙醇溶解，超声20～30min，取上清液减压旋蒸、富集后得到母液，用50～60％乙腈稀释成栀子苷浓度1200～6400μg/ml的栀子提取液；
(2)配制有机试剂/盐双水相体系，所述双水相体系中，有机试剂的质量分数为15～40％，盐的质量分数为10～30％；所述盐为下列之一：酒石酸钾钠、柠檬酸三钠、碳酸钠、硫酸铵、磷酸三钾；所述有机试剂为下列之一：异丙醇、乙腈；
(3)将栀子提取液加入到步骤(2)双水相体系，在室温条件下涡旋振荡5～10min，静置10～20min后，3000～9000r/min离心10～
50min，分离出富集栀子黄的上相(有机相)和富集栀子苷的下相(水相)。
双水相萃取后，可通过乙酸乙酯-正丁醇混合溶剂分别对上相栀子黄乙腈提取液、下相栀子苷水提取液进行萃取以初步富集栀子苷、栀子黄，同时达到除去磷酸三钾的目的，富集的栀子苷、栀子黄溶液经旋转蒸发后得到相应栀子黄、栀子苷纯品。
优选的，所述有机试剂/盐双水相体系中，有机试剂的质量分数为15～25％，盐的质量分数为20～30％。
优选的，所述有机试剂为乙腈，所述盐为磷酸三钾。
本发明通过室温下配制有机试剂与盐双水相体系并绘制相图，根据成相稳定性确定适宜的双水相体系(乙腈/磷酸三钾的浊点曲线图见图1)，筛选出最为优选的有机试剂/盐双水相体系为乙腈质量浓度16.67％、磷酸三钾质量浓度22.22％的双水相体系。在该双水相体系中，栀子苷、栀子黄的纯度最高可达90.58％、96.84％，回收率最高可达95.72％、90.74％。
具体的，所述步骤(3)为：将栀子提取液加入到步骤(2)双水相体系，在室温条件下涡旋振荡5～6min，静置10～15min后，5000～9000r/min离心30～50min，分离出富集栀子黄的上相和富集栀子苷的下相。
本发明着眼于一步实现栀子苷、栀子黄高选择性分离，具有产品单体纯度高、回收率大，工艺简单、省时、经济、高效等诸多优点。
本发明利用有机试剂/盐双水相单步萃取技术分离纯化栀子粗提取液，同时得到高纯度、高回收率的栀子苷、栀子黄提取液。该方法操作简单，绿色高效，经济省时，易于放大。它不仅开创了双水相萃取技术在同步分离栀子黄和栀子苷中的应用，同时实现了单步萃取即可提高栀子苷和栀子黄的分离纯化效率，而且该工艺还可以应用到其它天然色素的分离纯化中。
本发明的有意效果主要体现在：(1)本发明的方法工艺简单，无需另外添加有毒、难降解的螯合剂，也避免了传统萃取方法中需要大量使用有机溶剂的弊端，是绿色环保的过程；(2)本发明的双水相体系萃取栀子苷、栀子黄所需时间短、分相清晰、操作方便、设备简单；(3)本发明开有机试剂/盐双水相技术单步萃取同时实现高纯度栀子苷和栀子黄的高效分离，产品单体纯度高、回收率大，易于工业化生产。
(四)附图说明
图1为乙腈/磷酸三钾的浊点曲线图。
(五)具体实施方式
为了加深对本发明的理解，下面将结合具体实施例对本发明做进一步详细描述，该实施例仅用于解释本发明，并不对本发明的保护范围构成限定。
纯度和回收率检测过程叙述如下:
干栀子果经粉碎机粉碎，过40目筛，用60％异丙醇溶解(料液比1：5)，超声30min，取上清液于50℃下减压旋蒸，富集后得到母液，60％乙腈稀释成栀子苷浓度1200～6400μg/ml的栀子提取液。取适量的提取液加入既定的双水相体系中进行分离。hplc法分别测定上相、下相中栀子黄、栀子苷纯度和回收率。色谱条件为：色谱柱为agilentsb-c18(4.6×250mm，5μm)，流动相为甲醇:水＝50:50(v:v)，流速1.0ml/min，进样量10μl。
栀子苷和栀子黄监测波长分别为238nm和440nm。
双水相萃取后，通过乙酸乙酯-正丁醇(60：40，v/v)混合溶剂分别对上相栀子黄乙腈提取液，下相栀子苷水提取液进行萃取以初步富集栀子苷、栀子黄，同时达到除去磷酸三钾的目的。富集的栀子苷、栀子黄溶液旋转蒸发后得到相应栀子黄、栀子苷产品。
实施例1：
室温下配制质量分数分别为25％的异丙醇、磷酸三钾的双水相体系36g，将栀子提取液1.0ml(栀子苷浓度1200μg/ml)加入到该双水相体系，充分混匀，经过涡旋振荡5min后，在室温下静置10min，经5000r/min，20℃，离心30min，分离出富集栀子黄的上相(pupper)(有机相)和富集栀子苷的下相(pbottom)(水相)。
经检测，下相中栀子苷的纯度为85％、回收率为19.49％，上相中栀子黄纯度为58.2％、回收率为95.01％。
实施例2：
室温下配制质量分数分别为25％的异丙醇、柠檬酸三钠的双水相体系36g，将浓缩的栀子提取液1.0ml(栀子苷浓度1200μg/ml)加入到该双水相体系，充分混匀，经过涡旋振荡5min后，在室温下静置10min，经5000r/min，20℃，离心30min，分离出富集栀子黄的上相(pupper)和富集栀子苷的下相(pbottom)。
经检测，下相中栀子苷的纯度为85.9％、回收率为12.23％，上相中栀子黄的纯度为50.4％、回收率为96.54％。
实施例3：
室温下配制质量分数分别为25％的乙腈、柠檬酸三钠的双水相体系36g，将浓缩的栀子提取液1.0ml(栀子苷浓度1200μg/ml)加入到该双水相体系，充分混匀，经过涡旋振荡5min后，在室温下静置10min，经5000r/min，20℃，离心30min，分离出富集栀子黄的上相(pupper)和富集栀子苷的下相(pbottom)。
经检测，下相中栀子苷的纯度为85.3％、回收率为15.96％，上相中栀子黄的纯度为54.8％、回收率为96.14％。
实施例4：
室温下配制质量分数为25％的乙腈、磷酸三钾的双水相体系36g，将浓缩的栀子提取液1.0ml(栀子苷浓度1200μg/ml)加入到该双水相体系，充分混匀，经过涡旋振荡5min后，在室温下静置10min，经5000r/min，20℃，离心30min，分离出富集栀子黄的上相(pupper)和富集栀子苷的下相(pbottom)。
经检测，下相中栀子苷的纯度为73.13％、回收率为70.65％，上相中栀子黄的纯度为71.32％、回收率为46.87％。
实施例5：
室温下配制乙腈质量分数为38.89％，磷酸三钾质量分数为27.78％的双水相体系36g，将浓缩的栀子提取液1.0ml(栀子苷浓度1200μg/ml)加入到该双水相体系，充分混匀，经过涡旋振荡5min后，在室温下静置10min，经5000r/min，20℃，离心30min，分离出富集栀子黄的上相(pupper)和富集栀子苷的下相(pbottom)。
经检测，下相中栀子苷的纯度为34.44％、回收率为18.06％，上相中栀子黄的纯度为27.02％、回收率为46.84％。
实施例6：
室温下配制乙腈质量分数为16.67％，磷酸三钾质量分数为13.89％的双水相体系36g，将浓缩的栀子提取液1.0ml(栀子苷浓度1200μg/ml)加入到该双水相体系，充分混匀，经过涡旋振荡5min后，在室温下静置10min，经5000r/min，20℃，离心30min，分离出富集栀子黄的上相(pupper)和富集栀子苷的下相(pbottom)。
经检测，下相中栀子苷的纯度为57.84％、回收率为97.41％，上相中栀子黄的纯度为92.99％、回收率为32.44％。
实施例7：
室温下配制乙腈质量分数为16.67％，磷酸三钾质量分数为22.22％的双水相体系36g，将浓缩的栀子提取液1ml(栀子苷浓度1200μg/ml)加入到该双水相体系，充分混匀，经过涡旋振荡5min后，在室温下静置10min，经5000r/min，20℃，离心30min，分离出富集栀子黄的上相(pupper)和富集栀子苷的下相(pbottom)。
经检测，下相中栀子苷的纯度为83.39％、回收率为90.28％，上相中栀子黄的纯度为90.33％、回收率为83.46％。
实施例8：
室温下取质量分数为16.67％的乙腈，质量分数为22.22％的磷酸三钾双水相体系36g，将浓缩的栀子提取液1.0ml(栀子苷浓度1200μg/ml)加入到该双水相体系，充分混匀，经过涡旋振荡5min后，在室温下静置10min，经5000r/min，20℃，离心10min，分离出富集栀子黄的上相(pupper)和富集栀子苷的下相(pbottom)。
经检测，下相中栀子苷的纯度为81.30％、回收率为84.70％，上相中栀子黄的纯度为73.79％、回收率为68.87％。
实施例9：
室温下配制乙腈质量分数为16.67％，磷酸三钾质量分数为22.22％的双水相体系36g，将浓缩的栀子提取液1ml(栀子苷浓度1200μg/ml)加入到该双水相体系，充分混匀，经过涡旋振荡5min后，在室温下静置10min，经5000r/min，20℃，离心50min，分离出富集栀子黄的上相(pupper)和富集栀子苷的下相(pbottom)。
经检测，下相中栀子苷的纯度为88.68％、回收率为94.02％，上相中栀子黄的纯度为94.31％、回收率为89.91％。
实施例10：
室温下配制乙腈质量分数为16.67％，磷酸三钾质量分数为22.22％的双水相体系360g，将浓缩的栀子提取液10ml(栀子苷浓度1200μg/ml)加入到该双水相体系，充分混匀，经过涡旋振荡5min后，在室温下静置10min，经5000r/min，20℃，离心40min，分离出富集栀子黄的上相(pupper)和富集栀子苷的下相(pbottom)。
经检测，下相中栀子苷的纯度为85.60％、回收率为90.49％，上相中栀子黄的纯度为91.06％、回收率为86.44％。
实施例11：
室温下配制乙腈质量分数为16.67％，磷酸三钾质量分数为22.22％的双水相体系360g，将浓缩的栀子提取液10ml(栀子苷浓度1200μg/ml)加入到该双水相体系，充分混匀，经过涡旋振荡5min后，在室温下静置10min，经3000r/min，20℃，离心40min，分离出富集栀子黄的上相(pupper)和富集栀子苷的下相(pbottom)。
经检测，下相中栀子苷的纯度为76.80％、回收率为86.98％，上相中栀子黄的纯度为86.10％、回收率为75.43％。
实施例12：
室温下配制乙腈质量分数为16.67％，磷酸三钾质量分数为22.22％的双水相体系360g，将浓缩的栀子提取液10ml(栀子苷浓度1200μg/ml)加入到该双水相体系，充分混匀，经过涡旋振荡5min后，在室温下静置10min，经9000r/min，20℃，离心40min，分离出富集栀子黄的上相(pupper)和富集栀子苷的下相(pbottom)。
经检测，下相中栀子苷的纯度为90.51％、回收率为93.82％，上相中栀子黄的纯度为94.32％、回收率为91.26％。
实施例13：
室温下配制乙腈质量分数为16.67％，磷酸三钾质量分数为22.22％的双水相体系360g，将浓缩的提取液10ml(栀子苷浓度1200μg/ml)加入到该双水相体系，充分混匀，经过涡旋振荡5min后，在室温下静置10min，经8000r/min，20℃，离心40min，分离出富集栀子黄的上相(pupper)和富集栀子苷的下相(pbottom)。
经检测，下相中栀子苷的纯度为90.58％、回收率为93.91％，上相中栀子黄的纯度为94.46％、回收率为94.41％。
实施例14：
室温下配制乙腈质量分数为16.67％，磷酸三钾质量分数为22.22％的双水相体系360g，将浓缩的提取液10ml(栀子苷浓度6400μg/ml)加入到该双水相体系，充分混匀，经过涡旋振荡5min后，在室温下静置10min，经8000r/min，20℃，离心40min，分离出富集栀子黄的上相(pupper)和富集栀子苷的下相(pbottom)。
经检测，下相中栀子苷的纯度为92.26％、回收率为82.99％，上相中栀子黄的纯度为85.16％、回收率为93.36％。
实施例15：
室温下配制乙腈质量分数为16.67％，磷酸三钾质量分数为22.22％的双水相体系360g，将浓缩的提取液10ml(栀子苷浓度1600μg/ml)加入到该双水相体系，充分混匀，经过涡旋振荡5min后，在室温下静置10min，经8000r/min，20℃，离心40min，分离出富集栀子黄的上相(pupper)和富集栀子苷的下相(pbottom)。
经检测，下相中栀子苷的纯度为90.58％、回收率为95.72％，上相中栀子黄的纯度为96.84％、回收率为90.74％。
1.一步双水相萃取同时制备高纯度栀子苷、栀子黄的方法，所述方法包括：
(1)栀子提取液制备：干栀子果粉碎、过筛，用足量50～60％异丙醇溶解，超声20～30min，取上清液减压旋蒸、富集后得到母液，用50～60％乙腈稀释得到栀子苷浓度1200～6400μg/ml的栀子提取液；
(2)配制有机试剂/盐双水相体系，所述双水相体系中，有机试剂的质量分数为15～40％，盐的质量分数为10～30％；所述盐为下列之一：酒石酸钾钠、柠檬酸三钠、碳酸钠、硫酸铵、磷酸三钾；所述有机试剂为下列之一：异丙醇、乙腈；
(3)将栀子提取液加入到步骤(2)双水相体系，在室温条件下涡旋振荡5～10min，静置10～20min后，3000～9000r/min离心10～50min，分离出富集栀子黄的上相和富集栀子苷的下相。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述有机试剂/盐双水相体系中，有机试剂的质量分数为15～25％，盐的质量分数为20～30％。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述有机试剂为乙腈，所述盐为磷酸三钾。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述有机试剂/盐双水相体系为乙腈质量浓度16.67％、磷酸三钾质量浓度22.22％的双水相体系。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(3)为：将栀子提取液加入到步骤(2)双水相体系，在室温条件下涡旋振荡5～6min，静置10～15min后，5000～9000r/min离心30～50min，分离出富集栀子黄的上相和富集栀子苷的下相。
技术总结