本发明属于天然植物药制剂技术领域，具体涉及一种茶花蜂花粉中降血糖成分及其提取方法与应用。
背景技术：
高血糖病是通常所说的“三高”之一，指患者血糖含量长期持续超出正常水平。血糖正常值为，在空腹时不高于6.1mmol/l，在餐后两小时后不高于7.8mmol/l以下。如果高于这一范围，称为高血糖。
正常情况下，人体能够通过激素调节和神经调节确保血糖平衡。然而对于高血压、高血脂、糖尿病、肥胖患者，以及长期不合理饮食的人群，两大调节功能发生紊乱，易造成高血糖症。高血糖症极易诱发心脑血管疾病等诸多并发症，严重威胁人类健康。因此，开发天然降血糖药物对于辅助降血糖具有重要意义。
蜂花粉被誉为“全天然食品浓缩营养库”，富含丰富多样的营养成分以及活性成分。早期研究已发现，蜂花粉中的多糖类组分，多酚类化合物、黄酮类化合物均具有降血糖的潜力。
例如，cn104998263a公开了一种从茶花粉中获取α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法。该抑制剂通过抑制α-葡萄糖苷酶的活性，使摄取的多糖、寡糖和双糖消化变成葡萄糖、果糖等单糖的过程受阻，即通过阻止更多单糖的产生来实现降低血糖的目的。
然而，对于存在于食品中的葡萄糖等单糖而言，其经摄食后仍可通过人肠上皮细胞对葡萄糖的吸收和转运，使患者血糖升高。
技术实现要素：
本发明的第一目的是提供一种茶花蜂花粉中降血糖成分的提取方法。所得降血糖成分可显著抑制人肠上皮细胞对葡萄糖的吸收和转运作用，从而实现降血糖功效。
所述茶花蜂花粉中降血糖成分的提取方法为：先利用正己烷除脂，再利用乙醇溶液水浴超声进行提取；最后通过spe小柱净化与富集；其中：
所述茶花蜂花粉与正己烷的料液比为1g:(4-6)ml；
所述乙醇溶液的质量浓度为70％，所述茶花蜂花粉与乙醇溶液的料液比为1g：(6-10)ml。
常规蜂花粉提取工艺得到的提取物通常只能作为α-葡萄糖苷酶抑制剂，其通过抑制单糖的转化实现降血糖。然而我们通过研究发现，茶花蜂花粉中除已知的α-葡萄糖苷酶抑制剂外，还有一些降血糖机理不同于抑制剂的活性成分，如山奈酚-3-o-(6”-o-反-香豆酰基)-吡喃葡萄糖苷(活性成分a)、山奈酚-3-o-(2',6'-二-o-反式-对-香豆酰基)-β-d-吡喃葡萄糖苷(活性成分b)。不同于以往抑制剂的降血糖作用机制，此类活性成分可通过抑制人肠上皮细胞对摄食后的葡萄糖的吸收和转运来实现降血糖功效。
为此，我们期望通过改进现有提取工艺，以最大程度获得这部分活性成分。
在研究中，我们尝试采用95％乙醇常规提取更多的茶花蜂花粉中活性组分，但发现所得提取液粘稠度较高，无法采用spe小柱实现净化与富集；由于提取液中糖类等干扰成分较多，大大降低了提取物的黄酮类物质的含量比例，难以发挥降血糖作用。
我们也曾尝试更换提取试剂，虽一定程度降低了提取液的粘度，但同时黄酮类物质的提取程度也随之下降；也曾尝试采用采用乙酸乙酯萃取替代spe小柱，但效果仍不够理想。
通过不断的尝试，我们最终提出先除脂再提取最后净化与富集的工艺流程，并通过筛选除脂试剂和提取试剂，获得最佳匹配使用组合方式，从而获得粘度低、黄酮类物质含量高、干扰成分少的提取液，进而实现后续spe小柱的净化与富集的可操作性，提高最终提取物的降血糖功效。
虽然正己烷、70％乙醇均为本领域常用提取试剂，但本案中通过选择正己烷除脂和利用70％乙醇提取复配联合使用，解决现有提取工艺无法采用spe小柱进行净化与富集的问题，这与正己烷、70％乙醇的常规作用显然是不同的。
所述水浴超声的条件为：功率60～100khz，温度50～70℃。通过控制此条件，能够进一步提高降血糖成分的提取率，进而提高降血糖效果。
所述超声提取的时间为60～90min，具体视实际情况而定。
优选地，所述spe小柱的填料为改性的苯乙烯-二乙烯基苯聚合物bondelut-ppl；规格为500mg/6ml。研究表明，相比其他填料，bondelut-ppl填料更有利于黄酮类化合物的吸附，从而提高蜂花粉降血糖成分(包括活性成分a和活性成分b)的富集度，获得降血糖活性较高的蜂花粉提取物。
所述净化与富集包括：所述spe小柱需先用4～5ml甲醇进行活化，再用4～5ml纯水洗去甲醇；上样前，加压将柱中残留的水分抽干，以发挥spe小柱良好的净化和富集作用。经过净化和富集后得到的提取物中活性成分浓度更高，也更具有实际应用价值。
所述上样是指，向spe小柱中加入茶花蜂花粉提取液。上样过程中，流速不宜过快，使茶花蜂花粉提取液自然流下即可，无需加压；上样结束后，用4～5ml纯水冲洗spe小柱。
优选地，上述纯水冲洗后的spe小柱需用甲醇分4～6次洗脱，每次4～5ml，至小柱洗脱干净为止；洗脱液用小管收集，收集液经氮吹至甲醇挥发完毕，获得黄色提取物为茶花蜂花粉的降血糖成分。
优选地，所述提取方法还包括在所述净化与富集之前，对提取液进行旋转蒸发；所述旋转蒸发的条件为：旋蒸仪转速为50～60转/min，温度为45～50℃；旋蒸时间适剩余溶液体积而定，一般旋蒸至剩余20～30％体积的溶液即可停止，以获得不含乙醇的茶花蜂花提取液。
本发明的第二目的是提供上述提取方法获得的茶花蜂花粉中降血糖成分。
所述茶花蜂花粉中降血糖成分，含有：
山奈酚-3-o-(6”-o-反-香豆酰基)-吡喃葡萄糖苷，其含量至少在10.0mg/g以上；
山奈酚-3-o-(2',6'-二-o-反式-对-香豆酰基)-β-d-吡喃葡萄糖苷，其含量至少在8.0mg/g以上。
本发明的第三目的是提供上述茶花蜂花粉的降血糖成分在制备降血糖药物中的应用，所述降血糖药物用于抑制人肠上皮细胞对葡萄糖的吸收和转运作用。
本发明取得的有益效果如下：
本发明所述的提取方法可较大程度提取到茶花蜂花粉中的功能性黄酮类化合物，包括活性成分a和活性成分b。所得提取物可显著抑制人肠上皮细胞对葡萄糖的吸收和转运作用，从而发挥降血糖功效。
附图说明
图1为活性成分a和活性成分b在正离子扫描模式下的质谱图。
其中，a1和a2分别为活性成分a的提取离子流图和二级质谱图，其中试样中活性成分a在上图，标准品活性成分a在下图；
b1和b2分别为活性成分a的提取离子流图和二级质谱图，其中试样中活性成分b在上图，标准品活性成分b在下图。
图2为活性成分a和活性成分b在负离子扫描模式下的质谱图。
其中，a1和a2分别为活性成分a的提取离子流图和二级质谱图，其中试样中活性成分a在上图，标准品活性成分a在下图；
b1和b2分别为活性成分a的提取离子流图和二级质谱图，其中试样中活性成分b在上图，标准品活性成分b在下图。
图3为不同处理组间的人肠上皮细胞对葡萄糖吸收的差异。
图4为不同处理组间的人肠上皮细胞对葡萄糖从内室转运至外室的差异。
图5为不同处理组间的人肠上皮细胞对荧光标记葡萄糖的吸收差异。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本实施例提供一种茶花蜂花粉中的降血糖成分的提取方法，具体步骤如下：
1)准确称取5.0g茶花蜂花粉粉末，并加入20ml正己烷进行除脂，然后过滤除去正己烷脂质提取液，再按料液比1:8加入40ml浓度为70％乙醇溶液，进行水浴超声提取，水浴超声的条件为功率80khz，时间为60min，温度为60℃，提取后过滤并收集乙醇提取液。
2)将乙醇提取液进行低压旋转蒸发去除乙醇溶剂，设置旋蒸仪转速为50转/min，温度为50℃，当旋蒸瓶中剩余溶液体积约为10ml时停止旋蒸，获得不含乙醇的茶花蜂花粉提取液。
3)选择填料为改性的苯乙烯-二乙烯基苯聚合物(bondelut-ppl)，规格为500mg/6ml的spe小柱，用5ml甲醇进行活化，再用5ml纯水洗去甲醇，在上样前加压将柱中残留的水分抽干，以发挥spe小柱良好的净化和富集作用。
4)向spe小柱中加入茶花蜂花粉提取液，上样过程中流速不宜过快，要使茶花蜂花粉提取液自然流下即可，无需加压，上样结束后用5ml纯水冲洗spe小柱，再用甲醇分5次洗脱，每次5ml，至小柱洗脱干净为止，洗脱液用小管收集，收集液经氮吹至甲醇挥发完毕，获得黄色提取物为茶花蜂花粉的降血糖成分。
对本实施例所得的茶花蜂花粉的降血糖成分进行超高效液相色谱-串联四级杆-飞行时间-高分辨质谱分析，所述茶花蜂花粉的降血糖成分中活性成分a含量为10.0mg/g提取物，和活性成分b含量为8.0mg/g提取物，活性成分a和b的质谱图见图1和图2。
试验例1:
本试验例检验实施例1所得茶花蜂花粉的降血糖成分的降血糖作用。
具体检测步骤如下：
(1)肠上皮细胞转运模型建立：将人肠上皮细胞即caco-2细胞按1x105个/孔接种于transwell孔板(每板12个小室，内室底部为0.4μm孔径的聚碳酸酯膜，膜面积为1.12cm2)的内室中，并使内室中培养液为0.5ml/孔，外室中培养液为1.5ml/孔，每隔1天进行培养液更新，在每次更新培养液前使用millicellers-2细胞电阻仪检测每个小室中形成的单层caco-2细胞的电阻值，持续到第18～21天电阻值超出空白小室(即没有接种细胞的小室)电阻值300ω证明肠上皮细胞转运模型建立成功。
(2)试验分组：将transwell孔板的12个小室设置为2个空白小室，5个对照小室，5个试样小室。
空白组，2个，没有接种细胞的小室，并且没有进行给予葡萄糖和试样处理；
对照组，5个，接种了caco-2细胞的小室，并且进行给予葡萄糖处理，给予葡萄糖浓度为2mg/ml；
试样组，5个，接种了caco-2细胞的小室，并且同时进行给予葡萄糖处理和试样处理，给予葡萄糖浓度为2mg/ml，试样浓度为100μg/ml，试样为实施例1所得茶花蜂花粉的降血糖成分。
(3)试验步骤：
1、当肠上皮细胞转运模型建立成功后，将transwell孔板的12个小室内的培养液替换为hepes缓冲溶液，hepes缓冲溶液是由20mmhepes，137mmnacl，4.7mmkcl，1.8mmcacl2和1.2mmmgso4组成。然后按照试验分组情况进行试验处理。
2、在孵育2h后分别收集外室和内室溶液，待测。然后用预冷的pbs缓冲液清洗内室2次，然后向内室中加入500μl/孔的0.1mnaoh并在37℃孵育30min，使其对内室膜上细胞进行裂解，收集细胞裂解液，待测。
3、将收集到的外室、内室溶液和细胞裂解液，利用葡萄糖检测试剂盒对其进行葡萄糖含量检测。
4、向6孔板中每孔的中心位置放置一片细胞爬片(爬片内径为24mm)，并将caco-2细胞按1x105个/ml均匀接种至每个孔，设置3个孔为对照组，即加入200μg/ml异硫氰酸荧光素(fitc)标记的葡萄糖；3个孔为试样组，即同时加入200μg/mlfitc标记的葡萄糖和100μg/ml试样，试样为实施例1所得茶花蜂花粉的降血糖成分。
5、孵育2h后，将细胞爬片取出置于新的6孔板中，用预冷的pbs缓冲溶液清洗3次，然后用预冷的甲醇丙酮(体积比1:1)混合溶液固定30min，再用预冷的pbs缓冲溶液清洗3次，然后用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)染色5min，最后用leica激光共聚焦显微镜观测并拍照。
(4)试验结果：
葡萄糖检测结果显示：
试样组外室溶液的葡萄糖浓度显著低于对照组外室溶液的葡萄糖浓度，平均抑制率达53.6％(如图3所示)，反映出试样具有显著的抑制人肠上皮细胞对葡萄糖转运的作用；
试样组细胞裂解液的葡萄糖浓度显著低于对照组细胞裂解液的葡萄糖浓度，平均抑制率达30.8％(如图4所示)，反映出试样具有显著的抑制人肠上皮细胞对葡萄糖吸收的作用；
激光共聚焦显微镜下观测图片结果显示：
试样组细胞的荧光信号显著低于对照组细胞的荧光信号(如图5所示)，同样反映出试样具有显著的抑制人肠上皮细胞对葡萄糖吸收的作用。
对比例1：
本对比例提供由实施例1所得的茶花蜂花粉的降血糖成分与2种已知的可通过抑制葡萄糖被人肠上皮细胞吸收和转运而降血糖的黄酮类化合物(即根皮素和根皮苷)进行降血糖活性对比。
具体步骤如下：
(1)构建肠上皮细胞转运模型后，将transwell孔板的12个小室内的培养液替换为hepes缓冲溶液。然后按照试验分组情况进行试验处理：
对照组，设置3个小室，接种了caco-2细胞的小室，并且进行给予葡萄糖处理，给予葡萄糖浓度为2mg/ml；
试样组，设置3个小室，接种了caco-2细胞的小室，并且同时进行给予葡萄糖处理和试样处理，给予葡萄糖浓度为2mg/ml，试样浓度为100μg/ml；试样为实施例1所得茶花蜂花粉的降血糖成分。
根皮素组，设置3个小室，接种了caco-2细胞的小室，并且同时进行给予葡萄糖处理和根皮素处理，给予葡萄糖浓度为2mg/ml，根皮素浓度为1μg/ml；
根皮苷组，设置3个小室，接种了caco-2细胞的小室，并且同时进行给予葡萄糖处理和根皮苷处理，给予葡萄糖浓度为2mg/ml，根皮苷浓度为1μg/ml；
(2)在孵育2h后分别收集外室和内室溶液。然后用预冷的pbs缓冲液清洗内室2次，然后向内室中加入500μl/孔的0.1mnaoh并在37℃孵育30min，使其对内室膜上细胞进行裂解，收集细胞裂解液。将收集到的外室、内室溶液和细胞裂解液，利用葡萄糖检测试剂盒对其进行葡萄糖含量检测。
经对比后发现，实施例1所得茶花蜂花粉的降血糖成分在100μg/ml给药浓度下与给药浓度为1μg/ml的根皮素和根皮苷对人肠上皮细胞对葡萄糖吸收和转运的抑制能力相当(如图3和图4所示)。
由此可见，本发明所述茶花蜂花粉的降血糖成分可发挥显著的降血糖功效，在预防、治疗高血糖症领域具有广阔的应用前景。
对比例2
与实施例1的提取工艺的区别在于：未经过除脂的茶花蜂花粉直接进行提取，提取试剂为质量浓度95％的乙醇。结果发现：
经旋蒸后获得的不含乙醇的茶花蜂花粉提取液粘稠度较高，无法进行spe小柱处理，导致提取物中干扰成分多，降血糖活性显著降低至少50％以上。
对比例3
与实施例1的提取工艺的区别在于：通过实施例1中步骤1)和步骤2)获得的不含乙醇的茶花蜂花粉提取液不再经过spe小柱处理，而是经过乙酸乙酯萃取，具体操作如下：
向实施例1的步骤1)和步骤2)获得的不含乙醇的茶花蜂花粉提取液中加入40ml乙酸乙酯，水浴超声萃取，水浴超声的条件为功率80khz，时间为60min，温度为60℃，静置30min后取上清液，氮吹干燥获得黄色提取物。
将获得的黄色提取物重溶于甲醇中，并进行超高效液相色谱-串联四级杆-飞行时间-高分辨质谱分析。
对比发现，所得提取物中活性成分a和活性成分b的含量较实施例1所得提取物中活性成分a和活性成分b的含量显著降低约20％。
同时，将对比例2所得的提取物按试验例1所述步骤进行细胞试验，对比发现，对比例2所得提取物的降血糖活性较实施例1所得提取物的降血糖活性显著降低约20％。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
1.一种茶花蜂花粉中降血糖成分的提取方法，其特征在于，先利用正己烷除脂，再利用乙醇溶液水浴超声进行提取，最后通过spe小柱净化与富集；其中：
所述茶花蜂花粉与正己烷的料液比为1g:(4-6)ml；
所述乙醇溶液的质量浓度为70％，所述茶花蜂花粉与乙醇溶液的料液比为1g：(6-10)ml。
2.根据权利要求1所述的茶花蜂花粉中降血糖成分的提取方法，其特征在于，所述水浴超声的条件为：功率60～100khz，温度50～70℃。
3.根据权利要求2所述的茶花蜂花粉中降血糖成分的提取方法，其特征在于，所述spe小柱的填料为bondelut-ppl。
4.根据权利要求3所述的茶花蜂花粉中降血糖成分的提取方法，其特征在于，所述spe小柱需先用4～5ml甲醇进行活化，再用4～5ml纯水洗去甲醇；上样前，加压将柱中残留的水分抽干。
5.根据权利要求4所述的茶花蜂花粉中降血糖成分的提取方法，其特征在于，所述上样是指向spe小柱中加入茶花蜂花粉提取液；其中，上样过程中，茶花蜂花粉提取液的流速为自然流下；上样结束后，用4～5ml纯水冲洗spe小柱；
纯水冲洗后的spe小柱需用甲醇分4～6次洗脱，每次4～5ml；洗脱液用小管收集，收集液经氮吹至甲醇挥发完毕。
6.根据权利要求5所述的茶花蜂花粉中降血糖成分的提取方法，其特征在于，所述提取方法还包括在所述净化与富集之前，对提取液进行旋转蒸发；
所述旋转蒸发的条件为：旋蒸仪转速为50～60转/min，温度为45～50℃。
7.权利要求1-6任一所述提取方法获得的茶花蜂花粉中降血糖成分。
8.根据权利要求7所述的茶花蜂花粉中降血糖成分，其特征在于，含有：
山奈酚-3-o-(6”-o-反-香豆酰基)-吡喃葡萄糖苷，其含量至少在10.0mg/g以上；
山奈酚-3-o-(2',6'-二-o-反式-对-香豆酰基)-β-d-吡喃葡萄糖苷，其含量至少在8.0mg/g以上。
9.权利要求7或8所述茶花蜂花粉中降血糖成分在制备降血糖药物中的应用，所述降血糖药物用于抑制人肠上皮细胞对葡萄糖的吸收和转运作用。
技术总结