本发明涉及药物合成制备
技术领域：
，特别涉及一种去氢表雄酮粗品的纯化方法及去氢表雄酮的定量检测方法。
背景技术：
：去氢表雄酮，英文名称：dehydroepiandrosterone，化学名：3β-羟基-5-雄烯-17-酮，分子式为c19h28o2。去氢表雄酮是用于制造甾体药物的重要中间体和原料，同时具有延缓衰老、保持青春活力、增强体能，改善情绪和睡眠、提高记忆力、调节免疫系统功能以及提高肌体免疫力等功效。在制备药物时，对去氢表雄酮的纯度及纯度的准确度要求很高。去氢表雄酮的主要制备方法为利用植物甾醇发酵产物雄烯二酮(4-ad)为原料再经过酯化、缩酮、还原、水解来合成去氢表雄酮，该制备方法产率高。然而，该制备工艺中会产生大量的副产物，例如第三步还原反应采用硼氢化钠进行还原，还原过程产生异构体杂质，经过水解后变成α-异构体；酯化或缩酮反应过程中也会产生副产物或原料本身由于未反应完全作为杂质残留在产物去氢表雄酮中，导致去氢表雄酮的纯度降低。传统的提纯方法集中在如何分离去氢表雄酮的α-异构体上，但还是有其他不明杂质残留在去氢表雄酮中，从而降低去氢表雄酮的纯度，影响去氢表雄酮含量测定的准确度，不利于去氢表雄酮的应用。因此，开发一种有效分离去氢表雄酮粗品中的杂质的提纯方法具有重要意义。技术实现要素：基于此，本发明提供一种去氢表雄酮粗品的纯化方法及去氢表雄酮的定量检测方法，该纯化方法能有效分离去氢表雄酮粗品中的杂质，包括α-异构体和其他不明杂质，从而对去氢表雄酮粗品进行高效除杂。本发明提供一种去氢表雄酮粗品的纯化方法，包括以下步骤：将去氢表雄酮粗品与有机溶剂混合，制得样品溶液；采用液相色谱法对样品溶液进行分离，得到纯化的去氢表雄酮；其中，所述液相色谱法采用的色谱柱为烷基柱，所采用的流动相为体积比为(20～60):(40～80)的磷酸铵盐水溶液和乙腈。在其中一些实施例中，所述流动相由体积含量20％～60％的磷酸铵盐水溶液和体积含量40％～80％乙腈组成。在其中一些实施例中，所述液相色谱法采用的洗脱程序如下：在0～10min，所述流动相中磷酸铵盐水溶液的体积含量为60％，乙腈的体积含量为40％；在10～35min，所述流动相中磷酸铵盐水溶液的体积含量从60％降至20％，乙腈的体积含量从40％提高至80％；在35～43min，所述流动相中磷酸铵盐水溶液的体积含量为20％，乙腈的体积含量为80％；在43～44min，所述流动相中磷酸铵盐水溶液的体积含量从20％提高至60％，乙腈的体积含量从80％降至40％；在44～50min，所述流动相中磷酸铵盐水溶液的体积含量为60％，乙腈的体积含量为40％。在其中一些实施例中，所述去氢表雄酮粗品为采用雄烯二酮经酯化、缩酮、还原和水解制得的。在其中一些实施例中，所述磷酸铵盐水溶液的ph值为2.5～3.5，所述磷酸铵盐水溶液中的磷酸铵盐选自磷酸一铵、磷酸二铵和磷酸三铵中的至少一种。在其中一些实施例中，所述色谱柱的柱温为20℃～35℃。在其中一些实施例中，所述流动相的流速为1ml/min～1.2ml/min。在其中一些实施例中，所述有机溶剂为乙腈。本发明还提供一种去氢表雄酮的定量检测方法，包括如下步骤：采用上述任一种去氢表雄酮粗品的纯化方法将去氢表雄酮和杂质分离；紫外检测以测定含量。在其中一些实施例中，所述紫外检测的检测波长为190nm～220nm。有益效果本发明提供的去氢表雄酮粗品的纯化方法中，将去氢表雄酮粗品与有机溶剂混合，制得样品溶液后，采用液相色谱法对样品溶液进行分离，得到纯化的去氢表雄酮；其中，液相色谱法以烷基柱为色谱柱，以体积比为(20～60):(40～80)的磷酸铵盐水溶液和乙腈为流动相，从而进行反向色谱分离，去氢表雄酮粗品中的杂质与去氢表雄酮在特定的流动相环境中，去氢表雄酮、去氢表雄酮的异构体及其他杂质与流动相的极性相差较大，因此其各自在色谱柱中的保留时长差别较大，能使去氢表雄酮和包括其异构体在内的杂质达到分离，从而有效分离去氢表雄酮粗品中的杂质。进一步地，上述去氢表雄酮粗品的纯化方法中，采用特定的洗脱程序，使去氢表雄酮和包括其异构体在内的杂质能够高效分离，分离度高，提高了分离的准确度和灵敏度。附图说明图1为实施例1中样品溶液的色谱图；图2为实施例2中样品溶液的色谱图；图3为实施例3中样品溶液的色谱图；图4为对比例1中样品溶液的色谱图；图5为对比例2中样品溶液的色谱图；图6为对比例3中样品溶液的色谱图。具体实施方式以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的
技术领域：
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。传统工艺中常利用植物甾醇发酵产物雄烯二酮(4-ad)为原料再经过酯化、缩酮、还原、水解来合成去氢表雄酮，反应过程中会产生大量的副产物，例如第三步还原反应采用硼氢化钠进行还原，还原过程产生异构体杂质，经过水解后变成α-异构体；酯化或缩酮反应过程中也会产生副产物或原料本身由于未反应完全作为杂质残留在产物去氢表雄酮中，这些杂质与去氢表雄酮的某些性质比较相似，其分离困难度很高，导致测定的去氢表雄酮纯度的准确性降低。其中，去氢表雄酮及其α-异构体3α-去氢表雄酮的结构分别如式(1)和(2)所示。本发明的技术人员发现，在传统的去氢表雄酮的提纯方法中，大多关注研究如何分离α-异构体，然而，去氢表雄酮粗品中还有其他不明杂质残留在去氢表雄酮中，降低了去氢表雄酮纯度的纯度。例如一技术中，采用苯基柱为色谱柱，以乙腈、乙醇和水作为流动相，其能将去氢表雄酮及其α-异构体分离，但不涉及如何分离其他不明杂质；还有一种技术采用水和乙腈作为流动相，c18柱作为色谱柱，其也能将去氢表雄酮及其α-异构体分离，但无法分离其他不明杂质。本发明的技术人员对去氢表雄酮的制备过程涉及到的反应历程进行了深入研究，在进一步经过大量的实验探究分析后，获得本发明中该能有效分离去氢表雄酮粗品中的杂质，包括α-异构体和其他不明杂质，提高去氢表雄酮纯度的技术方案。本发明一实施方式提供了一种去氢表雄酮粗品的纯化方法，包括以下步骤s10～s20。步骤s10、将去氢表雄酮粗品与有机溶剂混合，制得样品溶液。在其中一些实施例中，上述有机溶剂为乙腈。在其中一些实施例中，样品溶液0.3mg/ml～2mg/ml。在其中一些实施例中，上述去氢表雄酮粗品为采用雄烯二酮经酯化、缩酮、还原和水解制得。采用雄烯二酮经酯化、缩酮、还原和水解制得去氢表雄酮时，酯化或缩酮反应过程中也会产生副产物或原料本身由于未反应完全作为杂质残留在产物去氢表雄酮中，第三步还原反应采用硼氢化钠进行还原，还原过程产生异构体杂质，经过水解后变成α-异构体，导致得到去氢表雄酮粗品的纯度无法满足制造甾体药物的需求。步骤s20、采用液相色谱法对步骤s10制得的样品溶液进行分离，得到纯化的去氢表雄酮；其中，液相色谱法采用的色谱柱为烷基柱，所采用的流动相为体积比为(20～60):(40～80)的磷酸铵盐水溶液和乙腈。步骤s20中，采用高效液相色谱法对样品溶液进行分离，其中，以烷基柱为色谱柱，以体积比为(20～60):(40～80)的磷酸铵盐水溶液和乙腈为流动相，从而进行反向色谱分离，去氢表雄酮粗品中的杂质与去氢表雄酮在特定的流动相环境中，去氢表雄酮和包括其异构体在内的杂质与流动相的极性相差较大，因此其各自在色谱柱中的保留时长较大，从而使去氢表雄酮和包括其异构体在内的杂质分离，提高了去氢表雄酮的纯度。在其中一些实施例中，上述流动相由体积含量20％～60％的磷酸铵盐水溶液和体积含量40％～80％乙腈组成。在其中一些实施例中，步骤s20中，液相色谱法采用的洗脱程序如下：在0～10min，所述流动相中磷酸铵盐水溶液的体积含量为60％，乙腈的体积含量为40％；在10～35min，所述流动相中磷酸铵盐水溶液的体积含量从60％降至20％，乙腈的体积含量从40％提高至80％；在35～43min，所述流动相中磷酸铵盐水溶液的体积含量为20％，乙腈的体积含量为80％；在43～44min，所述流动相中磷酸铵盐水溶液的体积含量从20％提高至60％，乙腈的体积含量从80％降至40％；在44～50min，所述流动相中磷酸铵盐水溶液的体积含量为60％，乙腈的体积含量为40％。采用特定的洗脱程序，使去氢表雄酮和包括其异构体在内的杂质能够高效分离，分离度高，能提高了分离的准确度和灵敏度。在其中一些实施例中，上述流动相的流速为1ml/min～1.2ml/min。在其中一些实施例中，色谱柱的柱温为20℃～35℃。在其中一些实施例中，上述磷酸铵盐水溶液的ph值为2.5～3.5；进一步地，磷酸铵盐水溶液中的磷酸铵盐选自磷酸一铵、磷酸二铵和磷酸三铵中的至少一种。具体地，上述磷酸铵盐水溶液的浓度为0.01mol/l～0.05mol/l。在其中一些实施例中，上述色谱柱选自c18柱、c8柱或c4柱。进一步地，上述色谱柱选自c18柱，长度100mm～150mm，直径3mm～5mm，固定相填充物粒径为2.7μm～3.5μm。具体地，上述色谱柱c18柱，型号为agilentmicrospher，100mm*4.6mm，3μm粒径。在其中一些实施例中，上述样品溶液的进样量为10μl～50μl。进一步地，供试品溶液的进样量为20μl。在其中一些好，在进行步骤s20之前，还包括采用与步骤s20中的液相色谱法相同的工艺条件，分别对纯的去氢表雄酮及纯的3α-去氢表雄酮进行液相色谱处理，以对去氢表雄酮和3α去氢表雄酮杂质进行定位。本发明进一步提供一种去氢表雄酮的定量检测方法，包括如下步骤s30～s40。步骤s30、采用上述任一种去氢表雄酮粗品的纯化方法将去氢表雄酮和杂质分离；步骤s30、紫外检测以测定含量。在其中一些实施例中，步骤s30中紫外检测的检测波长为190nm～220nm。具体地，采用的检测波长为210nm，是去氢表雄酮及其α-异构体以及大多数其他不明杂质在紫外可见光区均具有较大吸收的波长。在其中一些实施例中，步骤s30中还获得去氢表雄酮粗品样品的色谱图，进一步的，步骤s30中紫外检测以测定含量的计算方法如下：用去氢表雄酮的峰面积除以样品的色谱图中所有峰的峰面积总和的比值，即可得到去氢表雄酮粗品的纯度。下面将结合具体的实施例对本发明进行了说明，但本发明并不局限于下述实施例，应当理解，所附权利要求概括了本发明的范围，在本发明构思的引导下本领域的技术人员应意识到，对本发明的各实施例所进行的一定的改变，都将被本发明的权利要求书的精神和范围所覆盖。具体实施例这里按照本发明的去氢表雄酮粗品的纯化方法及去氢表雄酮的定量检测方法举例，但本发明并不局限于下述实施例。实施例11)色谱条件：色谱柱为agilentmicrospherc18，100*4.6mm，固定相为3μm粒径的十八烷基硅烷，柱温为25℃。2)检测波长为210nm。3)流动相及梯度洗脱程序如下表1：表1时间(min)磷酸二氢铵溶液(v％)乙腈(v％)0-10604010-3560→2040→8035-43208043-4420→6080→4044-506040其中，磷酸二氢铵溶液的浓度为0.04mol/l，ph值为2.5，v％为体积含量百分比。4)总分析时长50分钟。5)α-异构体杂质定位溶液：精密称取3α-去氢表雄酮1mg，用70％乙腈溶解并稀释制成1mg/ml的溶液，再精密量取该溶液1ml，置100ml量瓶中，加乙腈定容至刻度，摇匀，作为3α-去氢表雄酮杂质定位溶液；采用上述步骤1)～4)的工艺条件对3α-去氢表雄酮杂质定位溶液进行液相色谱测试，进样量为20μl，以用于确定3α-去氢表雄酮的保留时间的位置，为7.78min左右。6)精密称取去氢表雄酮纯品1mg，用70％乙腈溶解并稀释制成每1mg/ml溶液，作为供试品溶液。采用上述步骤1)～4)的工艺条件对供试品溶液进行液相色谱测试，进样量为20μl，以用于确定去氢表雄酮的保留时间的位置，为6.133min左右。7)提供采用雄烯二酮经酯化、缩酮、还原和水解制得的去氢表雄酮粗品。精密称取该去氢表雄酮粗品1mg，用70％乙腈溶解并稀释制成1mg/ml的溶液，作为样品溶液。采用上述步骤1)～4)的工艺条件对样品溶液进行液相色谱分离，进样量为20μl，得到的色谱图，如附图1所示，图中横坐标为出峰时间，图中可以看到去氢表雄酮的保留时间的位置为6.133min左右，3α-去氢表雄酮的保留时间的位置为7.78min左右，还有其他不明杂质的峰，从图中可以看出，经液相色谱处理后，去氢表雄酮能和3α-去氢表雄酮基绝大部分其他不明杂质有效分离。8)采用面积归一化法对色谱图中去氢表雄酮主峰的含量进行计算，具体按照下述公式计算，计算得到的结果即为去氢表雄酮粗品的纯度，结果表明去氢表雄酮粗品的纯度为99.47％。计算方式：用去氢表雄酮的峰面积除以样品的色谱图中所有峰的峰面积总和的比值，即可得到去氢表雄酮粗品的纯度。注：去氢表雄酮粗品经提纯分离后，将去氢表雄酮和包括其异构体在内的杂质有效分离，分离效果越好，分离出的杂质越多，其主峰去氢表雄酮所占的面积百分比越小，计算得到的去氢表雄酮粗品的纯度越接近真实值，数值越小。实施例2实施例2与实施例1基本相同，不同之处在于步骤3)的流动相中磷酸二氢铵溶液的ph值为3.0。其余步骤与工艺参数与实施例1相同。得到的液相色谱图如附图2所示。结果表明去氢表雄酮粗品的纯度为99.49％。实施例3实施例3与实施例1基本相同，不同之处在于步骤3)的流动相中磷酸二氢铵溶液的ph值为3.5。其余步骤与工艺参数与实施例1相同。得到的液相色谱图如附图3所示。结果表明去氢表雄酮粗品的纯度为99.48％。对比例1对比例1与实施例1基本相同，不同之处在于步骤1)中色谱柱为苯基柱，型号为agilentzorbaxsb-phenyl，250*4.6mm，5μm。其余步骤与工艺参数与实施例1相同。在此条件下，去氢表雄酮的保留时间的位置为15.569min左右，3α-去氢表雄酮的保留时间的位置为15.234min左右，去氢表雄酮粗品经处理后得到的色谱图如附图5所示，从图中可以看出，经液相色谱处理后，去氢表雄酮无法和3α-去氢表雄酮进行有效分离，也无法分离出绝大部分其他不明杂质。结果表明去氢表雄酮粗品的纯度为99.9％。对比例21)色谱条件：色谱柱为agilentmicrospherc18，100*4.6mm，固定相为3μm粒径的十八烷基硅烷，柱温为25℃。2)检测波长为210nm。3)流动相采用体积比为20:20:60的乙醇、乙腈和水，流动相流速为1.0ml/min。4)总分析时长50分钟。5)α-异构体杂质定位溶液：精密称取3α-去氢表雄酮1mg，用70％乙腈溶解并稀释制成1mg/ml的溶液，再精密量取该溶液1ml，置100ml量瓶中，加乙腈定容至刻度，摇匀，作为3α-去氢表雄酮杂质定位溶液；采用上述步骤1)～4)的工艺条件对3α-去氢表雄酮杂质定位溶液进行液相色谱测试，进样量为20μl，以用于确定3α-去氢表雄酮的保留时间的位置，为15.46min左右。6)精密称取去氢表雄酮纯品1mg，用70％乙腈溶解并稀释制成每1mg/ml溶液，作为供试品溶液。采用上述步骤1)～4)的工艺条件对供试品溶液进行液相色谱测试，进样量为20μl，以用于确定去氢表雄酮的保留时间的位置，为10.13min左右。7)提供采用雄烯二酮经酯化、缩酮、还原和水解制得的去氢表雄酮粗品。精密称取该去氢表雄酮粗品1mg，用70％乙腈溶解并稀释制成1mg/ml的溶液，作为样品溶液。采用上述步骤1)～4)的工艺条件对样品溶液进行液相色谱分离，进样量为20μl，得到的色谱图，如附图5所示，图中横坐标为出峰时间，图中可以看到去氢表雄酮的保留时间的位置为10.13min左右，3α-去氢表雄酮的保留时间的位置为15.46min左右，但是并没有其他不明杂质的峰，说明经液相色谱处理后，去氢表雄酮尽管能与3α-去氢表雄酮分离，但不能与其他不明杂质有效分离。8)结果表明去氢表雄酮粗品的纯度为99.78％。对比例31)色谱条件：色谱柱为agilentmicrospherc18，100*4.6mm，固定相为3μm粒径的十八烷基硅烷，柱温为25℃。2)检测波长为210nm。3)流动相及梯度洗脱程序如下表3：表3其中，v％为体积含量百分比，流动相流速为1.0ml/min。其他操作步骤与实施例1相同。得到的色谱图如附图6所示，从图谱中可看出，经液相色谱处理后，去氢表雄只能与3α-去氢表雄酮及少量其他不明杂质有效分离。结果表明去氢表雄酮粗品的纯度为99.63％。以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页1 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技术特征：1.一种去氢表雄酮粗品的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
将去氢表雄酮粗品与有机溶剂混合，制得样品溶液；
采用液相色谱法对样品溶液进行分离，得到纯化的去氢表雄酮；
其中，所述液相色谱法采用的色谱柱为烷基柱，所采用的流动相为体积比为(20～60):(40～80)的磷酸铵盐水溶液和乙腈。
2.如权利要求1所述的去氢表雄酮粗品的纯化方法，其特征在于，所述流动相由体积含量20％～60％的磷酸铵盐水溶液和体积含量40％～80％乙腈组成。
3.如权利要求1所述的去氢表雄酮粗品的纯化方法，其特征在于，所述液相色谱法采用的洗脱程序如下：
在0～10min，所述流动相中磷酸铵盐水溶液的体积含量为60％，乙腈的体积含量为40％；
在10～35min，所述流动相中磷酸铵盐水溶液的体积含量从60％降至20％，乙腈的体积含量从40％提高至80％；
在35～43min，所述流动相中磷酸铵盐水溶液的体积含量为20％，乙腈的体积含量为80％；
在43～44min，所述流动相中磷酸铵盐水溶液的体积含量从20％提高至60％，乙腈的体积含量从80％降至40％；
在44～50min，所述流动相中磷酸铵盐水溶液的体积含量为60％，乙腈的体积含量为40％。
4.如权利要求1所述的去氢表雄酮粗品的纯化方法，其特征在于，所述去氢表雄酮粗品为采用雄烯二酮经酯化、缩酮、还原和水解制得的。
5.如权利要求1所述的去氢表雄酮粗品的纯化方法，其特征在于，所述磷酸铵盐水溶液的ph值为2.5～3.5，所述磷酸铵盐水溶液中的磷酸铵盐选自磷酸一铵、磷酸二铵和磷酸三铵中的至少一种。
6.如权利要求1所述的去氢表雄酮粗品的纯化方法，其特征在于，所述色谱柱的柱温为20℃～35℃。
7.如权利要求1～5任一项所述的去氢表雄酮粗品的纯化方法，其特征在于，所述流动相的流速为1ml/min～1.2ml/min。
8.如权利要求1～5任一项所述的去氢表雄酮粗品的纯化方法，其特征在于，所述有机溶剂为乙腈。
9.一种去氢表雄酮的定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
采用如权利要求1～8任一项所述的去氢表雄酮粗品的纯化方法将去氢表雄酮和杂质分离；
紫外检测以测定含量。
10.如权利要求9所述的去氢表雄酮的定量检测方法，其特征在于，所述紫外检测的检测波长为190nm～220nm。
技术总结本发明涉及一种去氢表雄酮粗品的纯化方法及去氢表雄酮的定量检测方法；在该纯化方法中，将去氢表雄酮粗品与有机溶剂混合，制得样品溶液，然后采用液相色谱法对样品溶液进行分离，得到纯化的去氢表雄酮；其中，液相色谱法采用的色谱柱为烷基柱，所采用的流动相为体积比为(20～60):(40～80)的磷酸铵盐水溶液和乙腈。去氢表雄酮粗品中的杂质与去氢表雄酮在特定的流动相环境中，去氢表雄酮和包括其异构体在内的杂质与流动相的极性相差较大，因此其各自在色谱柱中的保留时长差异较大，能使去氢表雄酮和包括其异构体在内的杂质达到分离，从而提高去氢表雄酮的纯度。
技术研发人员：张跃;曾春玲;靳志忠;刘喜荣;王诗盛;杨梅辉
受保护的技术使用者：湖南新合新生物医药有限公司
技术研发日：2020.11.12
技术公布日：2021.03.12
