本发明涉及赤潮藻治理领域，尤其是涉及一种羊栖菜中抑藻活性化合物的制备方法及用途。
背景技术：
羊栖菜（sargassumfusiforme）是一种生长在温带的多年生大型经济海藻，浙江洞头县是我国羊栖菜的主产区，羊栖菜养殖具有净化环境的作用，羊栖菜养殖区附近很少有赤潮的发生。羊栖菜不仅是一种美味的食品，还富含多糖、蛋白质及微量元素等对人体有益的成分，是一种典型的药用和食用同源藻类（浙江农业科学，2014(04)：487-491）。目前，国内外对羊栖菜生物活性物质的研究，主要集中在对羊栖菜多糖降血糖、抗肿瘤、抗氧化和抗病毒等活性的研究。前期的工作中，我们发现了羊栖菜有较好的抑藻效果，但目前国内外尚未见羊栖菜抑藻物质分离纯化和鉴定的专利和文献报道,现有的物理和化学方法治理赤潮存在成本高、二次污染和持续性不强等问题相对于这两种方法，生物法更加专一、高效，具有生物安全性。近年来，围绕大型海藻与赤潮的相互作用，科学家们做了大量的研究。研究表明，大型海藻可以直接或间接的抑制微藻的生长。
技术实现要素：
针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提供一种羊栖菜中抑藻活性化合物的制备方法及用途，本发明从羊栖菜中提取天然抑藻活性成分，获得一种利用羊栖菜的天然活性组分，属于天然成分，在水体中易于降解，不会对自然界造成二次污染，为其资源化利用提出了新的途径；同时本发明所述抑藻方法具有提取工艺简单，操作方法简便等诸多优点，该方法具有良好的抑藻效果，可以有效的去除赤潮异弯藻，为赤潮异弯藻的去除提供了新的方法。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：本发明提供了一种羊栖菜中抑藻活性化合物的制备方法，所述制备方法按如下的步骤进行：
s1:新鲜羊栖菜经清洗后，阴处自然风干，人工或机械粉碎过40目筛；称取羊栖菜粉末，按料液比1:10（m/v）加入85%乙醇，25℃浸提24h，用布氏漏斗进行抽滤得到滤液；重复提取3次后合并滤液，滤液经减压蒸发至无醇味；检测该浓缩液对赤潮异弯藻生长强抑制效果；
s2:浓缩液依次使用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，每次萃取重复3次，萃取液经旋转蒸发得到组分a、组分b、组分c与组分d；组分a经抑藻活性检测具有抑制赤潮异弯藻的活性；
s3：组分a采用硅胶柱层析进行分离，得到11个再分组分，分别进行抑藻活性检测；经抑藻活性检测，其中4个再分组分a3、a4、a5和a6具有显著抑制赤潮异弯藻生长的活性；除a3组分继续进行硅胶柱和sephadexlh-20凝胶柱层析分离外，其余组分采用硅胶薄层层析进行制备；a3组分经凝胶柱层析分离后得到6个组分；其中a3-2、a3-3与a3-4具有抑制赤潮异弯藻生长的活性，且有较高的纯度；a3-2、a3-3和a4-4经nmr与tof-ms鉴定，分别为岩藻甾醇、24-氢过氧基-24-乙烯基胆甾醇和马尾藻甾醇，均为甾醇类化合物。
根据上述技术方案，所述步骤s3中，组分a采用200-300目硅胶柱层析进行分离，洗脱液均为体积比为石油醚：丙酮（30:1，25:1，20:1，10:1，5:1，1:1，0:1），梯度洗脱，流速为1.0ml/min，洗脱至所有物质流出；所有组分经减压浓缩，点样于硅胶gf-254薄层色谱板上进行层析，以体积比为1:5-1:1氯仿/石油醚为展开剂；硫酸乙醇溶液显色后，合并相同馏分后，得到组份a1-a11。
根据上述技术方案，其特征在于，所述步骤s3中在组分a3使用sephadexlh-20凝胶柱层析进行分离，以用石油醚：氯仿：甲醇（7:5:1，v/v）为洗脱剂，流速为1.0ml/min，洗脱至所有物质流出；所有馏分减压浓缩，点样于硅胶gf254薄层层析，以体积比为1:2氯仿/石油醚为展开剂；合并相同馏分后，得到组份a3-2、a3-3和a4-4。
以上任何一种羊栖菜抑藻活性化合物的制备方法分离制得的组份中的一种或几种在制备抑制了赤潮异弯藻的生长活性组合物中的应用。
本发明从羊栖菜中提取天然抑藻活性成分，获得一种利用羊栖菜的天然活性组分，属于天然成分，在水体中易于降解，不会对自然界造成二次污染，为其资源化利用提出了新的途径；同时本发明所述抑藻方法具有提取工艺简单，操作方法简便等诸多优点，该方法具有良好的抑藻效果，可以有效的去除赤潮异弯藻，为赤潮异弯藻的去除提供了新的方法。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是本发明羊栖菜化感物质分离示意图。
图2是本发明不同浓度乙醇提取对赤潮异弯藻生长的影响示意图。
图3是本发明不同萃取相提取物对赤潮异弯藻生长的影响示意图。
图4是本发明柱层析组分对赤潮异弯藻生长的影响示意图。
具体实施方式
下面结合附图1-4对本发明的具体实施方式做进一步详细说明。
实施例1：羊栖菜中抑藻活性物质的分离方法：
新鲜羊栖菜用清水洗净去除表面盐分和附着生物后自然风干，研磨粉碎过40目筛后收集；称取羊栖菜粉末，按料液比1:10（m/v）加入85%乙醇，25℃浸提24h，期间摇晃3次，使用滤纸进行抽滤得到滤液，重复提取3次后合并滤液；通过旋转蒸发仪在50℃，100rpm条件下将减压蒸发至浸膏状；
浸膏加水复溶，加入石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，每次萃取重复3次，萃取液经旋转蒸发得到对应组分a、b、c、d浸膏；各组分溶于dmso配制成10mg/ml母液，按终浓度8μg/ml投加于赤潮异弯藻培养液中；组分a显示出对赤潮异弯藻生长强烈的抑制作用，抑制率达98.6%（3d）。
实施例2：抑藻活性物质的纯化方法：
组份a用适量溶剂溶解后置于少量硅胶中，置于200-300目硅胶柱层析进行分离，以石油醚：丙酮（30:1，25:1，20:1，10:1，5:1，1:1，0:1）为洗脱剂进行梯度洗脱，每个馏分20ml，所得馏分50℃下减压浓缩，进行硅胶gf254薄层层析检测，展开剂为石油醚/丙酮（1:1）；合并相同馏分后，40℃下减压蒸干除去溶剂，获得组分a1-a11；11个再分组份分别进行抑藻活性检测，浓度为8mg/ml培养3d；抑藻结果表明再分组份a3、a4、a5和a6具有显著抑制赤潮异弯藻生长的活性，抑制率分别达96.7%、94.3%、95.4%、84.5%；
组分a3用少量洗脱剂充分溶解后，使用sephadaxlh-20凝胶柱层析，用石油醚：氯仿：甲醇（7:5:1，v/v）洗脱若干柱体积；洗脱多个柱体积后，所得馏分50℃下减压浓缩，经硅胶gf254薄层层析检测，合并，减压蒸干后，共得到6种组分；含量较高组分a3-2，a3-3和a3-4采用划线法于硅胶制备板上进行纯化制备，展开剂为石油醚：丙酮（1:1）；经展开硫酸乙醇显色后，分别在硅胶预制板上呈现清洗且明显的条带；刮下后分别收集，丙酮浸泡，经过滤浓缩制备得到薄层纯；采用1h-nmr、13c-nmr和tof-ms光谱测定等技术确定了化合物的成分及其结构；样品a3-2、a3-3和a3-4分别为岩藻甾醇、24-氢过氧基-24-乙烯基胆甾醇和马尾藻甾醇，均为甾醇类化合物。
实施例3：抑藻活性物质对赤潮异弯藻的抑制效果评价
具体为：取处于对数生长期的赤潮异弯藻，用新鲜f/2培养基稀释至1×105cells/ml，在100ml锥形瓶内加入50ml藻液，待测物质经dmso溶解后经0.22μm滤膜进行过滤添加至藻液中使终浓度为8μg/ml，同时设定添加同体积dmso的藻液作为对照，每组三个平行；所有的锥形瓶置于光照培养箱，温度25±1℃，70μmol/（m2•s），d:n（12:12）；
利用浮游植物计数板，经鲁戈氏碘液固定后使用显微镜对各实验组中的细胞密度进行计数，并参照如下公式计算抑制率；
ir(%)=(1-n/n_0)×100
ir为抑制率（%）；n为实验组细胞密度（cells/ml）；n0为对照组细胞密度（cells/ml）。
本发明从羊栖菜中提取天然抑藻活性成分，获得一种利用羊栖菜的天然活性组分，属于天然成分，在水体中易于降解，不会对自然界造成二次污染，为其资源化利用提出了新的途径；同时本发明所述抑藻方法具有提取工艺简单，操作方法简便等诸多优点，该方法具有良好的抑藻效果，可以有效的去除赤潮异弯藻，为赤潮异弯藻的去除提供了新的方法。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
1.一种羊栖菜中抑藻活性化合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法按如下的步骤进行：
s1:新鲜羊栖菜经清洗后，阴处自然风干，人工或机械粉碎过40目筛；称取羊栖菜粉末，按料液比1:10（m/v）加入85%乙醇，25℃浸提24h，用布氏漏斗进行抽滤得到滤液；重复提取3次后合并滤液，滤液经减压蒸发至无醇味；检测该浓缩液对赤潮异弯藻生长强抑制效果；
s2:浓缩液依次使用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，每次萃取重复3次，萃取液经旋转蒸发得到组分a、组分b、组分c与组分d；组分a经抑藻活性检测具有抑制赤潮异弯藻的活性；
s3：组分a采用硅胶柱层析进行分离，得到11个再分组分，分别进行抑藻活性检测；经抑藻活性检测，其中4个再分组分a3、a4、a5和a6具有显著抑制赤潮异弯藻生长的活性；除a3组分继续进行硅胶柱和sephadexlh-20凝胶柱层析分离外，其余组分采用硅胶薄层层析进行制备；a3组分经凝胶柱层析分离后得到6个组分；其中a3-2、a3-3与a3-4具有抑制赤潮异弯藻生长的活性，且有较高的纯度；a3-2、a3-3和a4-4经nmr与tof-ms鉴定，分别为岩藻甾醇、24-氢过氧基-24-乙烯基胆甾醇和马尾藻甾醇，均为甾醇类化合物。
2.根据权利要求1所述的一种羊栖菜中抑藻活性化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤s3中，组分a采用200-300目硅胶柱层析进行分离，洗脱液均为体积比为石油醚：丙酮（30:1，25:1，20:1，10:1，5:1，1:1，0:1），梯度洗脱，流速为1.0ml/min，洗脱至所有物质流出；所有组分经减压浓缩，点样于硅胶gf-254薄层色谱板上进行层析，以体积比为1:5-1:1氯仿/石油醚为展开剂；硫酸乙醇溶液显色后，合并相同馏分后，得到组份a1-a11。
3.根据权利要求1或2所述的一种羊栖菜中抑藻活性化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤s3中在组分a3使用sephadexlh-20凝胶柱层析进行分离，以用石油醚：氯仿：甲醇（7:5:1，v/v）为洗脱剂，流速为1.0ml/min，洗脱至所有物质流出；所有馏分减压浓缩，点样于硅胶gf254薄层层析，以体积比为1:2氯仿/石油醚为展开剂；合并相同馏分后，得到组份a3-2、a3-3和a4-4。
4.根据权利要求1-3中任何一项所述的一种羊栖菜中抑藻活性化合物的用途，其特征在于，所述用途包括分离制得的组份中的一种或几种在制备抑制了赤潮异弯藻的生长活性组合物中的应用。
技术总结