本发明涉及救必应酸技术领域，尤其涉及一种救必应酸的制备方法，以及救必应酸在制备治疗非酒精性脂肪性肝炎药物中的应用。
背景技术：
非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholicsteatohepatitis，nash)，定义为伴随有炎症及肝细胞损伤的脂肪变性现象，是非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholicfattyliverdisease，nafld)中较严重的一种病理类型。nash的病理学改变表现为肝细胞大泡性脂肪变性，小叶内炎症伴点状坏死，肝细胞气球样变等，患者可能出现严重的炎症反应及肝细胞损伤，并有较高风险发展成肝纤维化、肝硬化和肝癌，严重危害人类健康。
随着社会经济的发展和人们生活水平的提高，在过去的20年里，非酒精性脂肪性肝炎(nash)的发病率已翻倍，现已成为西方国家中最为常见的肝脏疾病。在美国，nafld的发病率约占总人口的10-46％，其中约10-30％的患者会发展成为nash。事实上，nash已成为继慢性丙型肝炎之后美国肝移植的第二大常见原因，预计在不久将成为首要原因。导致nash的主要危险因素包括肥胖、2型糖尿病及血脂异常与代谢综合征。
nash对医疗体系的负担是沉重的，尽管医疗需求迫切，然而迄今为止fda尚未批准任何药物用于nash治疗。根据现有证据，美国肝病学会(aasld)和欧洲肝病学会(easl)相继更新了nafld的诊疗指南，但在临床实践中可供选择的治疗方案仍然有限，而且现有方案的远期获益尚不明确。因此，研发一种可用于治疗nash的药物迫在眉睫。
救必应(ilicisrotundaecortex)为冬青科冬青属铁冬青(ilexrotundathunb)的干燥树皮，其主要成分包括救必应酸、紫丁香苷、长梗冬青苷，其中，救必应酸(rotundicacid，ra)为五环三萜类化合物。救必应药材味苦、性寒，具有清热利湿，行气止痛等功能，临床上主要用于治疗肠胃及心血管疾病、感冒发热、咽喉肿痛、跌打损伤，目前收载于2015版《中华人民共和国药典》一部。救必应的原植物铁冬青分布广泛，主要分布于广东、广西、福建、台湾、湖南、江苏、浙江、安徽、江西、云南等省区。
从中药材中提取活性物质再应用于制药中是目前中药开发和应用的常见方式，对于救必应药材也不例外，但是由于救必应中所含成分的特殊性，常用提取物作为活性物质，如专利文献cn201410054627.5具有抗肝损伤作用的救必应提取物及其应用、cn201810248025.1救必应提取物及其制备和治疗肝炎的应用及cn201010607538.0一种药物组合物在制备防治酒精性肝损伤/脂肪肝及降血脂的药物中的应用等，由公开的技术方案制备所得提取物均为混合物，甚至有些提取物还难以鉴定混合物中的活性成分，这些提取物的质量标准和功效难以控制，严重限制了救必应药材的应用价值，目前关于救必应中具体成分的活性及功效仍未完全清楚明晰。
技术实现要素：
本发明针对现有技术存在的上述问题，提供一种从救必应或救必应粗提取物中提取制备高纯度救必应酸的方法，以及提供救必应酸在制备治疗非酒精性脂肪性肝病药物中的应用，尤其是在制备治疗非酒精性脂肪性肝炎药物中的应用。
本发明的第一方面，提供一种救必应酸的制备方法，包括以下步骤，
s1救必应苷的富集：分别取救必应粗提取物、醇溶液和活性炭并混合到一起，回流状态下搅拌混合物1-3h；然后过滤并浓缩滤液，接着在搅拌下向浓缩液中逐滴滴加水至无白色固体析出，过滤并烘干后得到救必应苷富集物。
优选的，所述醇溶液是体积分数为80-100％的甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇等碳原子数为1-8的低碳醇；
优选的，所述醇溶液的质量为救必应粗提取物的6-10倍。
优选的，所述活性炭的质量为救必应粗提取物的0.1倍。
优选的，滤液按每取1g救必应粗提取物原料浓缩为1ml的程度进行浓缩。
优选的，向浓缩液中滴加水的质量为浓缩液重量的2-3倍。
所述救必应粗提取物是将救必应药材粉碎后，使用乙醇溶液通过回流、过滤、浓缩、干燥后所得含有救必应苷的混合提取物。救必应粗提取物也可以是由其它常见提取方法所提取的混合提取物。
s2救必应酸的合成：分别取救必应苷富集物和甲醇并混合到一起，回流混合物至救必应苷富集物完全溶解，然后向混合物中滴加碱溶液并继续回流至混合物中的救必应苷反应完全；混合物冷却至室温后用盐酸调节其ph至2-5，然后过滤收集沉淀，沉淀用水洗涤后烘干，得到救必应酸粗品。
优选的，混合物回流的时间为5-6h。
优选的，所述甲醇的质量为救必应苷富集物的4倍以上。
优选的，所述碱溶液为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、氢氧化钙或氢氧化钠钡的溶液。
优选的，所述碱溶液的浓度为2mol/l。
优选的，当所述碱溶液选用氢氧化钠溶液，所述氢氧化钠的质量为救必应苷富集物的0.1倍以上，更优选的，所述氢氧化钠的质量为救必应苷富集物的0.2-0.5倍。
优选的，用质量百分浓度为10％的盐酸调节冷却后混合物的ph。
s3救必应酸的纯化：取救必应酸粗品，以低碳醇为溶剂进行重结晶，过滤并干燥后得到救必应酸；所述救必应酸的纯度大于或等于98％。
所述低碳醇选自甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇等碳原子数为1-8的醇中的至少一种。
本发明的另一方面，提供一种高纯度的救必应酸在制备治疗非酒精性脂肪性肝病药物中的应用，尤其是在制备治疗非酒精性脂肪性肝炎药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明通过先将救必应粗提物在乙醇溶液及活性炭中回流并初步纯化，然后再使富集物在氢氧化钠的碱性环境中进一步回流反应，通过调节反应液的ph并将ph控制在2-5的范围内，可析出能够进行重结晶的沉淀物，从而获得高纯度的救必应酸，进而可对救必应酸进行药效学评价。本发明通过救必应酸对非酒精性脂肪性肝炎的药效学评价，证明救必应酸可应用于治疗非酒精性脂肪性肝病药物的制备，尤其是应用于治疗非酒精性脂肪性肝炎药物的制备。
附图说明
图1a为各组动物血清中谷丙转氨酶(alt)的含量；
图1b为各组动物血清中谷草转氨酶(ast)的含量；
图1c为各组动物血清中碱性磷酸酶(alp)的含量；
图2a为各组动物血清中甘油三酯(tg)的含量；
图2b为各组动物血清中总胆固醇(cho)的含量；
图2c为各组动物血清中高密度脂蛋白(hdl)的含量；
图2d为各组动物血清中低密度脂蛋白(ldl)的含量；
图3为各组动物的血糖水平；
图4a为各组动物肝脏的tg含量；
图4b为各组动物肝脏的cho含量。
具体实施方式
为了更充分的理解本发明的技术内容，下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步介绍和说明。
一、救必应酸的制备
实施例1
本实施例提供一种救必应酸的制备方法，具体制作步骤如下：
1、救必应苷的富集
分别取救必应粗提取物(从救必应药材中提取的含有救必应苷的混合提取物)、95％乙醇溶液和活性炭并混合到一起，95％乙醇溶液的质量为救必应粗提取物的8倍，活性炭的质量为救必应粗提取物的0.1倍。混合物在近80℃下搅拌回流1-3h，然后过滤，浓缩滤液，滤液按每取1g救必应粗提取物原料浓缩为1ml的程度进行浓缩(如取10g救必应粗提取物进行回流，将滤液浓缩至10ml)。接着，边搅拌边向浓缩的滤液中滴加水，水的质量为浓缩后滤液质量的2-3倍，滴加至滤液中不再有白色固体析出。过滤收集固体，烘干即得救必应苷富集物。
2、救必应酸的合成
分别取救必应苷富集物和甲醇并混合到一起，甲醇溶液的质量为救必应苷富集物的4倍。混合物在65℃下回流至救必应苷富集物完全溶解，然后向混合物中滴加2mol/l的氢氧化钠溶液并继续回流5-6h至混合物中的救必应苷反应完全(液相色谱监控救必应苷反应完全)。混合物冷却至室温后用质量百分浓度为10％的盐酸调节其ph至4±0.1，然后过滤收集沉淀，沉淀用水洗涤3次后烘干，得到救必应酸粗品，收率92％。
3、救必应酸的纯化
取救必应酸粗品，以甲醇为溶剂进行重结晶，过滤并干燥后得到白色粉末状的产品，收率89％；产品经核磁和质谱确定为救必应酸，其纯度为98.67％，其特征x-射线衍射峰2θ为：5.65，9.72，11.20，13.00，13.78，15.23，15.91，16.75，18.55，19.46，29.22和33.79°。
实施例2
本实施例提供一种救必应酸的制备方法，包括救必应苷的富集、救必应酸的合成、救必应酸的纯化三个步骤，其中，救必应苷的富集步骤与实施例1的一致；救必应酸的合成步骤中，用质量百分浓度为10％的盐酸将混合物的ph调至5±0.1，其它与实施例1的一致；救必应酸的纯化步骤，取救必应酸粗品，以甲醇为溶剂进行重结晶，过滤并干燥后得到白色粉末状的产品，所收集的产品经测定比对确定为救必应酸，收率87％，其纯度为98.63％。
实施例3
本实施例提供一种救必应酸的制备方法，包括救必应苷的富集、救必应酸的合成、救必应酸的纯化三个步骤，其中，救必应苷的富集步骤与实施例1的一致；救必应酸的合成步骤中，用2mol/l的lioh溶液进行水解反应，其它与实施例1的一致；救必应酸的纯化步骤，取救必应酸粗品，以甲醇为溶剂进行重结晶，过滤并干燥后得到白色粉末状的产品，所收集的产品经测定比对确定为救必应酸，收率86％，其纯度为98.71％。
实施例4
本实施例提供一种救必应酸的制备方法，包括救必应苷的富集、救必应酸的合成二个步骤，其中，救必应苷的富集步骤与实施例1的一致；救必应酸的合成步骤中，用质量百分浓度为10％的盐酸将混合物的ph调至2.5±0.1，其它与实施例1的一致；救必应酸粗品的收率为62％。
实施例5
本实施例提供一种救必应酸的制备方法，包括救必应苷的富集、救必应酸的合成二个步骤，其中，救必应苷的富集步骤与实施例1的一致；救必应酸的合成步骤中，用质量百分浓度为10％的盐酸将混合物的ph调至2.0±0.1，其它与实施例1的一致；救必应酸粗品的收率为49％。
实施例6
本实施例提供一种救必应酸的制备方法，包括救必应苷的富集、救必应酸的合成、救必应酸的纯化三个步骤，其中，救必应苷的富集和救必应酸的合成步骤与实施例1的一致；救必应酸的纯化步骤，取救必应酸粗品，以异丙醇为溶剂进行重结晶，收率85％，纯度98.2％。
实施例7
本实施例提供一种救必应酸的制备方法，包括救必应苷的富集、救必应酸的合成二个步骤，其中，救必应苷的富集步骤与实施例1的一致；救必应酸的合成步骤中，用质量百分浓度为10％的盐酸将混合物的ph调至7±0.1，其它与实施例1的一致；救必应酸粗品收率低至38％。
本发明先将救必应粗提物在乙醇等溶液及活性炭中回流并初步提纯，然后再使富集物在氢氧化钠等碱性环境中回流发生水解反应，通过调节反应液的ph并控制在2-5的范围内，可析出足够量的救必应酸粗品进行重结晶，从而获得高纯度的救必应酸。当ph偏高时，收率明显偏低；当ph偏低时，盐酸的用量会明显增加，收率也会降低，甚至无晶体析出无法实现高效制备救必应酸的目的。
通过本发明方法可高效制备高纯度的救必应酸，因此得以对救必应酸进行药效学评价。
二、以实施例1制备的救必应酸为样品，进行救必应酸对非酒精性脂肪性肝炎的药效学评价
将48只8周龄的c57bl/6小鼠先分成喂养普通饲料的对照组(8只)和喂养高脂-高胆固醇-高胆盐饲料组(40只)，在喂养4周后，将喂养高脂-高胆固醇-高胆盐饲料组再分为模型组，阳性药组(gs0976，10mg/kg)，救必应酸低剂量组(50mg/kg)，救必应酸高剂量组(100mg/kg)，救必应苷粗品组(100mg/kg)。每组8只动物。各组小鼠均于饲料喂养4周后开始给药(给药同时给予高脂-高胆固醇-高胆盐饲料)，每天1次给予相应药物灌胃，连续给药4周。模型组给予以溶媒(20％丙二醇 80％水)灌胃。给药4周后禁食过夜不禁水，随后眼眶采血，测定血浆中谷丙转氨酶(alt)、谷草转氨酶(ast)、总胆固醇(cho)、甘油三酯(tg)、葡萄糖(glu)、碱性磷酸酶(alp)、高密度脂蛋白(hdl)和低密度脂蛋白(ldl)的含量，并解剖，取肝称重，取肝大叶固定，进行he染色，并做评分测定；取约20mg肝小叶进行匀浆，测定匀浆中tg、cho含量。
1、血清肝功能指标
如表1及图1a、图1b、图1c所示，动物经过高脂高胆固醇胆盐饮食喂养8周后，相对正常对照组，模型组(gs0976-10mg/kg)的alt水平显著升高(p＜0.01)，ast水平显著升高(p＜0.05)，alp水平极显著下降(p＜0.001)。救必应酸在50mg/kg(救必应酸低剂量组/救必应酸-50mg/kg)和100mg/kg(救必应酸高剂量组/救必应酸-100mg/kg)的剂量下对血清肝功能指标alt、ast、alp无明显影响。
表1各组动物血清中肝功能水平变化
*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001vsmodel
2、血脂水平的变化
如表2和图2a、图2b、图2c、图2d所示，与正常对照组相比，模型组动物经过高脂高胆固醇胆盐饮食喂养8周后，其血清tg水平显著下降(p＜0.001)，cho、hdl及ldl水平均显著升高(p＜0.001，p＜0.01，p＜0.001)。血清tg水平：救必应酸对血清tg水平无明显影响。
血清cho水平：救必应酸在100mg/kg(救必应酸高剂量组/救必应酸-100mg/kg)时可显著降低血清cho水平(p＜0.05)，救必应酸在50mg/kg(救必应酸低剂量组/救必应酸-50mg/kg)时对血清cho水平无明显影响。
血清hdl水平：救必应酸在100mg/kg时可显著降低血清hdl水平(p＜0.05)，救必应酸在50mg/kg时对血清hdl水平无明显影响。
血清ldl水平：救必应酸对血清ldl水平无明显影响。
表2各组动物血脂水平变化
*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001vsmodel
3、血糖水平变化
如表3和图3所示，与正常对照组相比，模型组动物经过高脂高胆固醇胆盐饮食喂养8周后，血糖水平显著升高(p＜0.05)。救必应酸50mg/kg(救必应酸低剂量组/救必应酸-50mg/kg)和100mg/kg(救必应酸高剂量组/救必应酸-100mg/kg)两个剂量对动物血糖无明显影响。
表3各组动物血糖水平变化
*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001vsmodel
4、小鼠肝脂质水平
如表4和图4a、图4b所示，与正常对照组相比，模型组动物经过高脂高胆固醇胆盐饮食喂养8周后，肝脏的tg水平显著升高(p＜0.05)，肝脏的cho水平极显著升高(p＜0.001)。给药四周后，救必应酸两个剂量50mg/kg(救必应酸低剂量组/救必应酸-50mg/kg)和100mg/kg(救必应酸高剂量组/救必应酸-100mg/kg)均能极其显著的降低肝脏tg和cho水平，且降脂效果明显强于阳性药gs0976(gs0976-10mg/kg)，说明救必应酸具有较强的降低肝脏甘油三酯和胆固醇水平的作用，而救必应酸纯品在降低肝脏甘油三酯和胆固醇方面优于救必应苷粗品(救必应苷粗品组/救必应苷粗品-100mg/kg)。
表4各组动物肝脏tg、cho水平变化
*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001vsmodel
5、小鼠肝脏he染色
如表5所示，从病理结果来看，高脂高胆固醇胆盐饲料喂养小鼠8周，模型组动物肝脏出现明显的脂变和炎症，脂变评分为0.88，炎症评分为2.88，未出现气球样变，总评分为3.75。
给药四周后，救必应酸50mg/kg(救必应酸低剂量组/救必应酸-50mg/kg)和100mg/kg(救必应酸高剂量组/救必应酸-100mg/kg)两个剂量均能显著降低脂变评分(p＜0.001)、炎症评分(p＜0.001)和总评分(p＜0.001)，脂变评分均降低为0，炎症评分均降低至0.25，总评分降低至0.25。阳性药gs0976(gs0976-10mg/kg)降低炎症评分至0.43，可见救必应酸在改善炎症方面优于阳性药gs0976。
表5各组动物肝脏nas评分变化
*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001vsmodel
由此可见，救必应酸对高脂高胆固醇胆盐饮食诱导的小鼠nash模型有一定的治疗作用，可以显著降低肝脏甘油三酯和胆固醇水平，且对炎症有很好的改善，可应用于治疗非酒精性脂肪性肝病药物的制备，尤其是应用于治疗非酒精性脂肪性肝炎药物的制备。
以上所述仅以实施例来进一步说明本发明的技术内容，以便于读者更容易理解，但不代表本发明的实施方式仅限于此，任何依本发明所做的技术延伸或再创造，均受本发明的保护。
1.一种救必应酸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，
s1救必应苷的富集：分别取救必应粗提取物、醇溶液和活性炭并混合到一起，回流状态下搅拌混合物1-3h；然后过滤并浓缩滤液，接着在搅拌下向浓缩液中逐滴滴加水至无白色固体析出，过滤并烘干后得到救必应苷富集物；
s2救必应酸的合成：分别取救必应苷富集物和甲醇并混合到一起，回流混合物至救必应苷富集物完全溶解，然后向混合物中滴加碱溶液并继续回流至混合物中的救必应苷反应完全；混合物冷却至室温后用盐酸调节其ph至2-5，然后过滤收集沉淀，沉淀用水洗涤后烘干，得到救必应酸粗品；
s3救必应酸的纯化：取救必应酸粗品，以低碳醇为溶剂进行重结晶，过滤并干燥后得到救必应酸；所述救必应酸的纯度大于或等于98％。
2.根据权利要求1所述的救必应酸的制备方法，其特征在于，步骤s1中，所述醇溶的质量为救必应粗提取物的6-10倍。
3.根据权利要求2所述的救必应酸的制备方法，其特征在于，步骤s1中，所述活性炭的质量为救必应粗提取物的0.1倍。
4.根据权利要求1所述的救必应酸的制备方法，其特征在于，步骤s1中，滤液按每取1g救必应粗提取物原料浓缩为1ml的程度进行浓缩。
5.根据权利要求4所述的救必应酸的制备方法，其特征在于，步骤s1中，向浓缩液中滴加水的质量为浓缩液重量的2-3倍。
6.根据权利要求1所述的救必应酸的制备方法，其特征在于，步骤s2中，所述甲醇的质量为救必应苷富集物的4倍以上。
7.根据权利要求1所述的救必应酸的制备方法，其特征在于，步骤s2中，所述碱溶液为氢氧化钠溶液，氢氧化钠的质量为救必应苷富集物的0.1倍以上。
8.根据权利要求1所述的救必应酸的制备方法，其特征在于，步骤s2中，用质量百分浓度为10％的盐酸调节冷却后混合物的ph。
9.根据权利要求1所述的救必应酸的制备方法，其特征在于，步骤s2中，所述碱溶液的浓度为2mol/l。
10.救必应酸在制备治疗非酒精性脂肪性肝炎药物中的应用。
技术总结