本发明属于天然产物提取领域，具体涉及具有抑菌活性的无患子皂苷单体及其分离纯化方法。
背景技术：
无患子，亦称洗手果、油罗树，其根、皮、叶、果皮、种子等均具有很强的药用价值，是不可多得的自然资源。研究表明，无患子果皮中含有丰富的皂苷成分，皂苷主要由皂苷元与不同长度的糖链构成，其中糖链主要由羧基和葡萄糖、木糖等组成，具有较好的亲水性；皂苷元则具有一定的亲脂性，这一结构特性表明了无患子皂苷具有表面活性作用。除了优良的表面活性作用外，无患子皂苷还具有抑菌、抗氧化、抗肿瘤、灭螺、杀虫、保肝以及提高药效等生理活性。大量文献表明，无患子皂苷的抑菌作用具有广谱性，本课题组前期也开展了无患子粗提物抑菌活性筛选和机理探究等方面，上述研究验证了无患子皂苷具有抑菌活性作用。然而，目前无患子的抑菌活性研究仍停留在粗体物或分级物层面，鲜有文献报道无患子皂苷单体的抑菌作用，从而造成产品质控无法量化检测等问题。
经查阅文献，中国专利cn104744555a公开了一种从无患子果皮中提取分离无患子皂苷b的方法，主要步骤包括干燥，粉碎，溶剂提取，大孔树脂分离，硅胶柱层析以及凝胶柱层析等，最后得到的产品虽纯度高，但是此法仅用于无患子皂苷b的单独提取，且并未对其活性进行表征。本发明通过活性追踪的方法，经过系统研究，最终得到具有抑菌活性的皂苷a和b。本发明的抑菌活性成分来源于植物材料，具有良好的环境相容性，安全高效等特点，可直接用于植物源抑菌剂的有效成分，或作为先导化合物进行结构修饰用于新型抑菌剂的开发，应用前景广阔。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种从无患子果皮中分离出具有抑菌活性单体的方法。
本发明的技术方案：
一种具有抑菌活性的无患子果皮皂苷单体的分离纯化方法，包括以下几个步骤：
1)将无患子干果皮粉碎，用蒸馏水提取，得到无患子水提液；
2)向无患子水提液中接种酿酒酵母和葡萄酒干酵母的混合菌种进行发酵，然后于蒸发设备中减压浓缩得到无患子皂苷浓缩液；
3)将无患子皂苷浓缩液上大孔树脂进行柱层析，以不同乙醇和水配比的混合洗脱液进行洗脱，得到无患子馏分；
4)无患子各馏分通过薄层色谱进行跟踪验证，选择合适的乙醇配比混合洗脱液馏分进行三次硅胶柱层析，最终得到无患子皂苷a和无患子皂苷b。
进一步的，步骤1)中无患子干果皮粉碎至20～40目，提取三次，三次提取的料液比为1:3，1:2，1:2，提取时间分别为4:3:2，温度控制在50-65℃。
进一步的，步骤2)所用的混合菌种酿酒酵母和葡萄酒干酵母的质量比为1:1～1:4，混合菌种的接种量为1.5％，发酵时间4d，温度为30℃。
进一步的，进行四次硅胶柱层析的过程具体为：
第一次硅胶柱层析：
采用大孔树脂填料为ab-8，采用乙醇:水的体积比是0:100，30:70，50:50，70:30，95:5的混合洗脱液进行乙醇浓度逐渐增加的梯度淋洗，以薄层色谱指导分离，收集各馏分并分别进行减压浓缩，馏分分别记为f1，f2，f3，f4，f5。
第二次硅胶柱层析：
用第一次硅胶柱层析的馏分f4，采用硅胶柱层析为ods-a，采用乙醇:水的体积比范围为45:55～95:5的混合洗脱液进行乙醇浓度逐渐增加的梯度淋洗，以薄层色谱指导分离，共收集8个馏分，减压浓缩，分别记为f4-1，f4-2，f4-3，f4-4，f4-5，f4-6，f4-7，f4-8。
第三次硅胶柱层析：
用第二次硅胶柱层析馏分为50％乙醇洗脱馏分f4-3，采用硅胶柱层析为ods-a，采用乙醇:水的体积比范围为45:55～70:30的混合洗脱液进行乙醇浓度逐渐增加的梯度淋洗，以薄层色谱指导分离，共收集5个馏分，减压浓缩，分别记为f4-3-1，f4-3-2，f4-3-3，f4-3-4，f4-3-5。馏分f4-3-4即无患子皂苷a。
第四次硅胶柱层析：
用第三次硅胶柱层析馏分为45％乙醇洗脱馏分f4-3-2，采用硅胶柱层析为ods-a，采用乙醇:水的体积比范围为45:55～70:30的混合洗脱液进行乙醇浓度逐渐增加的梯度淋洗，以薄层色谱指导分离，共收集4个馏分，减压浓缩，分别记为f4-3-2-1，f4-3-2-2，f4-3-2-3，f4-3-2-4。馏分f4-3-2-4即无患子皂苷b。
进一步的，薄层色谱验证的方法为：在薄层板上点样后，在烧杯中展开，展开溶剂为正丁醇:水:冰醋酸的体积比为5:4:1，展开后的薄层板在显色剂中显色，显色剂为：甲醇:冰醋酸:浓硫酸:对甲氧基苯甲醛＝17:2:1:0.1,v/v。
进一步的，采用上述方法制得的无患子皂苷a和无患子皂苷b为三萜皂苷，分别带有两个和三个糖基，分子式分别为c41h66o12和c46h74o16。二者结构式分别如下：
进一步的，采用上述方法制得的无患子皂苷单体的应用，具体为：无患子皂苷a和无患子皂苷b对于藤黄微球菌、表皮葡萄球菌、蜡状芽孢杆菌均具有抑制作用，无患子皂苷a的mic为0.025～0.1mg/ml，无患子皂苷b的mic为0.1～0.2mg/ml。
进一步的，采用上述方法制得的无患子皂苷单体的应用，具体为：无患子皂苷a和无患子皂苷b具有协同抑菌作用，对藤黄微球菌的mic为0.0063/0.025(无患子皂苷a/b)，fic指数为0.5。
本发明用于保护利用本方法分离纯化得到的无患子果皮中抑菌活性单体。
本发明的优点在于：采用本发明的方法分离纯化得到的抑菌活性单体无患子皂苷a和b，来源于植物材料，具有良好的环境相容性，安全高效等特点，可直接用于植物源抑菌剂的有效成分，或作为先导化合物进行结构修饰用于新型抑菌剂的开发，应用前景广阔。同时，这两种抑菌单体在高温高压下具有较好的稳定性，这与许多对温度敏感的抑菌剂相比有很大的优势。
附图说明
图1为柱层析分离后薄层色谱进行验证的示意图。其中1、2、3、4分别表示无患子水提发酵浓缩液、ab-8大孔树脂70％乙醇洗脱馏分、无患子皂苷a和无患子皂苷b。
图2为无患子皂苷a的ms结果。
图3为无患子皂苷b的ms结果。
图4为无患子皂苷a的13c-nmr谱图。
图5为无患子皂苷b的13c-nmr谱图。
图6为无患子皂苷a和无患子皂苷b的分离流程图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施方式做进一步的详细描述，但这些实施例不得理解为任何意义上的对本发明权利要求的限制。
实施例1无患子皂苷单体的分离纯化方法
1)制备无患子水提液：将无患子干果皮粉碎至30目，在60℃的条件下将此粉末与水按质量比1:3提取4h，过滤得到第一次滤液和滤渣。在同样的温度条件下，将滤渣再与水按1:2的比例提取3h，过滤得到第二次滤液和滤渣。在60℃的条件下，将第二次滤渣与水按1:2的质量比例混合提取2h，过滤得到第三次滤液，弃去滤渣。合并三次的滤液，得到无患子皂苷粗滤液。将无患子皂苷粗滤液以4500r/min离心10min得到无患子水提液。
2)制备无患子水提发酵浓缩液：以1.5％为接种量，向无患子皂苷浓缩液中接种酿酒酵母和葡萄酒干酵母的混合菌种(质量比为1:2)，在30℃下发酵4d；过滤除渣，并将发酵液于8000rpm离心10min，然后通过蒸发设备浓缩得到无患子水提发酵浓缩液。
3)大孔树脂柱层析：将无患子水提发酵浓缩液上ab-8大孔树脂进行柱层析，采用乙醇:水的体积比是0:100，30:70，50:50，70:30，95:5的混合洗脱液进行乙醇浓度逐渐增加的梯度淋洗，以薄层色谱指导分离，收集各馏分并分别进行减压浓缩，分别记为f1，f2，f3，f4，f5。
4)硅胶柱层析：将其中体积百分含量为70％乙醇洗脱馏分(f4)上ods-a硅胶柱进行分离，采用乙醇:水的体积比范围是45:55～95:5的混合液进行乙醇浓度逐渐增加的梯度淋洗，以薄层色谱指导分离，共收集8个馏分，减压浓缩，分别记为f4-1，f4-2……f4-8。将上述步骤中体积百分含量为45％乙醇洗脱馏分(f4-3)再一次上ods-a硅胶柱进行分离，采用乙醇:水的体积比范围是45:55～70:30的混合液进行乙醇浓度逐渐增加的梯度淋洗，以薄层色谱指导分离，共收集5个馏分，减压浓缩，分别记为f4-3-1，f4-3-2，f4-3-3，f4-3-4，f4-3-5。用第三次硅胶柱层析馏分为45％乙醇洗脱馏分f4-3-2，采用硅胶柱层析为ods-a，采用乙醇:水的体积比范围为45:55～70:30的混合洗脱液进行乙醇浓度逐渐增加的梯度淋洗，以薄层色谱指导分离，共收集4个馏分，减压浓缩，分别记为f4-3-2-1，f4-3-2-2，f4-3-2-3，f4-3-2-4。其中较纯的单一物质馏分为f4-3-4和f4-3-2-4，薄层色谱结果如图1所示。进一步将二者通过高分辨质谱和核磁共振分析，质谱结果和核磁共振13c-nmr谱图结果分别如图2、3、4和5所示。两种皂苷单体分子式分别为c41h66o12和c46h74o16，最终解析出二者结构为：
实施例2考察无患子皂苷单体的抑菌活性
实验菌株采用藤黄微球菌、表皮葡萄球菌和蜡状芽孢杆菌，在上述菌株的营养琼脂斜面上挑取1环接入新鲜液体培养基中，37℃摇床振荡(转速120r/min)培养至对数期。用接种环蘸取1环在营养琼脂平板培养基上划线，37℃静置培养24h后从其上挑取菌落，采用麦氏比浊法用无菌生理盐水稀释成菌液浓度约为106cfu/ml的菌液待用。
将10支灭菌试管排成一列、编号，各加入双倍营养的液体培养基1ml，在第一管内加入1ml待测样品，混匀后吸取1ml到第2管，混匀再取1ml到第3管，依次类推到第9管，弃去1ml，第10管不加提取物作空白对照。每管加入上述配制好的菌悬液1ml，混匀，置于37℃静置培养24h。然后各取1ul溶液点种在固体培养基上，24h后观察有无菌落生长。结果判定：培养基表面无菌落表示无细菌生长，有菌落表示有细菌生长，以能抑制细菌生长的无患子皂苷单体的最高稀释度作为其最低抑菌浓度(mic)，以0.85％生理盐水作为阴性对照，氨苄青霉素溶液作为阳性对照。
fic指数的计算：fic指数＝mic甲药联用/mic甲药单用 mic乙药联用/mic乙药单用
无患子皂苷a对藤黄微球菌、表皮葡萄球菌、蜡状芽孢杆菌均具有抑制作用，mic分别为0.025、0.05和0.1mg/ml；无患子皂苷b对上述三种菌的mic则分别为0.1、0.1和0.2mg/ml。以上数据表明，藤黄微球菌对两种皂苷单体最敏感，因此对应的mic值最低。此外，无患子皂苷a的抑菌活性优于无患子皂苷b，分析原因可能是因为二者的糖基数目不同，已有文献报道无患子皂苷的侧链的糖基数目与抑菌活性有关。此外，无患子皂苷a与b还具有协同抑菌作用，对藤黄微球菌的mic为0.0063/0.025(无患子皂苷a/b)，fic指数为0.5。详见表1。
表1无患子皂苷a和b的mic和fic值
注：fic≤0.5，协同作用；0.5≤fic≤1，相加作用；1≤fic≤2，无关作用；fic>2，拮抗作用。
上述实施方式旨在举例说明本发明可为本领域专业技术人员实现和可用，对上述实施方式进行修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，故本发明包括但不限于上述实施方式，任何符合本权利要求书或说明书描述，符合与本文所公开的原理和新颖性、创造性特点的方法、工艺、产品、均落入本发明的保护范围之内。
1.具有协同抑菌活性的无患子皂苷单体的分离纯化方法，其特征在于，包括以下几个步骤：
1)将无患子干果皮粉碎，用蒸馏水提取，得到无患子水提液；
2)向无患子水提液中接种酿酒酵母和葡萄酒干酵母的混合菌种进行发酵，然后于蒸发设备中减压浓缩得到无患子皂苷浓缩液；
3)将无患子皂苷浓缩液上大孔树脂进行柱层析，以不同乙醇和水配比的混合洗脱液进行洗脱，得到无患子馏分；
4)无患子各馏分通过薄层色谱进行跟踪验证，选择合适的乙醇配比混合洗脱液馏分进行三次硅胶柱层析，最终得到无患子皂苷a和无患子皂苷b。
2.如权利要求书1所述的方法，其特征在于，步骤1)中无患子干果皮粉碎至20～40目，提取三次，三次提取的料液比为1:3，1:2，1:2，提取时间分别为4:3:2，温度控制在50-65℃。
3.如权利要求书1或2所述的方法，其特征在于，步骤2)所用的混合菌种酿酒酵母和葡萄酒干酵母的质量比为1:1～1:4，混合菌种的接种量为1.5％，发酵时间4d，温度为30℃。
4.如权利要求书1或2所述的方法，其特征在于，进行四次硅胶柱层析的过程具体为：
第一次硅胶柱层析：
采用大孔树脂填料为ab-8，采用乙醇:水的体积比是0:100，30:70，50:50，70:30，95:5的混合洗脱液进行乙醇浓度逐渐增加的梯度淋洗，以薄层色谱指导分离，收集各馏分并分别进行减压浓缩，馏分分别记为f1，f2，f3，f4，f5；
第二次硅胶柱层析：
用第一次硅胶柱层析的馏分f4，采用硅胶柱层析为ods-a，
采用乙醇:水的体积比范围为45:55～95:5的混合洗脱液进行乙醇浓度逐渐增加的梯度淋洗，以薄层色谱指导分离，共收集8个馏分，减压浓缩，分别记为f4-1，f4-2，f4-3，f4-4，f4-5，f4-6，f4-7，f4-8；
第三次硅胶柱层析：
用第二次硅胶柱层析馏分为50％乙醇洗脱馏分f4-3，采用硅胶柱层析为ods-a，采用乙醇:水的体积比范围为45:55～70:30的混合洗脱液进行乙醇浓度逐渐增加的梯度淋洗，以薄层色谱指导分离，共收集5个馏分，减压浓缩，分别记为f4-3-1，f4-3-2，f4-3-3，f4-3-4，f4-3-5；馏分f4-3-4即无患子皂苷a；
第四次硅胶柱层析：
用第三次硅胶柱层析馏分为45％乙醇洗脱馏分f4-3-2，采用硅胶柱层析为ods-a，
采用乙醇:水的体积比范围为45:55～70:30的混合洗脱液进行乙醇浓度逐渐增加的梯度淋洗，以薄层色谱指导分离，共收集4个馏分，减压浓缩，分别记为f4-3-2-1，f4-3-2-2，f4-3-2-3，f4-3-2-4；馏分f4-3-2-4即无患子皂苷b。
5.如权利要求书3所述的方法，其特征在于，进行四次硅胶柱层析的过程具体为：
第一次硅胶柱层析：
采用大孔树脂填料为ab-8，采用乙醇:水的体积比是0:100，30:70，50:50，70:30，95:5的混合洗脱液进行乙醇浓度逐渐增加的梯度淋洗，以薄层色谱指导分离，收集各馏分并分别进行减压浓缩，馏分分别记为f1，f2，f3，f4，f5；
第二次硅胶柱层析：
用第一次硅胶柱层析的馏分f4，采用硅胶柱层析为ods-a，采用乙醇:水的体积比范围为45:55～95:5的混合洗脱液进行乙醇浓度逐渐增加的梯度淋洗，以薄层色谱指导分离，共收集8个馏分，减压浓缩，分别记为f4-1，f4-2，f4-3，f4-4，f4-5，f4-6，f4-7，f4-8；
第三次硅胶柱层析：
用第二次硅胶柱层析馏分为50％乙醇洗脱馏分f4-3，采用硅胶柱层析为ods-a，采用乙醇:水的体积比范围为45:55～70:30的混合洗脱液进行乙醇浓度逐渐增加的梯度淋洗，以薄层色谱指导分离，共收集5个馏分，减压浓缩，分别记为f4-3-1，f4-3-2，f4-3-3，f4-3-4，f4-3-5；馏分f4-3-4即无患子皂苷a；
第四次硅胶柱层析：
用第三次硅胶柱层析馏分为45％乙醇洗脱馏分f4-3-2，采用硅胶柱层析为ods-a，采用乙醇:水的体积比范围为45:55～70:30的混合洗脱液进行乙醇浓度逐渐增加的梯度淋洗，以薄层色谱指导分离，共收集4个馏分，减压浓缩，分别记为f4-3-2-1，f4-3-2-2，f4-3-2-3，f4-3-2-4；馏分f4-3-2-4即无患子皂苷b。
6.如权利要求书1、2或5任一项所述的方法，其特征在于，薄层色谱验证的方法为：在薄层板上点样后，在烧杯中展开，展开溶剂为正丁醇:水:冰醋酸的体积比为5:4:1，展开后的薄层板在显色剂中显色，显色剂为：甲醇:冰醋酸:浓硫酸:对甲氧基苯甲醛＝17:2:1:0.1,v/v。
7.如权利要求书4任一项所述的方法，其特征在于，薄层色谱验证的方法为：在薄层板上点样后，在烧杯中展开，展开溶剂为正丁醇:水:冰醋酸的体积比为5:4:1，展开后的薄层板在显色剂中显色，显色剂为：甲醇:冰醋酸:浓硫酸:对甲氧基苯甲醛＝17:2:1:0.1,v/v。
8.根据权利要求1～7任一所述的方法制得的无患子皂苷单体，其特征在于，无患子皂苷a和无患子皂苷b为三萜皂苷，分别带有两个和三个糖基，分子式分别为c41h66o12和c46h74o16；二者结构式分别如下：
9.根据权利要求1～7任一所述的方法制得的无患子皂苷单体的应用，其特征在于，无患子皂苷a和无患子皂苷b对于藤黄微球菌、表皮葡萄球菌、蜡状芽孢杆菌均具有抑制作用，无患子皂苷a的mic为0.025～0.1mg/ml，无患子皂苷b的mic为0.1～0.2mg/ml。
10.根据权利要求1～7任一所述的方法制得的无患子皂苷单体的应用，其特征在于，无患子皂苷a和无患子皂苷b具有协同抑菌作用，对藤黄微球菌的mic为0.0063/0.025，fic指数为0.5。
技术总结