本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种抗皮肤光损伤保护活性多肽rl-pl9及其应用。
背景技术：
紫外线辐射（uv）是存在于环境中重要的物理因素之一，并且是造成人类皮肤损伤的最主要的环境致病因素之一。随着地球臭氧层的消耗，人类预期寿命的延长与现代生活方式的改变可能会进一步增加紫外线相关皮肤损伤的可能性与严重性。而当紫外线辐射于人体表面皮肤后，皮肤癌是其能造成最严重的皮肤损伤，据报道，90%皮肤相关新病例的出现可能与紫外线照射密切相关。在紫外线的整体辐射下，其含有的波长为280-320nm的uvb射线对皮肤伤害最为密切。长时间积累的uvb辐射会造成皮肤老化、损伤及癌症的发生，引起越来越多人的关注。
在这样的环境下，抗氧化剂的出现推动了人类抗紫外线，尤其是uvb的发展。近年来，多种抗氧化剂被大量开发应用成化妆品、保健品甚至药物。但因它们各自有各自的优势与劣势，无法做到相对完美，所以对于人类对抗氧化剂需求是杯水车薪的。由此人们的目光也聚焦在寻找与开发天然高活性的抗氧化剂。
技术实现要素：
本发明的第一目的在于提供一种抗皮肤光损伤保护活性多肽rl-pl9；第二目的在于提供所述的抗皮肤光损伤保护活性多肽rl-pl9的应用。
本发明的第一目的是这样实现的，所述的抗皮肤光损伤保护活性多肽rl-pl9的氨基酸序列为plepckwrk。
本发明所述的抗皮肤光损伤保护活性多肽rl-pl9的鉴定步骤如下：
a、采集活体泽蛙皮肤（物料a）；
b、提取总rna，并用按标准程序纯化mrna，用智能cdna文库构建试剂盒合成cdna；
c、利用聚合酶链反应技术得到产物b，并将产物b用dna凝胶提取试剂盒回收，克隆到大肠杆菌活性细胞中，构建特异性cdna文库；
d、用abi433a肽合成器通过固相合成法合成目标物抗皮肤光损伤保护活性多肽rl-pl9。
本发明的第二目的是这样实现的，所述的抗皮肤光损伤保护活性多肽rl-pl9在制备抗光损伤化妆品、保健食品和药品中的应用。
多肽药物由于其高活性、高特异性和易大量合成的特点被人们所关注。而作为多肽类药物重要来源之一的两栖类动物各类分泌物在被越来越多的提取与尝试，并且人们发现这些多肽类药物在生物医药方面有着显著应用前景。本发明基于两栖类动物泽蛙的皮肤cdna文库，并从中鉴定活性多肽——rl-pl9，关注于其具有的抗光损伤修复功能与抗氧化应激功能。实验证明rl-pl9可以有效保护皮肤抵抗紫外辐射带来的氧化应激与损伤，所以，抗皮肤光损伤活性多肽rl-pl9的发现与应用具有重要的生物医药领域意义，可为新型抗氧化剂的发现与合成提供有益候选药物模版。
本发明是源于泽蛙的皮肤分泌物中所获得的一种具有抵抗皮肤光损伤和氧化应激的天然活性多肽rl-pl9，该多肽展示出明显的抵抗紫外线辐射及氧化应激给皮肤和细胞带来伤害的活性，表明本发明抗皮肤光损伤保护活性多肽rl-pl9有较好的生物医药技术发展前景。本发明所述的抗皮肤光损伤保护活性多肽rl-pl9可作为抗紫外线药物的有益模版及候选原产品。
附图说明
图1为本发明抗光损伤多肽rl-pl9的体外dpph、no、abts 清除率图；
图2为本发明抗光损伤多肽rl-pl9对hacat细胞活力影响图；
图3为本发明抗光损伤多肽rl-pl9在细胞水平超氧化物歧化酶和还原性谷胱甘肽表达图；
图4为本发明抗光损伤多肽rl-pl9对动物uvb损伤模型的保护作用；
图5为本发明抗光损伤多肽rl-pl9对动物模型真皮与表皮的保护作用；
图6为本发明抗光损伤多肽rl-pl9在组织中丙二醛与过氧化氢酶水平表达图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明所述的抗皮肤光损伤保护活性多肽rl-pl9的氨基酸序列为plepckwrk。
本发明所述的抗皮肤光损伤保护活性多肽rl-pl9的鉴定步骤如下：
a、采集活体泽蛙皮肤（物料a）；
b、提取总rna，并用按标准程序纯化mrna，用智能cdna文库构建试剂盒合成cdna；
c、利用聚合酶链反应技术得到产物b，并将产物b用dna凝胶提取试剂盒回收，克隆到大肠杆菌活性细胞中，构建特异性cdna文库；
d、用abi433a肽合成器通过固相合成法合成目标物抗皮肤光损伤保护活性多肽rl-pl9。
本发明的应用为所述的抗皮肤光损伤保护活性多肽rl-pl9在制备抗光损伤化妆品、保健食品和药品中的应用。
下面以具体实施案例对本发明做进一步说明：
实施例1
1.样品收集和动物护理
泽蛙被分笼安置于容器中，并有足够面包虫可供其自由饮食。容器被放置于实验室中12/12小时明暗循环空调室中。实验前用去离子水清洗泽蛙皮肤表面后，通过快速捣毁延髓处死泽蛙、剥离其皮肤，快速浸入到预先准备好的液氮中保存，待下一步实验。
2.纯化程序
将剥离的皮肤置于液氮中研磨至粉末，并用rnaiso（takara，大连，中国）提取总rna。并用mrna纯化试剂盒（stratagene，加拿大）按标准程序纯化mrna。用cdna文库构建试剂盒（clontech，大连，中国）合成cdna文库。通过聚合酶链式反应（pcr技术）在92°c下进行3分钟，然后在90°c下进行30个10秒的循环，在60°c下进行30秒的循环，在78°c下进行30秒的循环，所得产物用dna凝胶提取试剂盒（bioteke，北京，中国）回收，然后连接到pmd19-t载体（takara，大连，中国）中。最后，利用42℃热刺激法将pcr产物克隆到大肠杆菌dh5a活性细胞中，构建了特异的cdna文库。从每个特定的cdna文库中随机选择插入量大于300bp的30个克隆，在abi3730xldna测序仪（美国加利福尼亚应用生物系统公司）上进行dna测序。
3.肽一级结构测定
dna测序结果返回后，通过生物信息学手段，在ncbi数据里进行数据比对，确定其成熟肽序列。
4.rl-pl9对uvb辐射和过氧化氢刺激下的hacat细胞的活性影响
细胞活力（mts）实验：用磷酸盐缓冲液洗涤细胞3次，分为uvb照射模型组、空白组和样品组，接种于96孔板（3000-5000个/孔）中。在暴露于9w/01uvb灯（飞利浦，荷兰）后，于37℃下用不同浓度的rl-pl9（1、5和10μm）或10μmvc（sigma，圣路易斯，密苏里州，美国）预处理样品组细胞2h后进行30mj/cm2uvb辐射或200μm过氧化氢刺激（2h）。24小时后，将20μlmts（promega，madison，wi，usa）加入到培养基中再培养2-4h，于490nm的测试波长下测定rl-pl9和vc对hacat细胞活力的影响。
5.rl-pl9对uvb辐射或过氧化氢刺激下hacat细胞中超氧化物歧化酶与还原性谷胱甘肽水平的影响
细胞种于6孔板，并分为uvb照射组、过氧化氢处理组、空白组和样品组，用多rl-pl9或vc（浓度均为10μm）处理细胞2小时后，进行uvb辐射（30mj/cm2）或过氧化氢刺激（200μm，2h）。24小时后，用pbs清洗细胞三次，用细胞裂解液进行冰上裂解10分钟，收集裂解液在12000g下4℃离心15min，收集上清液进行超氧化物歧化酶与还原性谷胱甘肽水平检测。试剂盒均为南京建成生物工程研究所公司提供。所有实验程序均按照公司提供的标准规程操作。
6.rl-pl9对小鼠皮肤光损伤的保护活性
育养18-22g雌性昆明小鼠，分为4组：正常组、uvb辐射模型组、rl-pl9治疗组、维生素c治疗组。
uvb辐射模型制造：将小鼠背部皮肤脱毛，然后在前7天暴露于uvb照射（uvb灯，tl20w/12，飞利浦）150mj/cm2/天，在随后的2周内每隔一天暴露于300mj/cm2/天。用紫外辐射计（tm-213，tenmars，中国台湾）监测辐射强度。rl-pl9（10μm）或vc（10μm）（均为液体）在小鼠皮肤照射部位每日一次进行涂抹治疗。最后一次紫外线照射后，处死小鼠，取下背部无毛皮肤迅速收集。一部分固定石蜡包埋皮肤进行h&e、masson染色，另一部分皮肤于冰上匀浆待检测丙二醛和过氧化氢酶水平。
h&e染色、masson染色：皮肤组织在4%多聚甲醛中固定24-48小时，从70%至100%无水乙醇中再水化，然后在二甲苯中再次溶解，最后在石蜡中包埋。为了进行组织学分析，组织样品被切成6μm厚的切片，用h&e试剂和masson试剂盒（solarbio，北京，中国）染色。
丙二醛、过氧化氢酶水平检测：将0.1g皮肤组织在1ml冷pbs中均匀化3min，然后在4℃下10000g离心15min，收集上清液用于测定丙二醛和过氧化氢酶水平。所有实验程序均按照公司（南京建城生物工程所）提供的标准规程操作。
结果如下列图片所示，具体说明如下：如图1所示，抗光损伤活性多肽rl-pl9在体外有明显的dpph、no、abts 清除率。抗光损伤活性多肽rl-pl9本身不影响细胞活性（图2中的a），但起可以显著提高由uvb辐射或过氧化氢刺激引起的hacat细胞活力降低（图2中的b，c）。当hacat细胞受到uvb辐射或过氧化氢刺激后，细胞内的超氧化物歧化酶和还原性谷胱甘肽被大量消耗，用活性多肽rl-pl9或vc预处理的细胞，其胞内二者的水平可以被有效保护（图3）。uvb辐射会造成小鼠皮肤老化、损伤、红斑的产生等，并且为了抵抗这些损伤性病理变化，表皮与真皮厚度会明显增加（图5中的a）。uvb辐射还会引起皮肤胶原纤维的减少（图5中的b）。局部应用活性多肽rl-pl9与vc会减少uvb辐射造成的小鼠背部皮肤损伤，加快损伤愈合（图4）。增加皮肤胶原纤维含量，应用rl-pl9与vc组的小鼠皮肤真皮和表皮厚度较uvb组明显降低（图5中的c，d）。如图6所示，比较正常组与uvb辐射组小鼠皮肤组织中丙二醛和过氧化氢酶水平，发现uvb辐射会使皮肤组织中的丙二醛水平明显升高，而过氧化氢酶水平明显降低。rl-pl9的应用会有效降低丙二醛的水平，升高过氧化氢酶的活性以此进行抗皮肤光损伤的保护作用。
sequencelisting
<110>昆明医科大学
<120>一种抗皮肤光损伤保护活性多肽rl-pl9及其应用
<130>2020
<160>1
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>9
<212>prt
<213>抗皮肤光损伤保护活性多肽rl-pl9的氨基酸序列
<400>1
proleugluprocyslystrparglys
15
1.一种抗皮肤光损伤保护活性多肽rl-pl9，其特征在于所述的抗皮肤光损伤保护活性多肽rl-pl9的氨基酸序列为plepckwrk。
2.一种权利要求1所述的抗皮肤光损伤保护活性多肽rl-pl9的的应用，其特征在于所述的抗皮肤光损伤保护活性多肽rl-pl9在制备抗光损伤化妆品、保健食品和药品中的应用。
技术总结