本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及靶向pkm2蛋白的抗肿瘤多肽及其应用。
背景技术：
：恶性肿瘤(癌症)已成为当今社会严重威胁人类健康的主要公共卫生问题之一，研发出更为高效药物用于肿瘤的诊断与治疗成为医药研究者们的重要任务。蛋白激酶被认为是人体内设计抗癌药物的重要靶标群，蛋白激酶密切参与细胞内信号转导和能量交换等多种生命活动，在维持细胞功能以及人体代谢中扮演着必不可少的角色。与正常细胞不同，癌细胞的能量代谢途径为有氧糖酵解，这种低产能的代谢方式使癌细胞表现为高水平葡萄糖摄取，糖酵解的中间产物作为核酸、脂质、蛋白等生物大分子的合成原料，满足其快速增殖生长的需求。丙酮酸激酶m2(pyruvatekinaseisozymetypem2，pkm2)作为癌细胞中糖酵解最后一步的限速酶催化磷酸烯醇式丙酮酸转化为丙酮酸并产生atp。并且pkm2在癌细胞中特异性表达(正常细胞丙酮酸酶表达为pkm1亚型)，其被证明在癌细胞的代谢与生长是中至关重要。因此，pkm2蛋白成为了肿瘤治疗的一个新型药物靶标。目前，虽然国内外针对pkm2蛋白的抗癌研究已经取得一定成果，但是以pkm2为靶点研究仅限于非多肽类的有机合成小分子，这些小分子药物存在着水溶性差、与靶蛋白亲和力能力有限的缺点，很大程度的限制了小分子的应用价值。目前针对pkm2多肽类药物的研究非常有限，多肽具有水溶性好，药理活性强，生物相容性好的优势，相比于小分子药物更有优势。针对疾病相关分子靶点的活性化合物的识别是早期药物发现中一项非常重要的任务，高通量筛选活性先导药物是实现这一目的的重要方法。因此，构建以pkm2蛋白为靶点的高效药物筛选方法，快速发现亲和力高、特异性强靶向多肽类药物成为开发抗肿瘤药物具有重要的研究意义与社会意义。技术实现要素：为了克服现有pkm2非多肽类的有机合成小分子药物存在水溶性差、与靶蛋白亲和力能力有限等不足，本发明的第一方面的目的，在于提供一种靶向pkm2蛋白的抗肿瘤多肽。本发明的第二个方面的目的，在于提供上述靶向pkm2蛋白的抗肿瘤多肽在制备诊断肿瘤的试剂盒中的应用。本发明的第三个方面的目的，在于提供一种诊断肿瘤的试剂盒。本发明的第四个方面的目的，在于提供上述靶向pkm2蛋白的抗肿瘤多肽在制备治疗肿瘤的药物中的应用。本发明的第五个方面的目的，在于提供一种治疗肿瘤的药物。本发明的第六个方面的目的，在于提供靶向pkm2蛋白的抗肿瘤多肽的筛选方法。为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：本发明的第一个方面，提供靶向pkm2蛋白的抗肿瘤多肽，所述多肽的氨基酸序列为kg-py-eq(seqidno.1)、kg-py-iw(seqidno.2)、hw-py-kw(seqidno.3)、nk-py-ge(seqidno.4)、rd-py-ly(seqidno.5)、hv-py-sr(seqidno.6)、pe-py-yr(seqidno.7)、de-py-fq(seqidno.8)中的至少一种；其中py表示磷酸化酪氨酸。所述肿瘤为肝癌、乳腺癌中的至少一种。本发明的第二个方面，提供上述靶向pkm2蛋白的抗肿瘤多肽在制备诊断肿瘤的制剂中的应用。所述肿瘤为肝癌、乳腺癌中的至少一种。本发明的第三个方面，提供一种诊断肿瘤的试剂盒，包含上述靶向pkm2蛋白的抗肿瘤多肽。所述肿瘤为肝癌、乳腺癌中的至少一种。本发明的第四个方面，提供上述靶向pkm2蛋白的抗肿瘤多肽在制备治疗肿瘤的药物中的应用。所述肿瘤为肝癌、乳腺癌中的至少一种。本发明的第五个方面，提供一种治疗肿瘤的药物，包含上述靶向pkm2蛋白的抗肿瘤多肽。所述肿瘤为肝癌、乳腺癌中的至少一种。所述药物还包含药学上可接受的辅料。本发明的第六个方面，提供靶向pkm2蛋白的抗肿瘤多肽的筛选方法，包括如下步骤：(1)利用一珠一化合物法构建磷酸化酪氨酸多肽库；(2)将步骤(1)的磷酸化酪氨酸多肽与pkm2蛋白孵育，筛选得到具有特异性结合pkm2蛋白的磷酸化酪氨酸多肽。步骤(1)中所述磷酸化酪氨酸多肽的结构通式为aa5aa4-py-aa2aa1；所述aan(n＝1、2、4、5)为l型天然氨基酸；所述py为磷酸化酪氨酸。所述磷酸化酪氨酸多肽的合成方法，包括如下步骤：s1：将树脂与fmoc-氨基酸(fmoc-met)、o-苯并三氮唑-n,n,n’,n’-四甲基脲四氟硼酸酯(tbtu)、二异丙基乙胺(diea)混合，进行偶联反应，清洗；s2：将步骤s1中清洗后的树脂均分后，脱保护，清洗，再加入fmoc-met、tbtu、diea混合，进行偶联反应，清洗；s3：将步骤s2中清洗后的树脂全部混合，重复步骤s2，直至第五个fmoc-氨基酸完成偶联反应；然后，加入三氟乙酸-水-三异丙基硅烷，剪切，得到。步骤(1)中所述磷酸化酪氨酸多肽库包含204条多肽序列，且不具偏好性。步骤(2)中所述pkm2蛋白优选标记有荧光基团。步骤(2)中所述孵育的时间优选为8～14h。步骤(2)中所述筛选为根据荧光信号筛选。本发明的有益效果是：本发明基于“一珠一化合物(onebeadonecompound，oboc)”筛选了靶向pkm2蛋白的高亲和力、高选择性的抗肿瘤多肽，可用于诊断肿瘤；同时，该靶向pkm2蛋白的抗肿瘤多肽对肝癌细胞、乳腺癌细胞的生长增殖具有抑制作用，可用于治疗肿瘤。本发明提供的靶向pkm2蛋白的抗肿瘤多肽的筛选方法，相比于普通的小分子化合物库，oboc多肽库数量以及种类更为丰富，为发现活性药物提供更大的可能性，并且不需要对化合物单独合成纯化，克服了传统筛选方法步骤繁琐、筛选速度慢和效率低的缺点，具有效率高、样本含量大、成本低廉的特点。附图说明图1是靶向pkm2蛋白的抗肿瘤多肽(f06、d07)的浓度-信号曲线图：其中，a为f06的浓度-信号曲线图；b为d07的浓度-信号曲线图。图2是乳腺癌细胞mcf-7在不同浓度的靶向pkm2蛋白的抗肿瘤多肽(f06、d07、g12、d13)下的存活率图。图3是肝癌细胞hepg2在不同浓度的靶向pkm2蛋白的抗肿瘤多肽(f06、d07、g12、d13)下的存活率图。图4是肝癌细胞huh7在不同浓度的靶向pkm2蛋白的抗肿瘤多肽(f06、d07、g12、d13)下的存活率图。图5是癌细胞(hepg2、mcf-7、huh7)在阴性含有磷酸化酪氨酸的多肽(h18、e01、c21、d23、h08)中的存活率图：其中，a为hepg2在阴性含有磷酸化酪氨酸的多肽(h18、e01、c21、d23、h08)中的存活率图；b为mcf-7在阴性含有磷酸化酪氨酸的多肽(h18、e01、c21、d23、h08)中的存活率图；c为huh7在阴性含有磷酸化酪氨酸的多肽(h18、e01、c21、d23、h08)中的存活率图。图6是fitc修饰的靶向pkm2蛋白的抗肿瘤多肽与与pkm2蛋白在细胞中的荧光共定位实验结果图。具体实施方式以下结合具体的实施例及附图对本发明的内容作进一步详细的说明。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。本发明通过多肽固相合成法与分聚策略的辅助构建oboc化合物库，其包含了204条不同序列的磷酸化酪氨酸多肽，用于筛选靶向pkm2的结合多肽。再通过oboc高通量筛选，快速识别与鉴定与pkm2相互作用的高亲和力多肽序列。此外，通过表面等离子体共振(spr)等动力学分析技术测定蛋白与多肽间的kd值，表征多肽与蛋白的结合强度，从而进一步筛选出高亲和力、高特异性的pkm2蛋白靶向多肽。最后通过体外细胞实验，进一步表征多肽的抗肿瘤效果，确证本发明中保护的多肽可作为pkm2介导肿瘤的候选治疗药物。实施例1靶向pkm2蛋白的抗肿瘤多肽的筛选(1)磷酸化酪氨酸多肽库的合成利用全自动多肽合成仪titan357(aapptec)合成五肽长度的磷酸化酪氨酸多肽化合物库，磷酸化酪氨酸多肽库的结构通式为：aa5aa4-py-aa2aa1-peg-r，(aa代表任一种l型天然氨基酸)。磷酸化酪氨酸多肽的通过“分列-聚合”的方法在tentagels-nh2树脂上以fmoc固相法合成，具体如下：首先称取一定量的树脂放置在聚合容器内(cv)用n-甲基吡咯烷酮(nmp)溶液溶胀2h，抽干溶液后加入1倍当量fmoc-氨基酸(fmoc-met)，2倍当量的o-苯并三氮唑-n,n,n’,n’--四甲基脲四氟硼酸酯(tbtu)，5倍当量的二异丙基乙胺(diea)，反应30min后用nmp洗涤4次；再加入含有20％哌啶的nmp溶液反应15min，脱保护，再分别用nmp和二氯甲烷(dcm)溶液各洗4次。将树脂清洗干净后均分置20个反应容器内(rv)。再向rv反应器中加入相对于树脂4倍当量的fmoc-氨基酸及4倍当量tbtu与8倍当量diea，20个rv反应器中各自加入不同的氨基酸，进行耦联反应。反应4h后，用nmp清洗4次，加入20％哌啶的nmp溶液脱保护30min，分别用nmp和dcm溶液各洗4次；再将rv反应器中的树脂转移并合并在cv反应器中，混匀后再次均分置20个rv中并重复上述耦联步骤，合成至第三个氨基酸时所有反应器均与磷酸化酪氨酸进行耦联反应，然后继续重复上述步骤至第5个氨基酸耦联结束。反应结束后将树脂转移至反应管中加入三氟乙酸-水-三异丙基硅烷(95:2.5:2.5，v/v/v)反应2h，过滤除去溶液，依次用dcm、甲醇、水冲洗9遍后用乙醚洗三次，减压干燥树脂。(2)蛋白表达纯化与染料标记将转染重组质粒(cat#:25360,pkm2；addgene公司)的大肠杆菌在5mllb培养基37℃，230rpm摇床中过夜培养，次日按照1:100的比例将大肠杆菌在200ml培养基中扩大培养，大肠杆菌的生长达到od600＝0.6～0.8，加入iptg(异丙基硫代半乳糖苷)诱导表达，iptg的工作浓度为0.1mm。加入iptg后在16℃，230rpm摇床中继续培养18～20h。诱导表达结束后，培养基3500rpm下离心10～15min，弃去菌液上清，收集大肠杆菌沉淀。pbs重悬沉淀后，利用超声破碎细菌外壳，在4℃条件下，4000rpm转速离心30min，将含有蛋白的上清液加到含有ni-nta树脂(his标签纯化树脂)的层析柱中，4℃下旋转反应1h。先用20mm咪唑pbs溶液大量冲洗柱中树脂，8～10遍后，加入2ml250mm咪唑pbs溶液洗脱目标蛋白，重复6～8遍。最后用超滤管进行蛋白换液与浓缩，并测定蛋白浓度。后续用于蛋白标记：将染料cy5用nhs(n-羟基琥珀酰亚胺)和edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)活化，然后取500μlpkm2蛋白(2mg/ml)的pbs溶液，与5倍当量的活化过的染料混合，溶解于dmso溶液中，在室温避光的条件下，混合反应1h，然后用尺寸排除色谱法纯化得到染料标记过的pkm2蛋白。(3)一珠一化合物(oboc)磁珠筛选oboc筛选实验中使用分选仪器copas(complexobjectparametricanalyzerandsorter)分离出目的多肽珠(一颗树脂等于一颗磁珠)。copas系统主要是利用荧光信号的不同区别阳性和阴性的多肽珠。如果多肽与蛋白间有高亲和力，有荧光标记的蛋白与多肽结合并附着在肽珠的表面，从而使肽珠具有相应的荧光。一旦检测器检测到相应的荧光，分选系统就会分离出那个阳性的肽珠到96孔板上，供后续的实验分析。具体步骤为：将步骤(1)合成的磷酸化酪氨酸五肽树脂转移到alltech容器(8ml，配备过滤器)中，并在封闭溶液(0.05％nan3、0.1％bsa，pbs溶液)中于360°摇床上25℃封闭培养1h。后将液体排干，把用染料标记的pkm2蛋白添加到溶液中，终浓度为100nm，并在360°摇床上4℃下孵育过夜。将液体排干，然后用封闭溶液将树脂洗涤三次，再用pbs缓冲液(含0.05％tween20)依次洗涤三次。洗涤后，将珠子转移到copasplus(unionbiometrica)的样品容器中，并用200mlpbs缓冲液(含0.05％tween20)稀释。之后会对树脂进行两次分选，阳性的珠子被直接分到96锥形孔板内。(4)阳性多肽剪切与质谱测序用氩气吹扫96锥形孔板15min，然后在每孔中加入10μl0.5m溴化腈溶液。经氩气吹扫15min后，将96孔板用薄膜密封，置于微波辐射下1min，所得溶液在45℃离心真空下浓缩2.5h；每孔分别加入7μl含4％α-氰-4-羟基肉桂(chca)的乙腈/水(1:1)溶液和7μl含0.1％三氟乙酸的乙腈/水(1:1)溶液，得到混合物。取2.5μl混合物点在384孔maldi板上，将得到的平板晾干15min。使用bruker公司的ultraflextrememaldi-tof/tof仪器的flexcontrol软件，通过自动采集方法获得每条多肽的质谱。在flexanalysis软件中手动识别每个质谱的母峰，并将其复制到flexcontrol中的数据表中，以自动获取ms/ms谱图。后用peaks软件对肽序列进行半自动分析。筛选到的亲和力多肽部分序列如表1所示。表1亲和力多肽序列编号多肽序列d13kg-py-eq(seqidno.1)d21kg-py-iw(seqidno.2)d07hw-py-kw(seqidno.3)e19nk-py-ge(seqidno.4)a10rd-py-ly(seqidno.5)g12hv-py-sr(seqidno.6)c01pe-py-yr(seqidno.7)f06de-py-fq(seqidno.8)注：py表示磷酸化酪氨酸。实施例2一种诊断肿瘤的试剂盒，包括kg-py-eq、kg-py-iw、hw-py-kw、nk-py-ge、rd-py-ly、hv-py-sr、pe-py-yr、de-py-fq中的至少一种；所述肿瘤为肝癌、乳腺癌中的至少一种。一种治疗肿瘤的药物，包括kg-py-eq、kg-py-iw、hw-py-kw、nk-py-ge、rd-py-ly、hv-py-sr、pe-py-yr、de-py-fq中的至少一种；所述肿瘤为肝癌、乳腺癌中的至少一种；所述药物还包括药学上可接受的辅料。对比例1本对比例的方法与实施例1相同，区别仅在于步骤(3)分选的为阴性的珠子，经测序，筛选到的阴性含有磷酸化酪氨酸的多肽如表2所示。表2阴性含有磷酸化酪氨酸的多肽序列注：py表示磷酸化酪氨酸。效果实施例1.多肽与蛋白间亲和力测定利用生物分子相互作用仪biocoret2000测定多肽与蛋白间亲和力：将纯化的pkm2蛋白通过氨基偶联的方式偶联到羧甲基化的葡聚糖生物传感器芯片(cm5gehealthcare)，用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)活化。具体如下：将蛋白(pkm2)用10mm乙酸钠(ph5.0)稀释至40μg/ml，之后以5μl/min的流速流过羧甲基化的葡聚糖生物传感器芯片偶联蛋白，以达到反应需要偶联蛋白质后，通过乙醇胺以封闭芯片上未反应的基团；将筛选到先导多肽(f06、d07)，用pbs稀释至不同浓度梯度(分别为10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0μm)后按顺序加入孔板，设定好程序，仪器自动进样执行相应的程序。结果如图1所示，f06、d07和pkm2蛋白之间的亲和力常数分别为5.87μm、2.15μm，结果表明多肽与蛋白间具有较强的结合。2.细胞毒性试验将肝癌细胞huh7、hepg2以及乳腺癌细胞mcf-7(来源于中科院细胞库)按照5000/孔的密度接种在96孔板中，细胞贴壁培养后加入10μl含2mm、1mm、0.5mm、0.25mm、0.125mm多肽的dmem培养基溶液，最终多肽的工作浓度为200μm、100μm、50μm、25μm、12.5μm多肽(f06、d07、g12、d13)，继续培养24h，96孔板中每孔加入10μlcck-8试剂，1h后用酶标仪测定570nm波长下的吸光度。计算细胞存活率：细胞存活率＝od实验组/od对照组，其中，加入0μm多肽后细胞贴壁培养为对照组。结果如图2～4所示：多肽g12、d13、d07、f06对肝癌细胞huh7、hepg2以及乳腺癌细胞mcf-7的生长增殖具有抑制作用，并且随着多肽浓度的增加抑制作用增强。将肝癌细胞huh7、hepg2以及乳腺癌细胞mcf-7(来源于中科院细胞库)按照5000/孔的密度接种在96孔板中，细胞贴壁培养后加入工作浓度10μl浓度为1mm的多肽溶液，得到工作浓度为100μm阴性含有磷酸化酪氨酸的多肽(h18、e01、c21、d23、h08)，继续培养24h，96孔板中每孔加入10μlcck-8试剂，1h后用酶标仪测定570nm波长下的吸光度。计算细胞存活率：细胞存活率＝od实验组/od对照组，其中，加入0μm多肽后细胞贴壁培养为对照组。结果如图5所示：阴性含有磷酸化酪氨酸的多肽对细胞存活率影响不大，不具有细胞毒性。3.荧光共定位实验将huh7细胞按照3000个细胞/皿接种在共聚焦培养皿中，贴壁培养后，除去旧的培养基，加入含有50μm氨基端fitc-acp修饰的多肽(d07、a10、g12)的dmem培养基，dmso作为阴性对照组，继续培养24h。除去培养基后，用pbs缓冲液清洗三遍，加入1ml4％多聚甲醛溶液室温下孵育0.5h固定细胞。除去多聚甲醛溶液并用pbs缓冲液清洗三遍，再加入含有0.1％triton的pbs缓冲液孵育10min破膜。除去triton溶液并用pbs缓冲液清洗三遍，加入含anti-pkm2抗体(1:1000，购于cst公司)的pbst溶液(含有1％bsa和0.1％tween20的pbs缓冲液)，4℃摇床上孵育过夜。之后用pbs缓冲液清洗三遍，加入含荧光二抗(1：5000，购于cst公司)pbst缓冲液，室温摇床上避光孵育2h。之后用pbs缓冲液清洗三遍，加入含20μg/mldapi染料(购于sigma公司)避光孵育3min，之后用pbs缓冲液清洗三遍，最后用抗荧光淬灭封片剂。用激光共聚焦显微镜对样本进行检测。结果如图6所示：fitc修饰多肽(绿光)在细胞内与pkm2蛋白(红光)有明显的重合，表明多肽在细胞中也能够靶向pkm2蛋白，进一步验证上述抑制癌细胞的生长，是通过靶向细胞内pkm2蛋白而实现的。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。sequencelisting<110>中山大学·深圳<120>靶向pkm2蛋白的抗肿瘤多肽及其应用<130><160>13<170>patentinversion3.5<210>1<211>5<212>prt<213>人工序列<400>1lysglytyrglugln15<210>2<211>5<212>prt<213>人工序列<400>2lysglytyriletrp15<210>3<211>5<212>prt<213>人工序列<400>3histrptyrlystrp15<210>4<211>5<212>prt<213>人工序列<400>4asnlystyrglyglu15<210>5<211>5<212>prt<213>人工序列<400>5argasptyrleutyr15<210>6<211>5<212>prt<213>人工序列<400>6hisvaltyrserarg15<210>7<211>5<212>prt<213>人工序列<400>7proglutyrtyrarg15<210>8<211>5<212>prt<213>人工序列<400>8aspglutyrphegln15<210>9<211>5<212>prt<213>人工序列<400>9leusertyrlysile15<210>10<211>5<212>prt<213>人工序列<400>10asphistyrlysleu15<210>11<211>5<212>prt<213>人工序列<400>11glnlystyrproser15<210>12<211>5<212>prt<213>人工序列<400>12serleutyrgluval15<210>13<211>5<212>prt<213>人工序列<400>13prothrtyrvalile15当前第1页1 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技术特征：1.靶向pkm2蛋白的抗肿瘤多肽，其特征在于：所述多肽的氨基酸序列为kg-py-eq、kg-py-iw、hw-py-kw、nk-py-ge、rd-py-ly、hv-py-sr、pe-py-yr、de-py-fq中的至少一种；其中py表示磷酸化酪氨酸。
2.根据权利要求1所述的抗肿瘤多肽，其特征在于：
所述肿瘤为肝癌、乳腺癌中的至少一种。
3.权利要求1或2所述的靶向pkm2蛋白的抗肿瘤多肽在制备诊断肿瘤的制剂中的应用。
4.权利要求1或2所述的靶向pkm2蛋白的抗肿瘤多肽在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
5.一种诊断肿瘤的试剂盒，其特征在于：包含权利要求1或2所述的靶向pkm2蛋白的抗肿瘤多肽。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：
所述肿瘤为肝癌、乳腺癌中的至少一种。
7.一种治疗肿瘤的药物，其特征在于：包含权利要求1或2所述的靶向pkm2蛋白的抗肿瘤多肽。
8.根据权利要求7所述的药物，其特征在于：
所述肿瘤为肝癌、乳腺癌中的至少一种。
9.靶向pkm2蛋白的抗肿瘤多肽的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)利用一珠一化合物法构建磷酸化酪氨酸多肽库；
(2)将步骤(1)的磷酸化酪氨酸多肽与pkm2蛋白孵育，筛选得到具有特异性结合pkm2蛋白的磷酸化酪氨酸多肽。
10.根据权利要求9所述的筛选方法，其特征在于：
步骤(2)中所述pkm2蛋白标记有荧光基团；
步骤(2)中所述筛选为根据荧光信号筛选。
技术总结本发明公开了靶向PKM2蛋白的抗肿瘤多肽及其应用，该多肽的氨基酸序列为KG‑pY‑EQ、KG‑pY‑IW、HW‑pY‑KW、NK‑pY‑GE、RD‑pY‑LY、HV‑pY‑SR、PE‑pY‑YR、DE‑pY‑FQ中的至少一种；其中pY表示磷酸化酪氨酸。该靶向PKM2蛋白的抗肿瘤多肽对肝癌细胞、乳腺癌细胞的生长增殖具有抑制作用，可用于治疗肿瘤。
技术研发人员：高理钱;谢刘幸;谈思佳;王璇;李孟础;杨芬;贾艳;肖奇才;沈君
受保护的技术使用者：中山大学·深圳
技术研发日：2020.11.27
技术公布日：2021.03.12
