本发明属于生物医学工程领域，具体涉及靶向肝细胞生长因子的高亲和肽及其应用。
背景技术：
肿瘤已成为危险人类健康的头号杀手，其死亡率还在持续上升。在癌症转移到其他器官之前，早期发现恶性病变可以尽早进行明确的局部治疗，从而获得极高的生存率，因此，恶性肿瘤的早期诊断和治疗至关重要。对于肿瘤，常规影像诊断技术主要为b超、ct和mri，这些影像诊断技术是通过显示组织的功能变化来达到诊断的结果，有较好的应用价值，但在鉴别诊断、全身分期和早期疗效评价上仍存在一定的不足。近年来，随着对肿瘤及其相关学科的认识和研究，研究的重点开始转移到针对肿瘤细胞内异常表达靶点的特异性肿瘤诊断药物，用于进行肿瘤的早期诊断。针对靶点的特异性肿瘤诊断药物主要特异性结合于肿瘤细胞上，对正常细胞无结合，因而可以达到高选择、低毒性的诊断效果。
间充质-上皮转化因子(mesenchymal-epithelialtransitionfactor,c-met)又叫肝细胞生长因子受体(hepatocytegrowthfactorreceptor,hfgr)是一种跨膜蛋白，其胞外结构域可被肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor,hgf)结合而自然活化，调节许多基本的细胞过程，包括细胞增殖，运动，侵袭，血管生成和凋亡。癌症生物学和分子病理学研究的积累数据表明，c-met表达异常在癌症的发生发展、侵袭、转移过程中起重要作用。由于c-met过表达在结直肠癌、肝癌、肺癌、乳腺癌等恶性肿瘤中发生，且具有较大的胞外结构域，这使得靶向c-met成为成为肿瘤显像的一大热点。目前已报道的靶向c-met的示踪剂大部分为抗体和多肽。与抗体相比，多肽具有免疫原性弱、体内快速分布、穿透性强、易于合成和修饰等优点。
近红外荧光染料mpa具有穿透深度更深、背景组织自发荧光更弱的优点，更适合用于活体成像。但是mpa不能特异性结合肿瘤细胞，本发明将可特异结合c-met受体的多肽与近红外荧光染料mpa偶联，制备出一种靶向c-met受体的近红外荧光成像探针。该探针能够在体内外靶向识别高表达c-met受体的肿瘤细胞和瘤灶，在荧光成像和荧光指导手术中有良好的应用前景。
技术实现要素：
本发明的首要目的在于提供能够靶向肝细胞生长因子受体(c-met)的多肽及序列，使其能够对c-met受体高表达的肿瘤进行在体诊断，可用于制备新型的靶向药物载体。
本发明的目的还在于提供几种肿瘤特异性靶向的荧光探针。
本发明的又一目的在于提供上述多肽和探针的应用。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
肿瘤靶向肽，选自以下任一条多肽：
yqgm-1：ac-tyr-leu-phe-ser-val-his-gly-gly-gly-lys-nh2；
yqgm-2：ac-tyr-nle-4-f-phe-ser-nva-his-gly-gly-gly-lys-nh2
yqgm-3：tyr-leu-phe-ser-val-his-nh2；
yqgm-4：tyr-nle-4-f-phe-ser-nva-his-nh2；
yqgm-5：cylic(cys-tyr-leu-phe-ser-val-his-cys)-lys-nh2；该多肽为二硫键环状多肽化合物，二硫键存在于1-8氨基酸残基之间；
其中，nle为正亮氨酸，4-f-phe为4-氟-苯丙氨酸，nva为正缬氨酸。
本发明所述的肿瘤靶向肽在制备肿瘤诊断试剂中的应用。
作为本发明的一种优选，本发明所述的肿瘤靶向肽在制备肿瘤诊断显像剂中的应用；优选在制备肿瘤边界的精准定位和术中影像导航显像试剂或制备放射性核素显像试剂中的应用。
一种靶向c-met受体的探针，为本发明所述的肿瘤靶向肽与光标记的偶联物。
作为本发明的一种优选，所述的光标记选自有机发色团、有机荧光团、光吸收化合物、光反射化合物、光散射化合物和生物发光分子。
作为本发明的进一步优选，所述的近红外荧光染料选自近红外荧光染料mpa、irdye800、cy7.5、cy5.5；进一步优选mpa。
本发明所述的靶向c-met受体的探针在制备肿瘤诊断试剂中的应用；优选在制备肿瘤诊断显像剂中的应用；进一步优选在制备肿瘤边界的精准定位和术中影像导航显像试剂或制备放射性核素显像试剂中的应用。
本发明所述的肿瘤靶向肽在制备肿瘤靶向药物载体中的应用。
本发明所述的多肽化合物通过特异性靶向肝细胞生长因子受体(c-met)至肿瘤部位，并且在肿瘤部位有很好的聚集和滞留，具有较高的靶和非靶比值，适合用作荧光肿瘤显像剂，并可用于制备肿瘤术中影像导航及肿瘤边界精准定位的光学显像药物。
本发明的有益效果为：
1、本发明开发了一系列新的靶向肝细胞生长因子受体(c-met)的多肽，利用c-met受体在肿瘤中高表达，基于yqgm-x(x＝1-5)多肽与c-met受体特异性结合的原理，靶向识别肿瘤细胞。
2、这些多肽均为低分子量多肽，合成成本低廉，并且此系列短肽引入了非天然氨基酸进行修饰，从而极大提高了多肽在活体内的稳定性。通过延长多肽的半衰期来提高其在体内的循环时间，促进影像探针在肿瘤部位的浓聚和滞留，进而获得更好的肿瘤显像效果，使其更利于临床推广应用。
3、这些肽均为首次报道，获取渠道方便。
4、yqgm-x(x＝1-5)系列多肽可以和肿瘤细胞特异性结合，经活体光学成像和结果证实对多种肿瘤具有优异的显像效果，包括结直肠癌、乳腺癌、肺癌及肝癌等。
5、本发明利用近红外荧光染料mpa穿透深度更深、背景组织自发荧光更弱的优点，在荧光成像和荧光指导手术中有良好的应用前景。
6、yqgm-x(x＝1-5)多肽放射性药物可用于肿瘤的筛查和早期诊断，还可以实时无损在位监测早期恶性肿瘤以及治疗。
附图说明:
图1为荧光靶向化合物mpa-yqgm-1的结构(a),hplc分析图(b)以及ms(c)。
图2为化合物mpa-yqgm-1在结直肠癌ht-29荷瘤鼠体内的光学成像图。
图3为化合物mpa-yqgm-2在肝癌hepg-2荷瘤鼠体内的光学成像图。
图4为化合物mpa-yqgm-3在肺癌h460荷瘤鼠体内的光学成像图。
图5为化合物mpa-yqgm-4在乳腺癌mcf7荷瘤鼠体内的光学成像图。
图6为化合物mpa-yqgm-5在胰腺癌sw-1990荷瘤鼠体内的光学成像图。
具体实施方式:
以下通过具体的实施例和应用例来进一步说明本发明：其中合成步骤中所使用的化学物质均为现有物质或市售商品。
实施例1以多肽yqgm-1为例，包括以下步骤：
树脂溶胀
在反应柱中加入一定量rinkamidembha树脂，然后加入适量的二氯甲烷(dcm)，微微鼓吹氮气10-30分钟，使树脂充分溶胀开来。抽干二氯甲烷溶液，再用二甲基甲酰胺(dmf)洗涤3遍并抽干。
(2)脱除fmoc
向反应柱里加入20％六氢吡啶的dmf溶液，去保护5分钟一次，8分钟一次。反应结束后，用dmf、dcm、dmf依次分别洗涤树脂3次。
(3)偶联
准确称取投料树脂摩尔数3倍的fmoc-ser-oh与o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(hbtu)，完全溶于dmf中，加入n，n-二异丙基乙胺(dipea)使羧基活化后，将溶液加入反应柱进行反应，反应30分钟后，用dmf、dcm、dmf依次分别洗涤3次，然后抽干溶剂，取少量树脂加入6％茚三酮/乙醇溶液和80％苯酚/乙醇溶液各一滴进行检测。若缩合已经完全，无游离氨基存在，则溶液呈无色或淡黄色；否则树脂或溶液将变为蓝色或者红褐色，说明反应不完全。反应结束后，用dmf、dcm、dmf依次分别洗涤3次。重复上述操作，依次偶联其他氨基酸，直至偶联完最后一个氨基酸fmoc-his(trt)-oh，用甲醇洗涤所得到的peptidylresin，真空干燥箱里充分干燥。
(4)裂解
取120ml裂解液(87.5％三氟乙酸 5％苯甲硫醚 2.5％乙二硫醇 2.5％苯酚 2.5％水)加入树脂中，在低温条件下震荡2h，然后用砂芯漏斗将裂解液与树脂分离，保留滤液。将滤液缓慢滴加到冰无水乙醚中，滴加完毕后，自然沉降30min。然后离心得固体，用乙醚洗涤固体三遍，将所得沉淀烘干后，得到干粉粗品。
(5)纯化
采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的c18制备柱，流动相系统为0.1％tfa/水溶液-0.1％tfa/乙腈溶液，采用梯度洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，得目标多肽浓缩液，然后冻干得到目标多肽，最后测定质荷比，确定分子量[m-3h/3]-＝671。
实施例2
按照实施例1的方法制备肿瘤靶向肽yqgm-2，该序列为seqidno:2所示多肽,质谱确证[m-3h/3]-＝677。肿瘤靶向肽yqgm-3，该序列为seqidno:3所示多肽，质谱确证[m-2h/2]-＝836，[m-3h/3]-＝557。肿瘤靶向肽yqgm-4，该序列为seqidno:4所示多肽，质谱确证[m-2h/2]-＝845，[m-3h/3]-＝563。肿瘤靶向肽yqgm-5，该序列为seqidno:5所示多肽，[m-3h/3]-＝682。
实施例3制备荧光靶向化合物mpa-yqgm-1
mpa来自我们课题组前期申请的一篇发明专利，授权专利号：cn101440282。
(1)取0.02mmolmpa溶于200μl超干dmso中，加入3.7mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和2.2mgn-羟基琥珀酰亚胺(edci/nhs)(摩尔比mpa:edci:nhs＝1:1.5:1.5)，避光反应4h，进行羧基活化反应。
(2)取固相合成的多肽yqgm-1(x＝1-5)0.02mmol与0.1mmol三乙胺和200μl超干dmso加入到5ml反应瓶中，氮气保护下反应10min；将上述反应(1)中溶液加入(2)的反应液中，室温搅拌反应12h；
(3)反应结束后，通过冻干浓缩反应液，然后加入蒸馏水稀释，用制备液相进行分离纯化，制备液相条件如下所示：使用了agilent1220infinityii系列hplc系统配备agilentzorbaxsb-c18半制备柱(9.4×250mm，5um)，梯度淋洗60分钟，流速2ml/min，其中流动相a为超纯水(0.01％tfa)，b为乙腈(0.01％tfa)。淋洗梯度设定为：0-5分钟时95％a和5％b，15分钟时85％a和15％b，30分钟时70％a和30％b，45分钟时50％a和50％b，60分钟时10％a和90％b。最后制得的绿色产物经分析型hplc和esi-ms质谱分析确认为预期产物mpa-yqgm-1，参见图1。在上述制备过程中，以固相合成的yqgm-x(x＝2、3、4、5)多肽替代步骤中使用的yqgm-1多肽，即得到其他多种具有肿瘤靶向光学成像功能的多肽化合物mpa-yqgm-2、mpa-yqgm-3、mpa-yqgm-4、mpa-yqgm-5。
实施例4制备的化合物mpa-yqgm-1在结直肠癌ht-29荷瘤鼠体内的光学成像图。
将实施例3制备的化合物mpa-yqgm-1配制成生理盐水溶液(500μg/ml)，通过尾静脉分别给3只结直肠癌ht-29荷瘤裸鼠(体重约20克)注射药物mpa-yqgm-5溶液100μl，并于给药后0.5h、1h、2h、3h、4h、6h和12h进行光学信号采集。观察探针在小鼠体内的分布以及在肿瘤区域的富集。化合物mpa-yqgm-1在3只荷瘤裸鼠中的成像结果基本一致，从1h的成像图中可以看出探针已经在肿瘤中有明显聚集，肿瘤边缘轮廓较清晰，直至6h探针依然在肿瘤中有滞留。显像结果如图2所示。其中，4h时探针在肿瘤部位富集最多，而在其它背景器官的摄取清除较快，从膀胱的信号可以推断出此探针主要通过肾脏代谢。
实施例5制备的化合物mpa-yqgm-2在肝癌hepg-2荷瘤鼠体内的光学成像图。
将实施例2制备的化合物mpa-yqgm-2配制成生理盐水溶液(500μg/ml)，通过尾静脉分别给3只肝癌hepg-2荷瘤裸鼠(体重约20克)注射药物mpa-yqgm-1溶液100μl，并于给药后0.5h、1h、2h、3h、4h、6h和12h进行光学信号采集。观察探针在小鼠体内的分布以及在肿瘤区域的富集。化合物mpa-yqgm-2在3只荷瘤裸鼠中的成像结果基本一致，从1h的成像图中可以看出探针已经在肿瘤中有明显聚集，肿瘤边缘轮廓较清晰，直至6h探针依然在肿瘤中有滞留。显像结果如图3所示。其中，4h时探针在肿瘤部位富集最多，而在其它背景器官的摄取清除较快，从膀胱的信号可以推断出此探针主要通过肾脏代谢。
实施例6制备的化合物mpa-yqgm-3在肝癌hl6荷瘤鼠体内的光学成像图。
将实施例2制备的化合物mpa-yqgm-3配制成生理盐水溶液(500μg/ml)，通过尾静脉分别给3只肝癌hl6荷瘤裸鼠(体重约20克)注射药物mpa-yqgm-3溶液100μl，并于给药后0.5h、1h、2h、3h、4h、6h和12h进行光学信号采集。观察探针在小鼠体内的分布以及在肿瘤区域的富集。化合物mpa-yqgm-3在3只荷瘤裸鼠中的成像结果基本一致，从1h的成像图中可以看出探针已经在肿瘤中有明显聚集，肿瘤边缘轮廓较清晰，直至6h探针依然在肿瘤中有滞留。显像结果如图4所示。其中，4h时探针在肿瘤部位富集最多，而在其它背景器官的摄取清除较快，从膀胱的信号可以推断出此探针主要通过肾脏代谢。
实施例7制备的化合物mpa-yqgm-4在乳腺癌mcf-7荷瘤鼠体内的光学成像图。
将实施例2制备的化合物mpa-yqgm-4配制成生理盐水溶液(500μg/ml)，通过尾静脉分别给3只乳腺癌mcf-7荷瘤裸鼠(体重约20克)注射药物mpa-yqgm-2溶液100μl，并于给药后0.5h、1h、2h、3h、4h、6h和12h进行光学信号采集。观察探针在小鼠体内的分布以及在肿瘤区域的富集。化合物mpa-yqgm-4在3只荷瘤裸鼠中的成像结果基本一致，从1h的成像图中可以看出探针已经在肿瘤中有明显聚集，肿瘤边缘轮廓较清晰，直至6h探针依然在肿瘤中有滞留。显像结果如图5所示。其中，4h时探针在肿瘤部位富集最多，而在其它背景器官的摄取清除较快，从膀胱的信号可以推断出此探针主要通过肾脏代谢。
实施例8制备的化合物mpa-yqgm-5肺癌h460荷瘤鼠体内的光学成像图。
将实施例2制备的化合物mpa-yqgm-5配制成生理盐水溶液(500μg/ml)，通过尾静脉分别给3只乳腺癌h460荷瘤裸鼠(体重约20克)注射药物mpa-yqgm-3溶液100μl，并于给药后0.5h、1h、2h、3h、4h、6h和12h进行光学信号采集。观察探针在小鼠体内的分布以及在肿瘤区域的富集。化合物mpa-yqgm-5在3只荷瘤裸鼠中的成像结果基本一致，从1h的成像图中可以看出探针已经在肿瘤中有明显聚集，肿瘤边缘轮廓较清晰，直至6h探针依然在肿瘤中有滞留。显像结果如图6所示。其中，4h时探针在肿瘤部位富集最多，而在其它背景器官的摄取清除较快，从膀胱的信号可以推断出此探针主要通过肾脏代谢。
1.肿瘤靶向肽，其特征在于选自以下任一条多肽：
yqgm-1：ac-tyr-leu-phe-ser-val-his-gly-gly-gly-lys-nh2；
yqgm-2：ac-tyr-nle-4-f-phe-ser-nva-his-gly-gly-gly-lys-nh2
yqgm-3：tyr-leu-phe-ser-val-his-nh2；
yqgm-4：tyr-nle-4-f-phe-ser-nva-his-nh2；
yqgm-5：cylic(cys-tyr-leu-phe-ser-val-his-cys)-lys-nh2；该多肽为二硫键环状多肽化合物，二硫键存在于1-8氨基酸残基之间；
其中，nle为正亮氨酸，4-f-phe为4-氟-苯丙氨酸，nva为正缬氨酸。
2.权利要求1所述的肿瘤靶向肽在制备肿瘤诊断试剂中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于权利要求1所述的肿瘤靶向肽在制备肿瘤诊断显像剂中的应用；优选在制备肿瘤边界的精准定位和术中影像导航显像试剂或制备放射性核素显像试剂中的应用。
4.一种靶向c-met受体的探针，其特征在于为权利要求1所述的肿瘤靶向肽与光标记的偶联物。
5.根据权利要求4所述的近红外荧光成像探针，其特征在于所述的光标记选自有机发色团、有机荧光团、光吸收化合物、光反射化合物、光散射化合物和生物发光分子。
6.根据权利要求5所述的近红外荧光成像探针，其特征在于所述的近红外荧光染料选自近红外荧光染料mpa、irdye800、cy7.5、cy5.5。
7.根据权利要求6所述的近红外荧光成像探针，其特征在于所述的近红外荧光染料选自mpa。
8.权利要求4～7中任一项所述的靶向c-met受体的探针在制备肿瘤诊断试剂中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于权利要求4～7中任一项所述的靶向c-met受体的探针在制备肿瘤诊断显像剂中的应用；优选在制备肿瘤边界的精准定位和术中影像导航显像试剂或制备放射性核素显像试剂中的应用。
10.权利要求1所述的肿瘤靶向肽在制备肿瘤靶向药物载体中的应用。
技术总结