本发明属于生物技术领域，具体的，涉及一种柯萨奇病毒cv-a2的病毒样颗粒。
背景技术：
手足口病(hand,footandmouthdisease，hfmd)是由多种肠道病毒感染引起的一种病毒性疾病。hfmd在世界范围内出现多次暴发流行，以夏秋季常见。患者主要为学龄前儿童，尤以3岁以下年龄组发病率最高，临床表现为口腔黏膜、手和足等多处疱疹，少数可引起脑炎，肺水肿，弛缓性麻痹，心肌炎和心脏衰竭等严重并发症,甚至导致死亡病例[1]。
引起hfmd的肠道病毒至少有20多个型，包括柯萨奇病毒a组(coxsackievirusa，cva)2、4、5、6、10、12和16型，柯萨奇病毒b组(coxsackievirusb,cvb)的5型，埃可病毒(echovirus,echo)以及肠道病毒71型(enterovirus71,ev-a71)。cv-a2是柯萨奇病毒a组成员，于1947年在美国特拉华首次分离得到原型株fleetwood[2],其基因结构分为：5'非编码区、3'非编码区及位于非编码区之间的开放阅读框架。其编码区包含编码结构蛋白的p1区和编码非结构蛋白的p2，p3区。p1区编码4种衣壳蛋白vp1、vp2、vp3、vp4，除vp4包埋在病毒粒子外壳的内侧与病毒核心紧密连接以外，其他3种结构蛋白均暴露病毒颗粒的表面；p2和p3区编码7种非结构蛋白2a，2b，2c，3a，3b，3c和3d，与病毒rna的复制、转录，病毒多聚蛋白的剪切、病毒颗粒的装配等功能相关。细胞表达的重组多聚蛋白p1被同时表达的3cd酶剪切为vp0、vp1、vp2、vp3和vp4，装配为成分与病毒感染后的前颗粒(procapsid)相似的病毒样颗粒。cv-a2主要引起疱疹性咽峡炎、脑炎及脊髓炎、心肌炎和心包炎、流行性胸痛、呼吸道感染、手足口病、婴儿腹泻等，引起暴发流行[3-7]。2008年中国台湾肠道病毒流行，在221份采集样品中，73％(161/221例)有疱疹性咽峡炎，27％(60/221例)为手足口病[8]。2012年瑞典肠道病毒早期感染的随访中，cv-a2的感染比例占9.6％，仅次于cv-a9(13.5％)和cv-a16(11.5％)[9]。cv-a2感染所引起的疾病多数为症状较轻，病程较短，且较少出现并发症或留下后遗症[10-12]。但是也出现因感染cv-a2引起手足口重症并导致死亡的报道[13]：2012年多名急性感染后死亡的患儿的尸检结果均显示cv-a2感染成阳性，且分离株为cv-a2与ev-71和cv-a4的重组株。本实验室于2016年10月至2017年12月，在湖北省襄阳市进行的hfmd病原学研究表明，cv-a2可引起hfmd暴发流行，且与cv-a5、cv-a6、cv-a10、cv-a16、和ev-a71共同流行，成为hfmd的主要病原体之一；同时发现，cv-a2也可引起重症病例。因此，对这种血清型肠道病毒的监测和基础研究，具有非常重要的意义和实用价值。
目前，预防hfmd的主要候选疫苗为细胞基质全病毒灭活疫苗和病毒样颗粒(vlp)疫苗。然而，灭活疫苗中除ev-a71和cv-a16外，其它主要血清型病毒难于在人用疫苗基质细胞中生长。vlp具有产量大、易富集和易纯化的特点，也使得其逐渐广泛应用于疫苗领域。因此探索杆状病毒bac-to-bac表达系统，纯化cv-a2vlps，具有重要的应用意义，可为cv-a2以及多价手足口疫苗的研制提供有力参考。
参考文献
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技术实现要素：
本发明成功构建cv-a2p1-3cd重组bacmid质粒，并成功表达了cv-a2vlps，这为今后cv-a2vlps疫苗的研发奠定了基础。
本发明涉及一种柯萨奇病毒cv-a2的病毒样颗粒vlps，其特征在于，所述的vlps是用昆虫载体表达的，其包括优化的cv-a2p1蛋白和优化的cv-a23cd蛋白；
所述的优化的cv-a2p1蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列分别如seqidno.3和seqidno.5所示所述的优化的cv-a23cd蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列分别如seqidno.4和seqidno.6所示；
优选的，所述的柯萨奇病毒cv-a2毒株为cv-a2-1580v4/chnxy/2017。
本发明还涉及所述的柯萨奇病毒cv-a2的病毒样颗粒vlps的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)重组杆状病毒bacmid质粒的构建：将优化的cv-a2p1和cv-a23cd基因分别克隆在pfastbacdual质粒的pph和p10启动子之后，转化大肠杆菌dh10bac感受态细胞，提取阳性质粒即重组杆状病毒bacmid质粒。
(2)重组杆状病毒的表达：用重组杆状病毒bacmid质粒转染昆虫细胞，获得重组杆状病毒。
(3)柯萨奇病毒cv-a2vlps的制备：将获得的重组杆状病毒按moi＝0.5接种昆虫细胞，5-6天后收获上清，并提取分离柯萨奇病毒vlps，优选的，所述的昆虫细胞为sf-9。
可选的，所述的方法还包括：
(4)利用sds-page、western-blot、间接免疫荧光和透射电镜鉴定vlps。
优选的，步骤(3)所述的提取分离柯萨奇病毒vlps的步骤为：
1)收集cv-a2vlps感染的sf-9细胞液，反复冻融，3000rpm4℃离心10min去细胞碎片；
2)上清经孔径为30kd的膜包超滤浓缩30倍；
3)浓缩产物通过20％蔗糖，15000g垫底，离心4h，随后1.31g/mlcscl密度25000g离心20h，抽取目标条带即为cv-a2vlps(图7的中间条带)。
本发明还涉及所述的柯萨奇病毒cv-a2的病毒样颗粒vlps、柯萨奇病毒cv-a2p1蛋白、以及柯萨奇病毒cv-a23cd蛋白在制备疫苗或药物中的应用，优选的，所述的疫苗或药物是治疗或预防手足口病的疫苗或药物。
本发明的有益效果在于：
本发明经昆虫密码子优化的cv-a2p1和3cd基因，通过bac-to-bac杆状病毒表达系统成功组装了cv-a2vlps。
本发明成功构建cv-a2p1/3cd重组bacmid质粒，并成功表达了cv-a2vlps，这为今后cv-a2vlps疫苗的研发奠定了基础。
附图说明
图1、1a为cv-a2-1580r4/xy/chn/2017部分序列pcr结果(m：marker；1：1bp-500bp；2：1230bp-3780bp；3：3910bp-6210bp。)；1b为cv-a2-1580r4/xy/chn/2017部分序列pcr结果(m：marker；4：870bp-2070bp；5：3700bp-5530bp)；
图2、2a为cv-a2p1基因鉴定图；2b为cv-a23cd基因鉴定图；图中各泳道：m：蛋白marker；1:bamhⅰ/speⅰ酶切后，p1片段；2:xhoⅰ/sphⅰ酶切后，3cd片段。
图3、cv-a2p1/3cd重组bacmiddna鉴定图；图中各泳道：m：marker；1：m13f和m13r引物扩增片段；2：m13f和cv-a2-p1引物扩增p1片段；3：cv-a2-3cd和m13r引物扩增3cd片段。
图4、重组杆状病毒rcv-a2pl/3cd感染昆虫细胞sf9病变图(×200)。
图5、rcv-a2vlpsdna电泳鉴定图；图中各泳道：m：蛋白marker；1：m13f/m13r引物扩增条带；2：m13r/cv-a2-3cd(3cd)引物扩增条带。
图6、昆虫细胞sf9表达rcv-a2vlps的间接免疫荧光检测(×200)。
图7、cscl密度梯度离心纯化rcv-a2vlps
图8、8a为rcv-a2vlpssds-page分析；8b为western-blot检测rcv-a2vlps
图9、纯化rcv-a2vls电镜投射观察，坐标尺：200nm.；放大倍数,100000。
具体实施方式
实施例1：cv-a2p1/3cd重组bacmid的构建
1、p1和3cd基因序列的确定
将一份来源于湖北省襄阳市临床确诊为手足口病患者中收集得到临床标本，并通过常规方法在人横纹肌肉瘤细胞(rd)分离得到cv-a2-1580r4/chnxy/2017株。提取其rna，反转录后，送生工生物工程(上海)股份有限公司进行全基因组序列测序。
与cv-a2原型株fleetwood株(genbank：ay421760.1)进行比对，确定p1和3cd序列。
测序结果显示：
柯萨奇病毒(cv-a2-1580r4/chnxy/2017株)p1基因核苷酸序列如seqidno.1所示；
柯萨奇病毒(cv-a2-1580r4/chnxy/2017株)3cd基因核苷酸序列如seqidno.2所示。
2、重组质粒pfastbacdual-p1/3cd的构建
依据昆虫细胞偏好特性优化密码子并合成p1和3cdcdna片段，具体为：
seqidno.3：优化后柯萨奇病毒p1基因核苷酸序列
seqidno.4：优化后柯萨奇病毒3cd基因核苷酸序列
其氨基酸序列分别为：
seqidno.5：优化后柯萨奇病毒p1基因氨基酸序列
seqidno.6：优化后柯萨奇病毒3cd基因氨基酸序列
通过t-a克隆，将p1和3cd片段连接到pfastbacdual载体上。
两个基因片段，分别置于多角体蛋白启动子pph和p10启动子后。此工作由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
重组质粒pfastbacdual-p1/3cd得到后，分别经bamhⅰ/speⅰ和xhoⅰ/sphⅰ双酶切鉴定。
3、cv-a2p1/3cd重组bacmid
得到的pfastbacdual-p1/3cd重组质粒后，进一步转化dh10bactm感受态细胞，37℃培养72小时，获得cv-a2p1/3cd重组bacmid。
利用m13f/m13r和m13f/cv-a2-p1、m13r/cv-a2-3cd引物(生工生物工程(上海)股份有限公司合成)对所获得的cv-a2p1/3cd重组bacmid进行鉴定，所用引物见表1。
表1：m3f、m13r、cv-a2-p1和cv-a2-3cd引物
pcr反应体系及反应条件：
反应缓冲液15.2μl、dna模板0.4μl、taq酶混合物3.6μl、正反向引物各0.8μl(1.0ng/μl)、补加ddh2o到20μl。
94℃5min；
94℃30s；55℃30s；72℃30s，35个循环。
其中，扩增m13f/m13r片段(7016bp)正反向引物分别为m13f和m13r、扩增p1片段(3112bp)正反向引物分别为m13f和cv-a2-p1、扩增3cd(3586bp)片段正反向引物分别为cv-a2-3cd和m13r。
将pcr扩增结果送上海生工生物工程股份有限公司测序，利用seqman(7.1.0)软件拼接测序结果，获得cv-a2-1580r4/chnxy/2017株基因组全序列。序列全长7401nt，非编码区5’-utr、3’-utr在基因组的核苷酸位置分别为1-747nt和7321-7401nt，编码的多聚蛋白(polyprotein)长度为2191个氨基酸残基，cv-a2-1580r4/chnxy/2017株的p1和3cd序列位置，p1：748-3324nt，3cd：5383-7317nt。
对重组质粒的pfastbacdual-p1片段和pfastbacdual-3cd片段分别用bamhⅰ/speⅰ和xhoⅰ/sphⅰ双酶切，片段大小符合预估值，见图2，说明p1和3cd克隆至pfastbacdual质粒中。
通用引物m13f/m13r、m13f/cv-a2-p1(p1)、m13r/cv-a2-3cd(3cd)引物做pcr验证，1％琼脂糖凝胶电泳在7016bp、3112bp和3586bp上下可以见到清晰条带，与预期目标大小一致，见图3，说明cv-a2pl/3cd基因成功转座到bacmid。
实施例2：重组杆状病毒rbac-cv-a2p1/3cd的构建及鉴定
1、重组杆状病毒rbac-cv-a2p1/3cd的构建及dna鉴定
按照
以重组的bacmid转染sf9昆虫细胞，镜下见细胞变圆变大，细胞核变大，充满整个细胞，细胞透亮水肿，细胞折光率发生变化，同时越来越多的细胞内出现空泡和较多颗粒，显微镜下观察见图4。说明cv-a2p1/3cd重组bacmid成功转染sf9细胞。
提取重组杆状病毒dna并利用m13f/m13r和m13r/cv-a2-3cd引物扩增对其插入dna序列进行鉴定。pcr反应体系和反应条件同上。
由图5可见，琼脂糖凝胶电泳在7016bp和3586bp上下可以见到清晰条带，与预期目标大小一致。这进一步证实cv-a2pl-3cd重组bacmid转染成功，获得目的重组病毒rbaccva2-p1/3cd。
2、间接免疫荧光检测(ifa)
rbac-cv-a2pl/3cd重组bacmid转染昆虫细胞sf972h后，用4％多聚甲醛固定，5％bsa 0.5％tritonx-100 pbs室温封闭；
加一抗：兔抗cv-a2vlp多抗(1:1000)，4℃孵育过夜；
加二抗：羊抗鼠alexa-488(1:2000)，37℃孵育1h；荧光显微镜下观察。
荧光显微镜下可见明显绿色荧光，而正常sf9细胞对照组无荧光信号(图6)，这说明重组rcv-a2vlps(insect)蛋白表达成功。
实施例3：cv-a2vlps的纯化及鉴定
1、蔗糖垫底及氯化铯密度梯度离心纯化rcv-a2vlps
收集rcv-a2vlps感染的sf9细胞，反复冻融，3000rpm4℃离心10min去细胞碎片，上清经孔径为30kd的膜包超滤浓缩。浓缩产物通过20％蔗糖，15000g垫底离心4h，1.31g/mlcscl密度25000g离心20h，抽取目标条带(图7的中间条带)。
2、sds-page及western-blot免疫印迹法检测目的蛋白表达
纯化后的rcv-a2vlps分别经0.1％sds-12.5％page和western-blot鉴定，检测使用常规方法进行。western-blot中一抗：抗cv-a2vlp多抗(1:2000)4℃孵育过夜；二抗：羊抗鼠多抗(1:5000)37℃孵育1h，最后用dab显色系统显色。
如图8a所示，可以清晰看到vp0约39kd、vp1约34kd和vp3约27kd，与预期结果一致。经western-blot检测有vp0、vp1和vp3特异条带，见图8b。说明重组rcv-a2vlps(insect)蛋白表达成功。
3、透射电镜观察
取样品100μl，与铜网有支持膜的表面接触，静置3min，用3％磷钨酸负染5min，常温过夜晾干，送中国科学院武汉病毒所进行电镜观察。
纯化后rcv-a2vlps(insect)放置透射电镜下观察，由图9可见，病毒样颗粒形状规则呈圆形，均匀分布，经测定，病毒样颗粒的直径范围约为23-33nm之间，整体形态大小与肠道病毒cv-a2一致。说明rcv-a2vlps(insect)蛋白表达成功。
最后需要说明的是，以上实施例仅用于帮助本领域技术人员理解本发明的实质，不用于限定本发明的保护范围。
sequencelisting
<110>武汉生物制品研究所有限责任公司
<120>一种柯萨奇病毒cv-a2的病毒样颗粒
<160>6
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<210>1
<211>2577
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645
1.一种柯萨奇病毒cv-a2的病毒样颗粒vlps，其特征在于，所述的vlps用昆虫载体表达，其包括优化的cv-a2p1蛋白和优化的cv-a23cd蛋白；
所述的优化的cv-a2p1蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列分别如seqidno.3和seqidno.5所示
所述的优化的cv-a23cd蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列分别如seqidno.4和seqidno.6所示；
所述的柯萨奇病毒cv-a2毒株为cv-a2-1580v4/chnxy/2017。
2.权利要求1所述的柯萨奇病毒cv-a2的病毒样颗粒vlps的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)重组杆状病毒bacmid质粒的构建：
将优化的cv-a2p1和cv-a23cd基因分别克隆在pfastbacdual质粒的pph和p10启动子之后，转化大肠杆菌dh10bac感受态细胞，提取阳性质粒即重组杆状病毒bacmid质粒；
(2)重组杆状病毒的表达：
用重组杆状病毒bacmid质粒转染昆虫细胞，获得重组杆状病毒；
(3)柯萨奇病毒cv-a2vlps的制备：
将获得的重组杆状病毒按moi＝0.5接种昆虫细胞，5-6天后收获上清，并提取分离柯萨奇病毒vlps，所述的昆虫细胞为sf-9。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括：
(4)利用sds-page、western-blot、间接免疫荧光和透射电镜鉴定vlps。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的提取分离柯萨奇病毒vlps的步骤为：
1)收集cv-a2vlps感染的sf-9细胞液，反复冻融，3000rpm4℃离心10min去细胞碎片；
2)上清经孔径为30kd的膜包超滤浓缩30倍；
3)浓缩产物通过20％蔗糖，15000g垫底，离心4h，随后1.31g/mlcscl密度25000g离心20h，抽取目标条带即为cv-a2vlps。
5.氨基酸序列seqidno.5所示柯萨奇病毒cv-a2p1蛋白。
6.氨基酸序列seqidno.6所示柯萨奇病毒cv-a23cd蛋白。
7.编码权利要求5或6所述的柯萨奇病毒蛋白的核苷酸片段。
8.权利要求1所述的柯萨奇病毒cv-a2的病毒样颗粒vlps、权利要求5所述的柯萨奇病毒cv-a2p1蛋白、权利要求6所述的柯萨奇病毒cv-a23cd蛋白以及权利要求7所述的核苷酸片段在制备疫苗或药物中的应用，优选的，所述的疫苗或药物是治疗或预防手足口病的疫苗或药物。
技术总结