苏云金芽胞杆菌Sip1Aa蛋白随机重组突变蛋白的制作方法

专利2022-07-08 94

本发明属于生物防治技术领域，具体涉及对鞘翅目农业害虫具有高毒力的bt杀虫基因的随机重组突变蛋白。

背景技术：

苏云金芽胞杆菌(bacillusthuringiensis,bt)是一种革兰氏阳性细菌，广泛存在于自然界中，其外形一般呈短杆状，单生或形成短链状。1911年，德国生物学家贝尔奈(berliner)从德国苏云金的一种地中海粉螟的患病幼虫上分离得到同一种细菌，并命名为苏云金芽胞杆菌。苏云金芽胞杆菌已有100多年的研究历史，有关该菌的报道涉及生物分子学、细胞学、分类命名、bt的有效成分以及其杀虫机理等方方面面，研究报告已有数万篇之多。

目前，国内外对btsip蛋白的报道较少。donovan等研究bt菌株对鞘翅目昆虫的杀虫活性的过程中，发现一些菌株的培养上清液在致死中浓度(lc50)为0.12(0.09～0.15)μg/ml时对科罗拉多马铃薯甲虫(cpb)幼虫具有杀虫活性，该基因包含1104bp，编码367个氨基酸，被命名为sip1a，与mtx3杀蚊蛋白的相似性为46％(donovanwp,englemanjt,donovanjc,etal.discoveryandcharacterizationofsip1a:anovelsecretedproteinfrombacillusthuringiensis,withactivityagainstcoleopteranlarvae[j].applmicrobiolbiotechnol,2006,72(4):713-719)。2012年，本实验室从bt菌株qzl26中克隆并鉴定了包含1038bp，编码345个氨基酸序列的sip基因，但其杀虫活性未见报道(刘艳杰,李海涛,刘荣梅,等.bt新型基因sip的克隆、表达和生物信息学分析[j].生物技术通报,2012(12):101-105)。2013年，murawska等人应用基因组测序技术，发现is5056菌株中含有sip基因，但未进行深入研究。2015年，张金波从bt菌株dq89中克隆表达了1188bp，编码395个氨基酸的sip蛋白，显示出对大猿叶甲具有较高毒杀作用，其lc50值为1.542μg/ml(张金波,李海涛,刘荣梅,等.bt菌株dq89的sip基因的克隆、表达及杀虫活性分析[j].中国生物防治学报,2015,31(4):598-602)。此外，沙君雪从bt菌株qzl38中克隆sip1aa基因，进而构建其截短突变体，去除前90bp信号肽，可以产生37.6kda的可溶性蛋白，并测试其对大猿叶甲的lc50值为1.051μg/ml(shaj,zhangj,chib,etal.sip1abgenefromanativebacillusthuringiensisstrainqzl38anditsinsecticidalactivityagainstcolaphellusbowringibaly[j].biocontrolscience&technology,2018,28(5):459-467.)。

从理论上来说，pcr扩增是一个指数增长的过程，但是实际上，pcr的扩增曲线并不是标准的“j”形指数曲线，而是接近于“s”形的曲线。发生这种情况是因为随着pcr扩增循环数的增加。扩增规模呈指数型迅速增大，taq酶、dntps、引物、甚至是dna模板等各种pcr反应的要素逐渐供不应求，进而导致pcr的效率越来越低，产物增长的速率也就逐渐减缓。当所有pcr所需的原料都被消耗掉以后，pcr就进入了平台期，pcr产物的量也达到饱和。由于各种因素之间复杂的相互作用，不同pcr反应体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大的差异。

通过荧光定量pcr获得质粒的扩增曲线，检测整个pcr的扩增过程，观察pcr反应的基线期、对数期和平台期，明确在模板量不同的情况下，pcr进入指数扩增的循环数，再通过计算得到达到预期突变率所需的指数扩增循环数。选择能够产生尽可能多的产物量的适宜浓度的质粒作为易错pcr的模板，使用taqdna聚合酶进行pcr扩增，pcr产物胶回收纯化后，与载体质粒一同进行双酶切反应，t4连接酶进行连接后转化至大肠杆菌lm109感受态细胞，筛选阳性克隆，保存转化子，即获得sip1aa随机重组文库。

本专利申请，希望通过随机重组的方法，得到高活性的sip1aa突变体蛋白，对于苏云金芽胞杆菌对害虫发挥毒杀作用的关键氨基酸残基的研究，突变率并非越高越好，所以选择合适的突变率至关重要。另外，要研究杀虫蛋白结构与功能的关系，一般以研究单个氨基酸残基的突变为宜，也就是每段目的基因约发生1.5个碱基突变。若仅仅是想要获得性质具有明显变化的蛋白质，可以通过增加pcr体系中mg²浓度以达到增加突变率，扩大突变文库容量的目的。即便如此，当每段目的基因的突变碱基数超过6个时，往往会导致蛋白质失去其原有的功能。

另外，在先前对cry蛋白的研究中，通过随机突变构建了一系列突变体，其中杀虫活性提高的突变体，都是处于低突变频率的，当突变频率太高时，大部分突变都是有害的，几乎无法筛选到有益突变(vartanianjp,henrym,wain-hobsons.hypermutagenicpcrinvolvingallfourtransitionsandasizeableproportionoftransversions.nucleicacidsres,1996,24(14):2627-2631.)。同时突变频率如果太低，则会使野生型蛋白占据突变文库的优势，也无法筛选到理想的突变体。因此，本研究选择预期每段目的基因发生1.5个碱基突变的低突变频率，构建sip1aa随机重组文库。

技术实现要素：

为延缓昆虫抗性和获得更高杀虫活性的突变体蛋白，本研究利用易错pcr技术构建sip1aa蛋白随机重组文库，随机选取100个阳性转化子进行序列测定，共产生25个突变体，分别命名为m1-m25。共发生29个碱基突变，平均每个突变体发生1.2个碱基突变。与sip1aa蛋白相比，突变体m1(a31,y118,d227),m5(k168)和m21(i307)的杀虫活性明显降低，活性降低了4-6倍，同时也获得对大猿叶甲杀虫活性提高的突变体m8(r174s)，活性提高了4.02倍，和m6(f346v)突变体活性提高了2.19倍，该研究结果为sip1aa蛋白的分子改造及杀虫活性关键位点的研究提供了借鉴。

突变体m8(r174s)，其氨基酸序列如seqidno.3。

编码上述突变体m8(r174s)的基因。

突变体m6(f346v)，其氨基酸序列如seqidno.5。

编码上述突变体m6(f346v)的基因。

所述的基因序列如seqidno.4，seqidno.6所示。

上述突变体seqidno.3，seqidno.5所示在杀灭大猿叶甲害虫中的应用。

所述应用为将所述的突变体seqidno.3，seqidno.5制成杀虫剂杀灭大猿叶甲。

本发明利用易错pcr技术构建sip1aa蛋白随机重组文库，随机选取100个阳性转化子进行序列测定，共产生25个突变体，分别命名为m1-m25。共发生29个碱基突变，平均每个突变体发生1.2个碱基突变。与野生型sip1aa蛋白相比，突变体m1(a31,y118,d227),m5(k168)和m21(i307)的杀虫活性明显降低，lc50值升高4-6倍，同时也获得了对大猿叶甲杀虫活性提高的突变体m8(r174s)，其lc50值降低了4倍；和m6(f346v)突变体活性提高了2.19倍。该研究结果为sip1aa蛋白的分子改造及杀虫活性关键位点的研究提供了借鉴。

附图说明

图1荧光定量pcr扩增/循环图，

图2pcr扩增结果，

m：dl2000dnamarker，1-2：pac19sip1aa质粒模板浓度为3.5ng/μl，pcr分别扩增35个和28个循环；3-4：pac19sip1aa质粒模板浓度为35ng/μl，pcr分别扩增35个和13个循环，

图3易错pcr产物及载体酶切，

m：dl5000和dl2000，1：xhoi和ecori酶切质粒pac19sip1aa后回收3kb载体；2：xhoi和ecori酶切易错pcr胶回收产物后回收1kb目的条带，

图4突变位点的分布，

图5随机突变文库蛋白表达分析，

m:premixedproteinmarker(low),ck-:puc19,p:pac19sip1aa,1:m1,2:m2,3:m5,4:m6,5:m7,6:m8,7:m10,8:m11,9:m13,10:m17,11:m18,12:m19,13:m21and14:m25，

图6突变位点结构分析。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明。

1.材料与试剂

1.1菌株与质粒

实验所用菌株与质粒详见表1，可以对公众发放。

表1菌株与质粒

1.2引物

随机突变引物

根据sip1aa基因序列设计随机突变引物，在上游引物5'端引入xhoi酶切位点，下游引物5'端引入ecori酶切位点。引物序列如表2所示。

表2引物名称及序列

1.3培养基和抗生素

液体lb：胰蛋白胨1％，nacl1％，酵母提取物0.5％；氨苄青霉素(ampicillin):称取100mg氨苄青霉素(ampicillin)溶于1ml无菌水，过0.22μm滤膜除菌使用时稀释1000倍。

1.5酶和生化试剂

蛋白质marker购自takara公司；2×taqmixdna聚合酶购于cwbio公司；dna凝胶回收试剂盒购于axygen公司；其他试剂均为国产分析纯试剂。

1.6供试昆虫

实验所用标准化大猿叶甲试虫由中国农业科学院植物保护研究惠赠。

2实验方法

2.1质粒浓度测定

取1μl质粒，利用nanodrop仪器进行浓度测定。将质粒浓度梯度稀释为35ng/μl和3.5ng/μl。

2.2荧光定量pcr反应

以转化e.colijm109的pac19sip1aa质粒为模板，以sip1aa-xhoi和sip1aa-ecori为引物对，进行qpcr扩增sip1aa基因片段，反应体系如下：

反应程序：95℃预变性30s，95℃变性10s，60℃退火30s，40个循环。

2.3易错pcr反应

以3.5ng/μl的pac19sip1aa质粒为模板，以sip1aa-xhoi和sip1aa-ecori为引物对，扩增sip1aa基因片段，反应体系如下：

pcr反应程序：95℃预变性3min，95℃变性30s，59.8℃退火30s，72℃延伸1min。扩增28个循环，最后72℃终止延伸10min。

反应结束后，胶回收目的片段。

2.4酶切反应

利用xhoi和ecorⅰ对pac19sip1aa质粒和易错pcr胶回收产物同时进行双酶切，反应体系如下：

反应条件：37℃反应30min。

反应结束后，将酶切产物进行琼脂糖凝胶回收。

2.5连接反应

将胶回收后的双酶切载体片段pac19与易错pcr胶回收产物通过t4连接酶连接，体系如下：

反应条件：16℃过夜。

反应结束后转化至大肠杆菌jm109感受态，建立随机重组文库。

2.6序列测定及分析

筛选随机重组文库中的阳性克隆，随机挑取100个阳性克隆进行序列测定。

2.7随机重组文库蛋白表达与提取

(1)挑取重组单菌落于5ml含有氨苄青霉素的液体lb培养基中，37℃，220rpm/min培养12h；

(2)按1％接种量接种至100ml2×lb液体培养基中，37℃，220rpm/min培养16h；

(3)4℃，8000rpm/min离心10min，收集菌体；

(4)沉淀用5ml1×te溶液悬浮；

(5)在冰水浴中进行超声波破碎(80％，3s，3s，10min)；

(6)4℃，12000rpm/min离心10min，收集上清；sds-page检测蛋白表达情况。

(7)沉淀用2％的triton-100悬浮，4℃，12000rpm/min离心10min，弃上清，重复3次；

(8)用无菌水悬浮沉淀，4℃，12000rpm/min离心10min，弃上清；

(9)用5mlpbs悬浮沉淀，保存备用。

2.8sds-page电泳

聚丙烯酰胺凝胶的配置见表3。

表3sds聚丙烯酰氨凝胶的配制

蛋白样品处理：将100μl蛋白样品与40μl5×上样缓冲液混合后沸水浴10min，12000rpm/min离心10min；

上样电泳：取10μl上清液上样，80v预电泳20min，当蛋白样品浓缩至一条直线，改为120v电泳直至结束。

染色：电泳结束后，取下凝胶，置于已经加入100mlsi的玻璃皿中，微波炉高火加热30s，取出置于摇床上，70rpm/min脱色5min。倒掉si，将凝胶转移至已经加入100mlsii和2mlsⅲ的玻璃皿中，微波炉高火加热30s，取出置于摇床上，70rpm/min染色20min左右至出现清晰条带。将凝胶取出，转移至装有蒸馏水的玻璃皿中，70rpm/min过夜脱色。

成像：通过凝胶成像系统，将凝胶拍照保存。

2.9杀虫活性测定

将pac19-sip1aa蛋白以及随机重组蛋白稀释至不同浓度，同时以puc19在大肠杆菌中表达的蛋白作为阴性对照，采用叶浸生物测定法用新鲜小白菜对大猿叶甲进行毒力分析。具体方法如下：

(1)选取新鲜的，大小一致的小白菜叶片，用蒸馏水洗净并放置于滤纸上晾干；

(2)将待测蛋白样品放入无菌培养皿，向样品中加入0.1％家用洗涤剂，将叶片浸泡在蛋白样品中30s左右，上下翻转一次；

(3)将叶片置于保鲜膜上晾干；

(4)将晾干的叶片分别放入铺有被灭菌水喷湿的滤纸的培养皿中；

(5)用毛笔轻轻接入大猿叶甲初孵幼虫，每个叶片接幼虫16头，每个处理做三次重复；

(6)放置27℃生化培养箱中，并于早晚在培养箱内喷适量灭菌水，以保持培养箱空气湿度，光周期控制为14/10(亮/暗)；

48h统计死虫数、活虫数，采用spss软件计算死亡率、校正死亡率及lc50(95％置信区间)。

3试验结果

3.1确定pcr扩增初始模板浓度

经微量分光光度计narodrop测量pac19sip1aa质粒的浓度为268.3ng/μl。将质粒梯度稀释为35ng/μl和3.5ng/μl，分别取1μl质粒作为模板，以sip1aa-xhoi和sip1aa-ecori为引物对进行荧光定量pcr，同时以水为模板进行阴性对照，每个条件重复3次。qpcr扩增结果如图1所示。

pcr指数扩增循环数的不同会导致所产生的突变频率不同，因此通过荧光定量pcr对pac19sip1aa质粒的扩增情况进行了摸索。根据图1的结果，当pac19sip1aa质粒模板的浓度是35ng/μl时，pcr在10-22循环时，处入指数扩增期；当pac19sip1aa质粒模板的浓度是3.5ng/μl时，pcr在25-35循环时，处于指数扩增期。

根据计算结果，要想得到1.5个碱基的突变率，当pac19sip1aa质粒模板初始浓度为35ng/μl时，需要13个pcr循环；当pac19sip1aa质粒模板初始浓度为3.5ng/μl时，需要28个pcr循环。以此条件进行pcr扩增，结果如图2所示。

由图2可知，pcr扩增达到饱和之前，在相同模板量的情况下，pcr产物的量随着pcr循环次数的增加而增加。将pcr产物进行胶回收后进行浓度测定发现，pac19sip1aa质粒模板初始浓度为35ng/μl，13个pcr循环扩增得到的产物浓度要明显低于pac19sip1aa质粒模板初始浓度为3.5ng/μl，28个pcr循环扩增得到的产物浓度。为了便于后续的胶回收、酶切等操作，选择pac19sip1aa质粒模板初始浓度为3.5ng/μl，28个pcr循环作为建立随机重组文库的条件。

3.2随机重组文库的建立

将初始浓度为3.5ng/μl的pac19sip1aa质粒作为易错pcr反应的模板，经过28个pcr扩增循环之后，将产物进行胶回收。接着用限制性内切酶xhoi和ecori对胶回收产物进行双酶切，回收1kb大小的目的条带；与此同时，用限制性内切酶xhoi和ecori对pac19sip1aa质粒进行双酶切，胶回收3kb大小的载体片段，如图3所示。将二者的胶回收产物按照t4连接酶的反应体系进行连接，16℃过夜反应后，转化e.colijm109感受态细胞，筛选阳性克隆，对总计1000个阳性转化子进行保存，即建成sip1aa随机重组文库。

3.3随机重组文库序列分析

为了验证随机突变目标片段碱基的变化情况，从随机突变文库中随机选择100个阳性转化子进行序列测定，并对测序结果进行分析。其中，共有25个突变体发生碱基改变，分别命名为m1-m25。突变体中核苷酸和氨基酸的变化统计如表4所示。

表4随机重组文库中突变碱基与氨基酸序列

在100个被测序的转化子中，有11个突变体发生了核苷酸变化，但没有引起氨基酸变化。核苷酸发生改变又引起氨基酸变化的突变体共14个，占14％。发生错义突变的突变体分别为m1、m2、m5、m6、m7、m8、m10、m11、m13、m17、m18、m19、m21和m25。在获得的25个突变体中，没有出现突变后产生终止密码子的情况，也没有发现碱基插入和缺失突变。

对100个阳性转化子的测序分析结果显示，100个转化子中，有25个突变体发生了碱基突变，共产生29个核苷酸位点突变(表4)，每个突变体平均发生1.2个碱基突变，与预期的每个突变体发生1.5个碱基突变基本一致。在29个突变的核苷酸位点中，大部分的碱基替换发生在at→gc，占总突变位点的82.8％，鸟嘌呤和胞嘧啶产生的突变较少，仅有3.4％，这与之前报道的taqdna聚合酶在进行pcr反应时具有at→gc错配的倾向性一致。

3.4突变位点的分布

利用origin8.0对随机突变文库中的29个碱基突变位点进行统计分析，结果如图4所示。在sip1aa核苷酸序列的91-1005bp之间，发生突变的碱基位点分布较为均匀，未发现突变热点。除了第1036位碱基外，其余每个碱基位点均发生1次突变。突变体m6中第1036位的胸腺嘧啶突变为鸟嘌呤，导致第346位的苯丙氨酸被缬氨酸取代；突变体m13中第1036位胸腺嘧啶突变为胞嘧啶，导致第346的苯丙氨酸突变为亮氨酸。

3.5随机突变文库蛋白表达

对随机重组文库中的重组菌株在大肠杆菌jm109中表达的蛋白进行提取，sds-page分析发生错义突变的突变体蛋白表达情况，如图5所示。以cry1ac启动子指导表达的sip1aa蛋白为阳性对照，以大肠杆菌中表达的puc19为阴性对照。结果表明，随机突变体文库中的所有突变体均在大肠杆菌中成功表达，表达产物中含有37.6kda的目的蛋白，与sip1aa蛋白大小一致(图5)。

3.6生物活性测定

首先对14个突变体进行了初步的活性测试，结果显示突变蛋白m6(f346v)和m8(r174s)对大猿叶甲的致死率高于pacsip1aa蛋白，突变蛋白m1(a31g，y118c，d227e)、m2(n305i，t324a)、m5(k168r)和m21(i307t)对大猿叶甲的杀虫活性低于pacsip1aa。突变蛋白m7(f89l)、m10(k168n)、m11(i45v)、m13(f364l)、m17(d141g)、m18(n317d)、m19(k193k，e235g)、m25(n75s)和pacsip1aa对大猿叶甲的致死率无显著差异。

表5sip1aa随机突变蛋白对大猿叶甲的杀虫结果

将突变体m1、m2、m5、m6、m8和m21纯化后对大猿叶甲进行复筛，以pbs缓冲液作为阴性对照。复筛的蛋白浓度设置为0.1μg/ml，1μg/ml，5μg/ml，10μg/ml，20μg/ml和50μg/ml六个浓度梯度，每个浓度设置三次重复，每个重复接种16头虫，在27℃人工气候箱中培养48h后，统计昆虫死亡情况，计算lc50值。生物活性测定复筛结果见表5。

表5sip1aa随机突变蛋白对大猿叶甲的定量生物活性测定结果

从表6中可以看出，突变体m8突变体活性大大提高，对大猿叶甲的杀虫活性明显好于pac19sip1aa，活性提高了4.02倍，突变体m6对大猿叶甲的杀虫活性提高了2.19倍。突变体m2对大猿叶甲的杀虫活性略低于pac19sip1aa,m1，m5和m21对大猿叶甲的杀虫活性明显低于pac19sip1aa蛋白，活性降低了4倍、5倍和6倍。

3.7突变位点结构分析

利用pdbviewer软件对sip1aa蛋白随机重组文库中的突变体的m1(a31,y118,d227)、m5(k168)、m8(r174)和m21(i307)位点进行结构分析。

y118和d260能够形成两条分子内氢键，键长分别为和(图6中a)。当第118位苏氨酸被半胱氨酸所取代，c118与d260只能形成一个氢键，键长为(图6中b)。d227与y176形成两条氢键，键长分别为和(图6中c)。当第227位天冬氨酸突变为谷氨酸后，e227能与y176形成两条氢键，但是键长发生了变化，分别为和如图6中d所示。a31g的突变对sip1aa蛋白的结构无明显影响。这些突变使得突变体m1的稳定性相比于野生型sip1aa蛋白降低，导致了对大猿叶甲的杀虫活性降低。

突变体m5中k168和v236形式两个键长为和的氢键(图6中e)。当第168位赖氨酸被精氨酸所取代，氢键消失(图6中f)。突变体m21中i307和t306形成的氢键键长为(图6中i)。i307被苏氨酸取代后，氢键消失。氢键能够维持空间结构的稳定。突变体m5和m21失去了稳定的分子内氢键，可能导致该蛋白的空间结构发生变化，降低了其对大猿叶甲的杀虫活性。

突变体m8中第174位精氨酸位于β11折叠上，如图6中g所示。当第174位碱性的精氨酸被中性的丝氨酸取代后(图6中h)，突变体蛋白与野生型sip1aa蛋白相比提高了4倍。可能在这个位置上，中性氨基酸更有利于sip1aa蛋白在大猿叶甲中发挥毒杀作用。

4结论

本发明采用随机重组技术将sip1aa蛋白进行改造，突变体m8和m6的杀虫活性明显提高,突变体m8活性提高了4.02倍，突变体m6对大猿叶甲的杀虫活性提高了2.19倍。另外因为更改了载体的启动子，sip1aa突变体蛋m8,m6蛋白质的表达量提高了，溶解性高了，稳定性好。

序列表

<110>东北农业大学

<120>sip1aa蛋白随机重组突变蛋白

<141>2020-12-02

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>364

<212>prt

<213>苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)

<400>1

metlystyrlyspheserlysvalvallyscysthrleuproalaleu

151015

metilethrthrphevalthrprosermetalavalphealaalaglu

202530

thrlysserproasnleuasnalaserglnglnalailethrprotyr

354045

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<211>1095

<212>dna

<213>苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)

<400>2

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