本发明涉及三步沉淀提取海参体壁主要卵黄蛋白的方法，属于蛋白质提取领域。
背景技术：
：海参体壁中主要卵黄蛋白是一种糖磷脂蛋白，主要有两种存在形式，分别是低分子量的主要卵黄蛋白和高分子量的主要卵黄蛋白原，主要卵黄蛋白原是合成主要卵黄蛋白的前体物质。海参体壁中的主要卵黄蛋白是以高聚体的形式存在，一般含有较高的分子量。已有研究表明，主要卵黄蛋白与生物体内的氨基酸、脂肪、碳水化合物、维生素、矿物质等营养和功能物质的转运传递密切相关，而且主要卵黄蛋白可以作为免疫因子抵御外界病原微生物的入侵。因此，如何有效的开发利用主要卵黄蛋白得到了越来越多人的关注。目前，对主要卵黄蛋白的提取集中于酸沉淀或者有机试剂沉淀的方法，所得主要卵黄蛋白纯度低，结构不完整；而通过离子柱等提纯的主要卵黄蛋白虽然纯度高，但是提取效率低，不适合工业化批量生产。技术实现要素：为了解决上述问题，本发明提供了一种三步沉淀提取海参体壁主要卵黄蛋白的方法，本发明方法采用酸沉淀和有机试剂沉淀协同沉淀以及sevage试剂和硫酸铵沉淀的三步沉淀法得到了海参体壁主要卵黄蛋白，产率高，纯度高，操作简单，单次可以大量提取，成本低，适合批量生产加工。具体的，本发明的技术方案为：一种三步沉淀提取海参体壁主要卵黄蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：步骤1)海参体壁预处理：将新鲜海参解剖去除体腔内容物，洗净沥干水分，经匀浆机搅碎，得到海参泥；步骤2)蛋白粗提取：将步骤(1)得到的海参泥与pbs缓冲液按1：3-5g/ml进行混合，0-10℃浸提12-20h，之后离心，离心后所得的蛋白上清液即为蛋白粗体液，此过程重复2-3次，并合并上清液；步骤3)三氯乙酸和丙酮混合沉淀：将步骤2)得到的混合上清液在50-70℃下进行浓缩，浓缩至原体积的1/3-1/5，将所得浓缩液边搅拌边加入三氯乙酸，使得三氯乙酸的终浓度为10％-15％，同时加入浓缩液1-1.5倍体积的丙酮，搅拌均匀后，0-10℃静置3-5h，离心后收集沉淀，此过程重复2～3次，合并沉淀物；步骤4)用sevage试剂除去非糖蛋白：将步骤3)得到的沉淀物复溶于8-10倍体积的pbs缓冲液，调ph至7.2-7.4，所得溶液采用sevage试剂除去杂蛋白，得到海参体壁主要卵黄蛋白；步骤5)将步骤4)得到的海参体壁主要卵黄蛋白边搅拌边加入硫酸铵沉淀目标蛋白，使得硫酸铵的终浓度为30％-40％，4-10℃条件下，磁力搅拌器中震荡30-50min，再经离心后，收集所得沉淀；步骤6)透析除盐：将步骤5)所得沉淀中加入3-5倍体积的pbs缓冲液中复溶，对盐溶液进行透析除盐，透析袋选用分子量为8000-10000da，透析时间24-36h，即得主要卵黄蛋白溶液；步骤7)冷冻干燥：将步骤6)中所得的主要卵黄蛋白溶液进行冷冻干燥，得到主要卵黄蛋白干粉。在本发明的一种实施方式中，步骤1)中所述pbs缓冲液的ph为7.0～7.4、浓度0.01-0.05mol/l。在本发明的一种实施方式中，步骤3)中所述浓缩是真空旋转蒸发器中进行。在本发明的一种实施方式中，步骤3)中三氯乙酸和丙酮的作用是沉淀全蛋白，将蛋白与多糖、脂肪等其它营养物质分离。在本发明的一种实施方式中，步骤4)中所述pbs缓冲液的ph为7.0-7.4、浓度0.01-0.05mol/l。在本发明的一种实施方式中，步骤4)中调节ph用的是1-1.5mnaoh溶液。在本发明的一种实施方式中，所述sevage试剂为氯仿和正丁醇体积比为5:1的混合试剂。在本发明的一种实施方式中，所述磁力搅拌器的功率为100w，搅拌速率为200r/min。在本发明的一种实施方式中，步骤5)中所述离心为低温离心，操作温度为4-10℃，转速是3000-4000r/min，时间是10-15min。在本发明的一种实施方式中，步骤6)中所述pbs缓冲液的ph为7.0-7.4、浓度0.01-0.05mol/l。在本发明的一种实施方式中，步骤6)中冷冻干燥的操作参数：温度为-83±1℃、时间为36-48h。本发明同现有技术相比，具有如下优点：本发明的海参体壁蛋白的提取方法采用了酸沉淀和有机试剂沉淀协同沉淀蛋白的方法，增加了蛋白沉淀速率，提高了主要卵黄蛋白提取率；采用sevage试剂和硫酸铵沉淀目标蛋白的方法，避免杂质蛋白对主要卵黄蛋白的影响，提高了产品的纯度，使终产品的纯度83％以上；本发明经过三步沉淀(tca和丙酮协同沉淀，sevage沉淀和硫酸铵沉淀)的方法所得的主要卵黄蛋白产率高提取率约为海参干重的13.9％，纯度高；另外，对比其他对主要卵黄蛋白沉淀的方法，如过离子柱或者蛋白纯化仪的方法，本发明方法的显著优势是操作简单，单次可以大量提取，成本低，适合批量生产加工；终产品采用透析和冷冻干燥的方式，既可以防止蛋白质变性，又能除去盐离子的影响，得到的产品具有外貌疏松，溶解性好、结构稳定和纯度高等特点。终产品主要卵黄蛋白粉经过不同的染色方法和质谱鉴定，确定主要卵黄蛋白是一种糖磷脂蛋白。附图说明图1实施例1中分步沉淀后蛋白的电泳图，其中，1—步骤2)pbs提取得到的蛋白；2—步骤3)10％tca 1倍体积丙酮沉淀后复溶的蛋白；3—步骤4)sevage除杂后的蛋白；4—步骤5)硫酸铵沉淀后的蛋白5：5—步骤6)透析后样品中的蛋白；左边的图为考马斯亮蓝染色蛋白，右侧的图为高碘酸-shiff染色糖蛋白。图2实施例1中得到的主要卵黄蛋白液相图。图3主要卵黄蛋白经过不同染色剂染色后电泳图，其中，a为非还原型电泳图、b为还原型电泳图，图中m：蛋白分子量标准品；1和2：考马斯亮蓝染色蛋白；3和4：schiff和高碘酸染色糖蛋白；5和6：苏丹黑染色脂蛋白；7和8：甲基绿染色磷蛋白。图4冷冻干燥后，主要卵黄蛋白经质谱鉴定结果，经生信学分析后，得到主要卵黄蛋白主要有5种亚基组成。图5实施例3中不同浓度硫酸铵沉淀目的蛋白含量图(从右到左，硫酸铵的终浓度为分别是0，20％，40％，60％，80％，100％。)图6实施例3中不同的硫酸铵终浓度沉淀目标蛋白得到的蛋白电泳图，由左到右，硫酸铵的终浓度为分别是0，20％，40％，60％，80％，100％。具体实施方式lc-ms/ms鉴定的操作参数：所用的仪器为qexactivetmplus质谱仪(thermofisherscientific,ma,usa)。共上样3μl样品(分析柱：acclaimpepmapc18,75μmx25cm)，柱流量控制在300nl/min，柱温为40℃，电喷雾电压2kv，色谱梯度如下表(流动相a相：0.1％甲酸水溶液；b相：含0.1％甲酸的acn溶液)，肽段溶解在流动相a(0.1％甲酸和2％乙腈的水溶液)后，使用easy-nlc1200超高效液相系统进行分离。分离梯度设置：流动相b(0.1％甲酸和90％乙腈的水溶液)从8％～20％的梯度洗脱35min；从20％～35％的梯度洗脱6min；从35％～100％的梯度洗脱1min；达100％梯度后持续12min。下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例1步骤1)海参体壁预处理：将新鲜海参解剖去除体腔内容物，洗净沥干水分，经匀浆机搅碎，得到海参泥；步骤2)蛋白粗提取：将步骤(1)得到的海参泥与pbs缓冲液(ph＝7.4)按质量体积比1：5g/ml进行混合，4℃浸提18h，之后离心，离心后所得的蛋白上清液即为蛋白粗体液，此过程重复3次，并合并上清液；步骤3)浓缩三氯乙酸和丙酮混合沉淀：将步骤2)得到的混合上清液在60℃下进行浓缩，浓缩至原体积的1/4，将所得浓缩液边搅拌边加入终浓度为10％的tca 1倍体积的丙酮作为沉淀试剂，4℃静置3h，离心后收集沉淀，此过程重复2次，合并沉淀物；步骤4)用sevage试剂除去非糖蛋白：将步骤3)得到的沉淀物复溶于8倍体积的pbs缓冲液(ph＝7.4，浓度为0.01mol/l)，调ph至中性，所得溶液采用sevage试剂除去杂蛋白，得到海参体壁主要卵黄蛋白；步骤5)将步骤4)得到的海参体壁主要卵黄蛋白边搅拌边加入40％的硫酸铵沉淀目标蛋白，4℃条件下，磁力搅拌器中震荡30min，再经离心后，收集所得沉淀；步骤6)透析除盐：将步骤5)所得沉淀中加入3倍体积的pbs缓冲液中复溶，对盐溶液进行透析除盐，透析袋选用分子量为8000da，透析时间24h，即得主要卵黄蛋白溶液；步骤7)冷冻干燥：将步骤6)中所得的主要卵黄蛋白溶液进行冷冻干燥40小时，得到主要卵黄蛋白干粉。图1为分布沉淀后蛋白的电泳图，可见，1条带的粗蛋白经过三步沉淀后，所得的目标条带的蛋白条带不断富集，尤其是经过透析后，蛋白的丰度显著增加。说明三步沉淀法是对目标蛋白不断分离纯化的过程。另外，可以上下对比图发现，所提纯的主要卵黄蛋白的结构比较完整，分子量较大，经过β-巯基乙醇打断二硫键后，所得的主要卵黄蛋白的分子量下降。因此，经过三步沉淀的方法所得的主要卵黄蛋白结构保留完整，蛋白纯度为83.87％。图2为步骤7)得到的主要卵黄蛋白的液相图谱，色谱图结果显示单一对称尖峰，表明分离制得的糖蛋白为分子量相对单一的组分，具有较高的纯度，同时根据标准分子量葡聚糖绘制的标准曲线，计算得到目标糖蛋白的相对重均分子量为2.0×106da，该结果与电泳测定结果相吻合。电泳条带处于最顶端，说明该蛋白是分子量较大的聚合体。图3为步骤7)得到的主要卵黄蛋白的经过不同的染色剂染色后的蛋白电泳图，图中蓝色的条带1和2代表考马斯亮蓝染色，可以看到蛋白条带1和2两个条带染色清晰，且观察到该蛋白在150kda分子量左右不断聚集，表明所提取的物质是一种蛋白，再加入β巯基乙醇后蛋白的分子量有所降低，表明该蛋白中含有二硫键；桔色的条带3和4代表高碘酸-schiff染色，可以被染色，代表该目标蛋白还是一种糖蛋白；红色条带5和6是苏丹黑染色，可以被染色，表明该目标蛋白还是一种脂蛋白，绿色条带7和8是甲基绿染色，可以被染色，表明该蛋白还是一种脂蛋白。综合上述结果，该目标蛋白主要卵黄蛋白是一种糖磷脂蛋白。对得到的主要卵黄蛋白进行lc-ms/ms鉴定，结果见图4和表1可知，该目标蛋白是主要卵黄蛋白，而且该目标蛋白是一个聚合体，由5种不同的亚基构成，其中最主要的亚基分子量在171.798kda,这与电泳的鉴定结果相吻合。表1海参体壁主要卵黄蛋白的组成及含量分析序号分子量蛋白名称序列号含量(％)1171981主要卵黄蛋白a0a2g8kcu434.42259921主要卵黄蛋白a0a2g8kcs619.533430119主要卵黄蛋白a0a2g8k7r817.79479931主要卵黄蛋白a0a2g8kcp916.60591257主要卵黄蛋白a0a2g8k7m88.86实施例2改变步骤3)的沉淀试剂，验证其沉淀效果。沉淀试剂分别为添加三氯乙酸(tca)至终浓度为10％、10％tca 1倍体积丙酮、加1m盐酸调节ph为3.7、加1m盐酸调节ph为3.7 1倍体积丙酮、2倍体积丙酮。对比选择不同沉淀剂对粗蛋白的影响，离心后观察所沉淀的蛋白，单独添加2倍体积的丙酮后，蛋白的沉淀量最大，但当添加终浓度为10％的tca 1倍体积丙酮作为沉淀剂时，所沉淀的蛋白颜色较白，这说明10％的tca 1倍体积丙酮能够协同沉淀，使得沉淀得到的蛋白含量高。另外，添加实验过程中添加20％的tca沉淀量比较多，但是考虑到极酸环境会导致蛋白变性，因此选用浓度较低的10％tca协同丙酮沉淀蛋白。丙酮单独沉淀时添加量是2倍体积，但是有机试剂过多引入，也会导致蛋白变性，因此本文中选用沉淀量较多的1倍体积的丙酮作为关键控制点。实施例3改变步骤5)中硫酸铵的终浓度分别为0、20％、40％、60％、80％、100％。通过比较不同浓度梯度的硫酸铵对蛋白沉淀结果(图5和图6)，发现随着硫酸铵量的增加，蛋白的沉淀量逐渐增加，在硫酸铵和水的质量体积比为0.4时，所沉淀的蛋白含量较多，而且条带较干净，无杂质污染。同时，考虑到下一步的透析除盐难易程度，所以在本方法中选择硫酸铵和的终浓度为30-40％。实施例4步骤1)海参体壁预处理：将新鲜海参解剖去除体腔物，洗净沥干水分，经匀浆机搅碎，得到海参泥；步骤2)蛋白粗提取：将步骤(1)得到的海参泥与pbs缓冲液(ph＝7.4)按质量体积比1：5进行混合，4℃浸提20h，之后离心，离心后所得的蛋白上清液即为蛋白粗体液，此过程重复2次，并合并上清液；步骤3)浓缩三100mg/ml氯乙酸和丙酮混合沉淀：将步骤2)得到的混合上清液在70℃下进行浓缩，浓缩至原体积的1/3，将所得浓缩液边搅拌边加入10％tca 1倍体积的丙酮作为沉淀试剂，4℃静置3h，离心后收集沉淀，此过程重复2次，合并沉淀物；步骤4)用sevage试剂除去非糖蛋白：将步骤3)得到的沉淀物复溶于8倍体积的pbs缓冲液，调ph至中性，所得溶液采用sevage试剂除去杂蛋白，得到海参体壁主要卵黄蛋白；步骤5)将步骤4)得到的海参体壁主要卵黄蛋白边搅拌边加入40％的硫酸铵沉淀目标蛋白，4℃条件下，磁力搅拌器中震荡30min，再经离心后，收集所得沉淀；步骤6)透析除盐：将步骤5)所得沉淀中加入3倍体积的pbs缓冲液中复溶，对盐溶液进行透析除盐，透析袋选用分子量为10000da，透析时间24h，即得主要卵黄蛋白溶液；步骤7)冷冻干燥：将步骤6)中所得的主要卵黄蛋白溶液进行冷冻干燥，得到主要卵黄蛋白干粉。通过此方法获得蛋白的提取率占海参干重的13.9％，蛋白纯度纯度为83％，虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。当前第1页1 2 3
技术特征：1.一种三步沉淀提取海参体壁主要卵黄蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤1)海参体壁预处理：将新鲜海参解剖去除体腔内容物，洗净沥干水分，经匀浆机搅碎，得到海参泥；
步骤2)蛋白粗提取：将步骤(1)得到的海参泥与pbs缓冲液按1：3-5g/ml进行混合，0-10℃浸提12-20h，之后离心，离心后所得的蛋白上清液即为蛋白粗体液，此过程重复2-3次，并合并上清液；
步骤3)三氯乙酸和丙酮混合沉淀：将步骤2)得到的混合上清液在50-70℃下进行浓缩，浓缩至原体积的1/3-1/5，将所得浓缩液边搅拌边加入三氯乙酸，使得三氯乙酸的终浓度为10％-15％，同时加入浓缩液1-1.5倍体积的丙酮，搅拌均匀后，0-10℃静置3-5h，离心后收集沉淀，此过程重复2～3次，合并沉淀物；
步骤4)用sevage试剂除去非糖蛋白：将步骤3)得到的沉淀物复溶于8-10倍体积的pbs缓冲液，调ph至7.2-7.4，所得溶液采用sevage试剂除去杂蛋白，得到海参体壁主要卵黄蛋白；
步骤5)将步骤4)得到的海参体壁主要卵黄蛋白边搅拌边加入硫酸铵沉淀目标蛋白，使得硫酸铵的终浓度为30％-40％，4-10℃条件下，磁力搅拌器中震荡30-50min，再经离心后，收集所得沉淀；
步骤6)透析除盐：将步骤5)所得沉淀中加入3-5倍体积的pbs缓冲液中复溶，对盐溶液进行透析除盐，透析袋选用分子量为8000-10000da，透析时间24-36h，即得主要卵黄蛋白溶液；
步骤7)冷冻干燥：将步骤6)中所得的主要卵黄蛋白溶液进行冷冻干燥，得到主要卵黄蛋白干粉。
2.根据权利要求1所述的一种三步沉淀提取海参体壁主要卵黄蛋白的方法，其特征在于，步骤1)中所述pbs缓冲液的ph为7.0-7.4、浓度0.01-0.05mol/l。
3.根据权利要求1或2所述的一种三步沉淀提取海参体壁主要卵黄蛋白的方法，其特征在于，步骤3)中所述浓缩是真空旋转蒸发器中进行。
4.根据权利要求1～3任一所述的一种三步沉淀提取海参体壁主要卵黄蛋白的方法，其特征在于，步骤4)中所述pbs缓冲液的ph为7.0-7.4、浓度0.01-0.05mol/l。
5.根据权利要求1～4任一所述的一种三步沉淀提取海参体壁主要卵黄蛋白的方法，其特征在于，步骤4)中调节ph用的是1-1.5mnaoh溶液。
6.根据权利要求1～5任一所述的一种三步沉淀提取海参体壁主要卵黄蛋白的方法，其特征在于，所述sevage试剂为氯仿和正丁醇体积比为5:1的混合试剂。
7.根据权利要求1～6任一所述的一种三步沉淀提取海参体壁主要卵黄蛋白的方法，其特征在于，步骤5)中所述离心为低温离心，操作温度为4-10℃，转速是3000-4000r/min，时间是10-15min。
8.根据权利要求1～7任一所述的一种三步沉淀提取海参体壁主要卵黄蛋白的方法，其特征在于，步骤6)中所述pbs缓冲液的ph为7.0-7.4、浓度0.01-0.05mol/l。
9.根据权利要求1～8任一所述的一种三步沉淀提取海参体壁主要卵黄蛋白的方法，其特征在于，步骤6)中冷冻干燥的操作参数：温度为-83±1℃、时间为36-48h。
10.权利要求1～9任一所述的一种三步沉淀提取海参体壁主要卵黄蛋白的方法在海参体壁蛋白提取中的应用。
技术总结本发明公开了三步沉淀提取海参体壁主要卵黄蛋白的方法，属于蛋白质提取领域，本发明以海参体壁为原料，制备海参体壁蛋白粗提液、酸沉淀混合丙酮沉淀蛋白、Sevage除去杂蛋白、硫酸铵沉淀目标蛋白、透析法低温除盐及冷冻干燥，获得纯度较高的主要卵黄蛋白，并通过质谱和电泳技术协同鉴定该蛋白主要卵黄蛋白是一种糖磷脂蛋白。本发明提高了海参的高值化利用，使其蛋白资源得到充分开发利用，为蛋白靶向功能活性研究提供前提基础；全过程实验操作简单，蛋白的提取率和纯度较高，不需要特殊高级仪器辅助，经过三步沉淀分离目标蛋白，单次可获得大量的主要卵黄蛋白，适合大规模和高精度纯度研究；蛋白鉴定特异性强，结果清晰直观，操作简便。
技术研发人员：周鹏;冯建慧;张丽娜
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：2020.12.21
技术公布日：2021.03.12
