本案是以申请号为2019104871822，申请日为2019年6月5日，名称为《一种人工合成抗菌肽及其设计方法与应用》的专利申请为母案的分案申请。
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种人工合成抗菌肽及其应用。
背景技术：
抗生素作为一类重要的抗感染类药物，自应用以来已拯救了无数人的生命。然而随着临床和畜牧养殖业中长期大剂量地使用抗生素，在抗菌药物的选择压力、耐药基因水平传播和耐药克隆菌株传播等因素的共同作用下，多重耐药菌已经开始泛滥[1]。临床上常见的耐药菌包括多重耐药鲍曼不动杆菌(multidrug-resistantacinetobacterbaumannii，mdrab)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantstaphylococcusaureus，mrsa)、产超广谱β-内酰胺酶(extendedspectyum-β-lactamase，esbls)大肠埃希菌和产esbls肺炎克雷伯菌等多种[2]，这对人类的生命健康构成了严重的威胁。
由于细菌生命周期短，突变极易产生并积累，在现今普遍存在抗生素的环境中耐药菌很容易被筛选出来并成为优势菌群。新近研究表明，在实验室只需要短短10天的时间便可产生耐药菌，其耐受能力可达到最小抑菌浓度(minimuminhibitoryconcentration，mic)的1000倍[3]。英国的抗菌耐药委员会在最近的一项研究中预计，如果人类一直无法开发出新型的抗生素，到2050年，全球每年将有1000万人死于抗药性感染[4]，这种感染将超过癌症重新成为最重要的致死原因。简单来说，细菌耐药性已经成为全球亟待解决的公共卫生危机。
抗菌肽(anti-microbialpeptides，amps)是一类分子量在2000～7000左右的短肽，一般由10～60个氨基酸残基组成，通常带正电荷。amps是生物界中从微生物到人类等大部分生物体内一种重要的防御系统组成成分[5]。amps具有抗菌谱广、稳定性好、安全性高，且在不易产生耐药性等特点，目前被认为是抗感染类药物开发中最具有前景的候选物。大量天然来源或人工合成的抗菌肽正被进行广泛深入的研究，关注点主要包括抗菌活性[6-9]，细胞选择性[10]、生物膜抑制活性[10,11]和免疫调节活性[12]等。基础研究积累已达到一定的规模，目前仅数据库apd3收录的不同来源的amps就已超过3000条[13]。
尽管抗菌肽的应用前景令人期待，但目前国内外关于抗菌肽的临床药用开发力度仍有待加强。根据最新报道，国外现有10个抗菌肽相关药物在临床不同阶段开展研究[5]，而国内大部分研究仍处于临床前阶段。成药的amps相对较少，主要的困难包括amps生产成本较高，缺乏系统的长期毒理评估数据和amps容易被蛋白酶降解等自身缺点[14]。因此，对现有amps进行改造，提高其成药性，也是目前研究的热点之一。随着amps数据信息的不断积累，加上生物信息学分析和大数据分析技术的发展，通过对现有amps序列和功能数据进行深度挖掘分析以获得新的amps或突变体的方法不仅理论上可行，而且实际上往往比从不同生物体分离得到amps的传统方法更富成效[14-16]。到目前为止，尚未见到有效且系统的设计方法介绍及应用的相关报道。
主要参考文献：
[1]王明贵,x.guan,l.he,b.hu,j.hu,x.huang,g.lai,y.li,y.liu,y.ni,h.qiu,z.shao,y.shi,m.wang,r.wang,d.wu,c.xie,y.xu,f.yang,k.yu,y.yu,j.zhang,c.zhuo,广泛耐药革兰阴性菌感染的实验诊断、抗菌治疗及医院感染控制:中国专家共识,中国感染与化疗杂志(01)(2017)82-92.
[2]玛依拉·阿布都热依木,屈涛,党楠,杨凡,1145例重症监护病房多重耐药菌种类及药敏结果分析,世界最新医学信息文摘(02)(2016)214 213.
[3]m.baym,t.d.lieberman,e.d.kelsic,r.chait,r.gross,i.yelin,r.kishony,spatiotemporalmicrobialevolutiononantibioticlandscapes,science353(6304)(2016)1147-1151.
[4]o.n.silva,c.delafuente-nunez,e.f.haney,i.c.fensterseifer,s.m.ribeiro,w.f.porto,p.brown,c.faria-junior,t.m.rezende,s.e.moreno,t.k.lu,r.e.hancock,o.l.franco,ananti-infectivesyntheticpeptidewithdualantimicrobialandimmunomodulatoryactivities,scirep6(2016)35465.
[5]m.mahlapuu,j.hakansson,l.ringstad,c.bjorn,antimicrobialpeptides:anemergingcategoryoftherapeuticagents,front.cell.infect.microbiol.6(2016)194.
[6]s.t.amos,l.s.vermeer,p.m.ferguson,j.kozlowska,m.davy,t.t.bui,a.f.drake,c.d.lorenz,a.j.mason,antimicrobialpeptidepotencyisfacilitatedbygreaterconformationalflexibilitywhenbindingtogram-negativebacterialinnermembranes,scirep6(2016)37639.
[7]l.cao,c.dai,z.li,z.fan,y.song,y.wu,z.cao,w.li,antibacterialactivityandmechanismofascorpionvenompeptidederivativeinvitroandinvivo,plosone7(7)(2012)e40135.
[8]f.zhang,x.cui,y.fu,j.zhang,y.zhou,y.sun,x.wang,y.li,q.liu,t.chen,antimicrobialactivityandmechanismofthehumanmilk-sourcedpeptidecasein201,biochemicalandbiophysicalresearchcommunications485(1)(2017)689-704.
[9]y.sun,y.zhou,x.liu,f.zhang,l.yan,l.chen,x.wang,h.ruan,c.ji,x.cui,j.wang,antimicrobialactivityandmechanismofpdc213,anendogenouspeptidefromhumanmilk,biochemicalandbiophysicalresearchcommunications484(1)(2017)132-137.
[10]s.k.zhang,j.w.song,f.gong,s.b.li,h.y.chang,h.m.xie,h.w.gao,y.x.tan,s.p.ji,designofanalpha-helicalantimicrobialpeptidewithimprovedcell-selectiveandpotentanti-biofilmactivity,scirep6(2016)27394.
[11]n.gordya,a.yakovlev,a.kruglikova,d.tulin,e.potolitsina,t.suborova,d.bordo,c.rosano,s.chernysh,naturalantimicrobialpeptidecomplexesinthefightingofantibioticresistantbiofilms:calliphoravicinamedicinalmaggots,plosone12(3)(2017)e0173559.
[12]l.martin,k.horst,f.chiazza,s.oggero,m.collino,k.brandenburg,f.hildebrand,g.marx,c.thiemermann,t.schuerholz,thesyntheticantimicrobialpeptide19-2.5attenuatessepticcardiomyopathyandpreventsdown-regulationofserca2inpolymicrobialsepsis,scirep6(2016)37277.
[13]g.wang,x.li,z.wang,apd3:theantimicrobialpeptidedatabaseasatoolforresearchandeducation,nucleicacidsres44(d1)(2016)d1087-93.
[14]c.d.fjell,j.a.hiss,r.e.hancock,g.schneider,designingantimicrobialpeptides:formfollowsfunction,naturereviews.drugdiscovery11(1)(2011)37-51.
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[16]l.e.uggerhoj,t.j.poulsen,j.k.munk,m.fredborg,t.e.sondergaard,n.frimodt-moller,p.r.hansen,r.wimmer,rationaldesignofalpha-helicalantimicrobialpeptides:do'sanddon'ts,chembiochem:aeuropeanjournalofchemicalbiology16(2)(2015)242-53.
技术实现要素：
本发明所要解决的第一个技术问题是：提供一种能够快速有效地获得人工合成抗菌肽的设计方法。
本发明所要解决的第二个技术问题是：提供至少一种能够有效抗菌的人工合成肽。
本发明所要解决的第三个技术问题是：提供至少一种上述抗菌肽的应用。
为解决上述第一个技术问题，本发明的技术方案为：一种人工合成抗菌肽的设计方法，包括以下步骤：以天然抗菌肽序列为基础，将天然抗菌体的肽骨架序列反转作为基本骨架序列，再对所述基本骨架序列和/或经所述基本骨架序列突变得到的多肽序列进行评估分析，筛选出具有抗菌性的人工合成抗菌肽序列。
进一步地，所述评估分析操作包括通过软件进行理论预测，筛选出可能具有抗菌性的人工合成抗菌肽序列的步骤，所述软件采用的算法为svm、randomforest、artificialneuralnetwork或discriminantanaylsis中的至少一种。
优选地，所述理论预测的判定标准为经svm、randomforest、artificialneuralnetwork和discriminantanaylsis算法评估后概率均大于50％，则判定为可能具有抗菌性的人工合成抗菌肽序列。
进一步地，所述评估分析还包括在通过软件进行理论预测分析后，再针对可能具有抗菌性的人工合成抗菌肽序列进行理化性能评估分析，筛选出具有抗菌性的人工合成抗菌肽序列的步骤。
优选地，所述理化性能评估分析包括最低抑菌浓度(minimuminhibitoryconcentration，mic)值、溶血率、热稳定性中的至少一种。
优选地，所述mic值是抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、mrsa-1、mrsa-2、mrsa-3、mrsa-4、哈氏弧菌或副溶血弧菌中至少一种的最低浓度值。
进一步地，所述突变包括氨基酸残基增加、氨基酸残基减少、氨基酸残基替换、化学修饰或肽链环化中的至少一种。
优选地，所述化学修饰是指引入其它基团。
进一步地，所述设计方法还包括对经所述基本骨架序列突变得到的多肽序列再次进行突变得到的氨基酸序列，并对再次进行突变得到的氨基酸序列进行评估分析。
进一步地，所述天然抗菌肽包括抗菌肽ll37、抗菌肽kr15或穿膜肽ke21中的至少一种。
优选地，所述人工合成抗菌肽序列如seqno.id3、seqno.id6、seqno.id7、seqno.id9、seqno.id12、seqno.id13、seqno.id14或seqno.id17所示。
为解决上述第二个技术问题，本发明的技术方案为：一种人工合成抗菌肽，所述抗菌肽为根据上述方法设计得到的人工合成抗菌肽的氨基酸序列通过化学合成或生物合成法制备而得。
为解决上述第三个技术问题，本发明的技术方案为：上述人工合成抗菌肽在临床抗感染药物、防腐剂或饲料添加剂的制备中的应用。
进一步地，所述防腐剂为用于食品或化妆品中的防腐剂。
本发明的有益效果在于：本发明建立了一种半理性的设计方法，该方法以现有天然amps序列为基础，通过序列反转获得基本骨架序列，然后通过氨基酸残基置换、截短或延长等方式进行虚拟突变，采用多个在线软件评价序列成为抗菌肽的概率，优选其中概率高的突变体，通过合成获得短肽，测定所得系列短肽的抗菌活性等相关理化性质以评估其是否为amps；本发明方法基于现有amps序列和活性信息，利用生物信息学手段完成虚拟突变，并通过实验验证，该方法能够高效快速地筛选出抗菌肽，已解决目前通过天然成分分离提取amps成本高、效率低、成功率低等问题。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式详予说明。
本发明实施例一为：一种人工合成抗菌肽的方法，包括以下步骤：以抗菌肽ll37序列(如seqid.no.1所示)为基础，将所述抗菌肽ll37序列llgdffrkskekigkefkrivqrikdflrnlvprtes经反转得到基本骨架序列setrpvlnrlfdkirqvirkfekgikekskrffdgll，该序列命名为se37(如seqid.no.2所示)。
以se37进行氨基酸替换或获去掉部分氨基酸残基，得到一系列突变体，具体如下：
(1)以se37为基础，去掉后端部分氨基酸残基得到se30(如seqid.no.3所示)，通过软件svm、randomforest、artificialneuralnetwork和discriminantanalysis理论预测其成为抗菌肽的可能性(其中，se37和se30的氨基酸序列具体如下：se37：setrpvlnrlfdkirqvirkfekgikekskrffdgll，se30：setrpvlnrlfdkirqvirkfekgikeksk)，结果如下表1所示：
表1短肽se37和se30成为amps的概率(％)
从上表可以看出，svm、randomforest、artificialneuralnetwork和discriminantanalysis预测的概率均大于50％，表明se37和se30成为抗菌肽的可能性较大。
(2)按照序列seqidno.2或3通过常规的化学合成法合成相应的短肽，通过抗菌肽活性等相关实验验证同等条件下ll37、se37和se30的抗菌性能，结果如下表2所示：
表2抗菌肽ll37、se37和se30对各细菌的mic值(μm)
从上表2可以看出，se37和se30对于耐药菌具有较好的抗菌性能。
(3)以se30为基础，继续去掉后端部分氨基酸残基得到se20(如seqidno.4所示)；选择去掉前端部分氨基酸残基得到vl25-1(如seqidno.5所示)，通过软件svm、randomforest、artificialneuralnetwork和discriminantanalysis理论预测其成为抗菌肽的可能性(其中，se30、se20和vl25-1的序列具体如下：
se30：setrpvlnrlfdkirqvirkfekgikeksk；
se20：setrpvlnrlfdkirqvirk；
vl25-1:vlnrlfdkirqvirkfekgikeksk)，预测结果如下表3所示：
表3短肽se37和se30成为amps的概率(％)
从表3中可以看出，se20的预测概率均小于50％，理论预测其成为抗菌肽的可能性较小，而vl25-1的预测概率均在70％以上，理论预测其成为抗菌肽的可能性较大，可继续对其进行有针对性的改造。
(4)按照序列seqidno.4或5通过常规的化学合成法合成相应的短肽，通过抗菌肽活性等相关实验验证同等条件下ll37、se20、vl25-1和se30的抗菌性能，结果如下表4所示：
表4抗菌肽se37、se30、se20及vl25-1对各细菌的mic值(μm)
从上表4可以看出，抗菌肽se20的抗菌效果较差；抗菌肽vl25-1的抗菌效果一般，但成为抗菌肽的可能性较大，可继续对其进行有针对性的改造。
(5)以vl25-1为基础，进行氨基酸替换，进一步设计得到vl25-2(如seqidno.6所示)、vl25-3(如seqidno.7所示)、rl25-1(如seqidno.8所示)和rl25-2(如seqidno.9所示)，通过软件svm、randomforest、artificialneuralnetwork和discriminantanalysis理论预测其成为抗菌肽的可能性(其中，vl25-1、vl25-2、vl25-3、rl25-1和rl25-2的序列具体如下：
vl25-1:vlnrlfdkirqvirkfekgikeksk；
vl25-2:vlnrlfrkirqvirkfekgikeksk；
vl25-3:vlrrlfrkirevirkfekgikeflk；
rl25-1:rlnrlfdkirqvirkfekgikeksk；
rl25-2:rlnrlfrkirqvirkfekgikeksk；
结果如下表5所示：
表5短肽vl25-2，vl25-3，rl25-1，rl25-2成为amps的概率(％)
从上表5可以看出，vl25-1、vl25-2、vl25-3、rl25-1和rl25-2的预测概率均大于70％，成为抗菌肽的可能性均较大。
(6)分别按照序列seqidno.6～9通过常规的化学合成法合成相应的短肽，通过抗菌肽活性等相关实验验证同等条件下vl25-1、vl25-2、vl25-3、rl25-1和rl25-2的抗菌性能，结果如下表6所示：
表6抗菌肽vl25-1、vl25-2、vl25-3、rl25-1和rl25-2对各细菌的mic值(μm)
从上表6可以看出，vl25-2、vl25-3和rl25-2抗菌效果均较好。以天然抗菌肽ll37为基础，经过本发明方法的改造设计得到了se30、vl25-2、vl25-3和rl25-2等多条抗菌活性较好的抗菌肽。
取上述操作筛选出的人工合成抗菌肽按照常规操作进行溶血活性测试，结果发现分别在321μμ和157.5μμ的浓度下，抗菌肽vl25-2和rl25-2对红细胞的溶血率依次为4.65％和8.70％，在mic值条件下溶血率更低，表明本发明抗菌肽vl25-2和rl25-2对红细胞的渗透脆性可以忽略不计；同时抗菌肽se30、vl25-2、vl25-3和rl25-2在100℃下加热60min，抗菌活性不变，说明其具有较高的热稳定性。因此，通过本发明实施例方案设计改造得到的多条抗菌肽不仅抗菌活性好，而且溶血率、热稳定性等基本理化也较为优越。
本发明实施例二为：一种人工合成抗菌肽的方法，包括以下步骤：以抗菌肽kr15的氨基酸序列(如seqidno.10所示)为基础，将所述抗菌肽kr15序列krivqrikdflrnlv经反转得到基本骨架序列vlnrlfdkirqvirk命名为vl15(如seqidno.11所示)。
以vl15进行氨基酸替换或获去掉部分氨基酸残基，得到一系列突变体(包括fl15-1(如seqidno.12所示)、fl15-2(如seqidno.13所示)和fl15-3(如seqidno.14所示))，通过软件svm、randomforest、artificialneuralnetwork和discriminantanalysis理论预测其成为抗菌肽的可能性(其中，fl15-1、fl15-2和fl15-3的氨基酸序列具体如下：fl15-1：flkrlfdkirqlirk；fl15-2：flkrlfrkirqlirk；fl15-3：flkrlfrkirklirk)，结果如下表7所示：
表7短肽vl15，fl15-1，fl15-2和fl15-3成为amps的概率(％)
分别按照序列seqidno.12～14通过常规的化学合成法合成相应的短肽，通过抗菌肽活性等相关实验验证同等条件下vl15、fl15-1、fl15-2及fl15-3的抗菌性能，结果如下表8所示：
表8抗菌肽vl15、fl15-1、fl15-2及fl15-3对各细菌的mic值(μm)
以抗菌肽kr15为基础，经过本方法的改造设计得到fl15-1、fl15-2和fl15-3等多条抗菌活性较好的抗菌肽，其中分别在63.81μm、62.02μm和496.12μm的浓度下，抗菌肽fl15-1、fl15-2和fl15-3对红细胞的溶血率依次为6.03％、5.93％和8.62％，在其mic值条件下对红细胞的溶血率更低，表明本发明抗菌肽fl15-1、fl15-2和fl15-3对红细胞的渗透脆性可以忽略不计；同时抗菌肽fl15-1、fl15-2和fl15-3在100℃下加热60min，抗菌活性不变，表明其具有较高的热稳定性。因此，通过本发明实施例方案设计改造得到的多条抗菌肽不仅抗菌活性好，而且溶血率、热稳定性等基本理化也较为优越。
本发明实施例三为：一种人工合成抗菌肽的方法，包括以下步骤：以穿膜肽ke21的氨基酸序列(如seqidno.15所示)为基础，将穿膜肽ke21序列ketwwetwwtewsqpkkkrkv经反转得到基本骨架序列vkrkkkpqswetwwtewwtek命名为vk21-1(如seqidno.16所示)。
以vk21-1为基础进行氨基酸替换，得到一条突变体vk21(如seqidno.17所示，通过软件svm、randomforest、artificialneuralnetwork和discriminantanalysis理论预测其成为抗菌肽的可能性，其中，vk21的氨基酸序列具体如下：
vk21:vkrkkkpqswktwwtkwwtkk；
结果如下表9所示：
表9短肽vk21成为amps的概率(％)
分别按照序列seqidno.17通过常规的化学合成法合成相应的短肽，通过抗菌肽活性等相关实验验证同等条件下vk21的抗菌性能，结果如下表10所示：
表10抗菌肽vk21对各细菌的mic值(μm)
以抗菌肽ke21为基础，经过本方法的改造设计得到一条抗菌活性较好的抗菌肽vk21，在352μm的浓度下，抗菌肽vk21对红细胞的溶血率为0.62％，与阴性对照相当，说明本发明抗菌肽vk21对红细胞的渗透脆性可以忽略不计；同时抗菌肽vk21在100℃下加热30min，其抗菌活性不变，说明其具有较高的热稳定性。因此，通过本发明方法的改造设计得到的抗菌肽的抗菌活性等基本理化指标均较为优越。
综上所述，本发明提供了一种新型人工合成抗菌肽及其设计方法与应用，将生物信息学理论设计与试验评估相结合的方法，能够快速有效地获得序列新颖的抗菌肽，本发明提供的新型抗菌肽的设计方法，能够在天然抗菌肽的改造和人工抗菌肽的设计中能够得到较佳的应用。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<110>遵义医科大学珠海校区
<120>一种人工合成抗菌肽及其应用
<160>17
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>37
<212>prt
<213>未知(unknown)
<400>1
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20
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vallysarglyslyslysproglnsertrplysthrtrptrpthrlys
151015
trptrpthrlyslys
20
1.一种人工合成抗菌肽，其特征在于：所述抗菌肽序列如seqno.id7所示。
2.一种如权利要求1所述人工合成抗菌肽在临床抗感染药物制备中的应用。
3.一种如权利要求1所述人工合成抗菌肽在防腐剂制备中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述防腐剂为用于食品的防腐剂。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述防腐剂为用于化妆品的防腐剂。
6.一种如权利要求1所述人工合成抗菌肽在饲料添加剂制备中的应用。
技术总结