本发明属于生物技术领域。本发明涉及经计算机分析人血清白蛋白成熟肽氨基酸序列，与鼠、牛、猴、羊、兔下去白蛋白成熟肽氨基酸序列比对，选择出多个人血清白蛋白特异抗原决定簇氨基酸序列短肽，短肽氨基酸长度分别为15-35个。经人工合成短肽用于免疫小鼠，获得可产生不与鼠、牛、猴、羊、兔有免疫反应的特异抗人血清白蛋白单克隆抗体的鼠杂交瘤细胞工程株。由细胞株制备的抗体对人血清白蛋白具有超高的灵敏度和超强的特异性。
背景技术：
人血清白蛋白（hsa）是一种可溶性单体蛋白质，构成血液中蛋白总量的一半。白蛋白作为一种基本载体，携带传递脂肪酸、类固醇和激素分子等，其稳定的惰性性质是维持血压的一个重要因素。血清白蛋白是一种球状非糖基化的、分子量为65千道尔顿、具有585个氨基酸的血清蛋白质。这一蛋白（白蛋白前体）再通过高尔基体的转化加工，去除引导多肽，而分泌到细胞外。血清白蛋白有35个半胱氨酸，在血液中，白蛋白是一个有17个二硫键的单体（参见brownjr，“albuminstructure,function,anduses”pergamon,n.y.，1977）。当没有分泌多肽时，在酵母细胞内的白蛋白产物是错配状态，将失去90%的抗原性（与血浆中自然状态白蛋白相比），并且形成不溶性的白蛋白聚合体，不具有白蛋白的生物活性。现在用于临床的人血清白蛋白均是从人血浆中提取的。
白蛋白是血液中的主要成分，在人体内含量为每升血液含40-50克，其半衰期寿命为20天以上。在药物制剂组成中，白蛋白也常被用作药物的稳定剂，尤其是生物药和疫苗的制造。综上所述，利用基因工程技术，将人血清白蛋白与治疗性蛋白质基因融合在酵母菌或脊椎动物细胞中表达为重组融合蛋白后，该融合蛋白将具有极大的优势使之可抵御生物体内酶解作用，并可使治疗性蛋白质在体内体外的寿命大大提高，也就是可增加治疗性蛋白质在血清中和储存时的稳定性和较长的半衰期，达到蛋白药物的长效化，大大减少给药频率,在重大疾病临床治疗中获得更好的治疗效果（于在林、富岩，更优生物创新药-重组人血清白蛋白融合蛋白，中国医药生物技术，2017,12(3):248-264）。
当人的尿液中检测到微量白蛋白，反映出肾脏可能有异常渗漏蛋白质。尿微量白蛋白检测指标可作为糖尿病、肾病疾病等慢性病的早期诊断指标，对尿液中白蛋白定量检测，则具有重要的临床意义。因此，建立特异、灵敏的检测尿微量白蛋白的方法也具有重要的应用价值，而该方法的关键在于抗白蛋白单克隆抗体的灵敏度和特异性，即人血清白蛋白单克隆抗体，对抗原白蛋白检测灵敏度和特异性的高低，在临床上考察患者是否潜在患有糖尿病、肾病等慢性病的症状，这对于及早发现病情，及早治疗具有重要的临床意义。
另一方面，鉴于血源人血清白蛋白采血采浆都遇到显著困难，而人白蛋白在临床上，又是治疗休克、烧伤、创伤、低蛋白血症、急性血容量减少、癌症化疗、腹水、癌症晚期及提高老龄人的机体免疫力等多种临床适应症的治疗药物。因此，利用微生物、植物，特别是毕赤酵母工程菌生产重组表达人血清白蛋白（rhsa）已成为血源hsa的升级换代在研产品。于在林、富岩中国授权专利zl2004010057313.7和zl2008中公开重组人血清白蛋白的表达工程菌的构建、生产工艺和纯化工艺。但重组人血清白蛋白的纯度要求更为严格。利用抗体/抗原具有特异性识别的特点而开展抗体亲和层析分离纯化，可进一步将重组人血清白蛋白的纯度大大提高（大大降低宿主蛋白残留量），纯化效率也会更高，这对于临床患者用药的安全性和经济性将具有非常重要的价值。
抗人血清白蛋白单克隆抗体现已有市售的产品，但这些抗体虽具特异性，但在hsa上的结合位点都是不明的，而且价格昂贵，不能提供鼠杂交瘤细胞株。在用于人血清白蛋白纯化的抗体层析填料的制备，特别是大规模生产，要求一是抗体与人血清白蛋白的结合部位必须清楚，具特异性。而是大规模制备抗体要具成本低、简便，可重现的稳定性。这导致只有经本发明完成的技术路线，获得一个确知抗体抗原结合部位的抗人血清白蛋白鼠单克隆抗体。
技术实现要素：
本发明是为了解决可规模化生产和制备一种抗人血清白蛋白的单克隆抗体，用于临床上检测样品中痕量人血清白蛋白的诊断试剂盒和制备可用于外源表达系统（酵母菌或植物）生产制备的重组人血清白蛋白的抗体亲和层析工具。
本发明是按照以下技术方案实现的。
发明人利用计算机分析软件，比较猴、鼠、兔、羊血清白蛋白与人血清白蛋白氨基酸序列的差异性，寻找在人血清白蛋白氨基酸序列中具特异性的抗原决定簇氨基酸序列短肽。人工合成这些短肽，分别将短肽用于免疫小鼠，通过腹水杂交瘤技术筛选出仅能产生与人血清白蛋白（hsa）发生抗原抗体反应的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，该杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，可与抗原hsa具有超高灵敏度和超强的免疫结合特异的能力。
本发明中，通过小鼠免疫后，一种制备分泌特异强抗人血清白蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征如下所述。
1、经计算机选择出可能是抗原决定簇的人血清白蛋白氨基酸序列这，在筛选后，通过人工合成的多肽（短肽）氨基酸序列，分别是：
seqidno.fr1026:enfkalvliafaqylq(16aa)
seqidno.fr1027:llrlaktyettlekccaaad(20aa)
seqidno.fr1028:cfaeegkklvaasqaalgl(19aa)
每个短肽分别各合成10mg，其中10mg中的5mg短肽经化学偶联klh。
2、将200μg偶联klh的短肽 弗氏完全佐剂等体积混合并充分乳化，对小鼠实施基础免疫，方法是腹腔注射balb/c小鼠，每次注射体积为0.2ml，每个短肽同时免疫5只小鼠。免疫抗原偶联klh的短肽与弗氏不完全佐剂等体积混合并充分乳化，做二次免疫为每隔2周腹腔注射1次，每次注射体积为0.2ml，偶联klh的短肽用量为100μg/只。将免疫原偶联klh的短肽与浓度为0.9%的生理盐水混合，在进行细胞融合前3天，对小鼠进行加强免疫，腹腔注射，偶联klh的短肽用量为100μg/只。
3、二免后可适时经小鼠眼底采血，离心取血清后测小鼠免疫效果。具免疫反应的小鼠按常规技术收集免疫小鼠的脾细胞与ns-1骨髓瘤细胞按6:1的比例，用聚乙二醇制剂（peg）进行融合；用hat培养液选择培养。融合后7-14天，取细胞培养上清，采用间接elisa方法筛选分泌抗hsa的杂交瘤细胞株，对所得阳性克隆株采用有限稀释法进行亚克隆。
4、重复进行数次亚克隆配合间接elisa法进行筛选，就每一个人工合成hsa抗原决定簇短肽，都可获得至少一株分泌抗hsa的具特异性和高灵敏度单克隆抗体杂交瘤细胞株。
5、短肽seqidno.jn-1028获得的杂交瘤细胞的一个克隆细胞株（fr1028），其可分泌一种特异和高灵敏度抗人血清白蛋白单克隆抗体(mab1028)，作为更优抗hsa单克隆抗体开展了进一步的应用。
本发明中，一种杂交瘤细胞株可产生强抗人血清白蛋白的单克隆抗体，其特征在于是通过如下方法获得的。
1、通过细胞培养液获得：将杂交瘤细胞株fr1028按1×106接种量接种到6ml含20%胎牛血清的rpmi-1640培养基中，在37oc含5%co2的细胞培养箱中培养3-5天，然后将细胞培养液在5000×g离心5分钟，收集上清液，单克隆抗体可通过proteina或proteing填料的亲和层析纯化获得。
2、通过动物腹水获得：将balb/c小鼠腹腔注射0.5ml石蜡油，7-14天后，每只小鼠腹腔注射步骤1所得的细胞1-2×106个，待小鼠腹部明显膨大后抽取腹水，在4oc下，6000×g离心10分钟，收集上清，单克隆抗体可通过proteina或proteing填料的亲和层析纯化获得。
本发明中，一种杂交瘤细胞株fr1028产生的单克隆抗体，其特征在于是通过如下方法进行鉴定抗体亚型的。
1、抗体纯度鉴定：将单抗用12%sds-page电泳进行纯度鉴定，如图1所示。经protein-a柱层析分离富集的抗体纯度可为≥95%。
2、抗体亚型鉴定：采用isostriptm小鼠单克隆抗体分型试剂盒（merck公司生产，cat.no.11493027001）鉴定抗体亚型，测定结果表明，抗体亚型为igg1κ型。
本发明中，一种杂交瘤细胞株fr1028的应用，其特征在于，将杂交瘤细胞株fr1028产生的单克隆抗体(mab1028)对hsa具有超高的灵敏度和超强的特异性。采用抗原血源phsa或毕赤酵母工程菌表达的rhsa直接包被96孔板（corning公司生产），直接elisa法测定杂交瘤细胞fr1028产生的单克隆抗体（mab1028）特异性的识别能力。具体叙述如下。
用不同浓度的hsa直接包被96孔elisa检测板，检测中设有空白对照、阴性对照和阳性对照。用3%脱脂奶粉（non-fatmilk）封闭检测板，依次加入mab1028抗体、生物素标记的羊抗鼠抗体（biotin-goatanti-mouseigg1）、链霉亲和素标记辣根过氧化物酶（avidin-hrp）。然后加入tmb显色液后，用硫酸终止反应，最后在酶标仪450nm比色。结果表明（图2），杂交瘤细胞fr1028产生的单克隆抗体（mab1028）对抗原hsa识别的灵敏度和特异性可以达到0.0012pg/ml（1.2fg/mlhsa）的水平，而与牛血清白蛋白（bsa）没有任何反应。可见mab1028识别hsa具有超高的灵敏度和超强的特异性。
杂交瘤细胞fr1028细胞产生的单克隆抗体（mab1028）对hsa特异性的识别能力和超高的灵敏度，具有多种应用，所述如下。
1、痕量人血清白蛋白的检测
以mab1028或市售人血清白蛋白单克隆抗体（sigma公司生产，cat#）平行分别包被96孔elisa检测板，用商品无蛋白封闭液封闭检测板，然后加入待检测的样品，如人尿液（含痕量人白蛋白）或是人血清白蛋白稀释液（1pg-0.1fg/ml，10倍稀释，作为人血清白蛋白浓度的标准曲线）。检测中设有pbs空白作为阴性对照，采用200ng/ml小牛血清白蛋白（bsa）作为特异性对照品。孵育后，洗涤3次，依次加入hrp-羊抗鼠抗体（biotin-goatanti-mouseigg1）和tmb显色液后，用1m硫酸终止反应，最后在酶标仪450nm比色。
结果表明，杂交瘤细胞fr1028产生的单克隆抗体（mab1028）可用于elisa试剂盒的检测，可以检测到稀释后的尿液中hsa低限含量为4.5fg/ml,人血清白蛋白低限痕量为0.6fg/ml。
1、制备可用于人血清白蛋白，特别是重组人血清白蛋白纯化的免疫亲和填料
用杂交瘤细胞株fr1028产生的单克隆抗体（mab1028，纯度为95%），与活化的ge生产的sepharose4bfastflow填料作为基质经化学偶联处理，制备成特异的人血清白蛋白-抗体亲和填料，装填到层析柱中，将含hsa的样品（发酵上清液或稀释后的人血清白蛋白配液）导入到层析柱上，弃除流穿液和清洗液，使用洗脱液将与单克隆抗体特异结合的人血清白蛋白自层析填料上洗脱下来，收集分离纯化人血清白蛋白的目的。
2、用于重组人血清白蛋白融合蛋白检测、鉴别
本发明人将mab1028抗人血清白蛋白单克隆抗体，用于测试不同分子结构和构象重组人血清白蛋白融合蛋白，获得发出有意义和意想不到的结果。mab1028是人血清白蛋白的c末端最后19个氨基酸序列。当治疗用细胞因子蛋白质（如粒细胞刺激因子g-cfs、干扰素ifn-α、生长激素）处于人血清白蛋白c末端时，不同的治疗用细胞因子蛋白质与人血清白蛋白形成的融合蛋白，对不同的融合蛋白有不同的免疫反应强度（μg到fg）。表明治疗用蛋白质融合到人血清白蛋白c末端是还是会干扰到mab1028与人血清白蛋白c末端氨基酸序列（抗原决定簇）结合的能力，也表明重组人血清白蛋白融合蛋白即使是都融合到白蛋白c末端，到也会是有显著不同，需要每个融合蛋白都要经反复在细胞水平、动物试验水平和临床上分别独立考察。当治疗用细胞因子蛋白质与人血清白蛋白n端融合，则本发明的mab1028抗人血清白蛋白单克隆抗体的免疫反应差异则不显著，例如：重组人白介素-2/血清白蛋白融合蛋白（hil-2/sa）。
综合上述，本发明的优点在于，本发明所获得的一种杂交瘤细胞株fr1028能够特异性的分泌针对hsa的单克隆抗体，对hsa具有超高的灵敏度和超强的特异性。该特异性单克隆抗体较之现有市售抗人血清白蛋白单克隆抗体商品，在用于特微量白蛋白的检测、人尿白蛋白检测试剂盒制备、以及用于纯化重组人血清白蛋白等具广泛实际用途。
本发明的优点还在于，利用本发明所获得的细胞株所产生的单克隆抗体，具有多种用途，对实际生产和临床应用上具有非常好的价值。
附图说明
图1：从杂交瘤细胞株中产生的鼠特异性hsa单抗示例。mk表示分子量蛋白质标准；a、b、c则分别为mab1026、mab1027和mab1028鼠单抗体（加还原剂dtt，加热煮沸）；d、e、f则为鼠单抗体在不加还原剂dtt条件下，煮沸10分钟后上样。在还原状态下（a、b、c）鼠单抗体则可分成了两个片段（50kd和23kd）。非还原状态下鼠单抗体则呈现为分子量约150kd的条带。
图2：elisa检测杂交瘤细胞fr1028产生的单克隆抗体对抗原重组人血清白蛋白和短肽seqidno.1028的灵敏度和特异性实验。图中横坐标表示不同的浓度的重组人血清白蛋白和不同浓度的短肽1028作为抗原，纵坐标则为od450读数。
具体实施方式
实施例1计算机软件分析确认抗原决定簇和人工合成抗原决定簇多肽
将人、牛、猴、鼠、羊和兔血清白蛋白氨基酸序列开展分子结构分析，确认出可能的抗原决定簇氨基酸多肽序列。将这些多肽（短肽）人工选择，外委做多肽的合成。
人工合成计算机选择出来的人血清白蛋白可能是抗原决定簇的氨基酸序列多肽-短肽，再经确认选择合成下列氨基酸序列多肽开展抗人血清白蛋白单克隆抗体制备研究。人工合成的多肽氨基酸序列分别是：
seqidno.fr-1011：vrpevdvmctafhdneet(18aa，140-157aa)
seqidno.fr-1012：llrlaktyettlekccaaad(20aa，370-389aa)
seqidno.fr-1013：akvfdefkplve(12aa，395-406aa)
seqidno.fr-1014：skcckhpeakrm(12aa，459-470aa)
seqidno.fr-1015：vpkefnaetftf(12aa，522-533aa)
seqidno.fr-1026：enfkalvliafaqylq(16aa，41-61aa)
seqidno.fr-1027：llrlaktyettlekccaaad(20aa，370-389aa)
seqidno.fr-1028：cfaeegkklvaasqaalgl(19aa，591-609aa)
判断可能是人血清白蛋白决定簇的多肽，其长度约在12-20个氨基酸长。发明人选择其中三个多肽seqidno.fr-1026、seqidno.fr-1027和seqidno.fr-1028人工合成，每个短肽分别各合成10mg，其中10mg中的5mg短肽要经化学法偶联klh，直接用于与佐剂一起免疫小鼠。
实施例2小鼠免疫及杂交瘤细胞株的建立
将200μg偶联klh的短肽 弗氏完全佐剂等体积混合并充分乳化，对balb/c小鼠实施基础免疫，方法是腹腔注射balb/c小鼠，每次注射体积为0.2ml，每个短肽同时免疫5只小鼠。加强免疫是将免疫抗原100μg偶联klh的短肽 弗氏不完全佐剂等体积混合并充分乳化，每隔2周腹腔注射1次，每次注射体积为0.2ml。在进行细胞融合前3天，将免疫100μg偶联klh的短肽与浓度为0.89%的生理盐水混合，对小鼠进行加强免疫，腹腔注射。次二免开始，每次取小鼠眼底血进行免疫反应测定，决定是否继续免疫，一般重复免疫最多4次。
实施例3小鼠杂交瘤细胞的制备
ns-1骨髓瘤细胞的准备：选择生长状态良好的ns-1细胞，培养液洗涤一次后，用10ml培养液将ns-1骨髓瘤细胞轻轻吹下。
小鼠脾细胞的准备：取最后1次加强免疫3天后的小鼠，摘除眼球采血供分离阳性血清。采用颈脱位法致死小鼠，以无菌法打开小鼠腹腔取出脾脏，用dmem培养液洗涤，并仔细去掉脾上附着结缔组织。随后将脾脏转移到另一个盛有dmem培养液的平皿中。用镊子挤压，充分释放小鼠脾细胞，制成脾细胞悬浮液。
细胞融合：将上述制备的ns-1骨髓瘤细胞与脾细胞混合经800×g离心5分钟，弃上清。轻轻振荡细胞管底部，使两种细胞充分混匀。用吸管将预热的peg在1分钟内缓慢加到融合管中，同时轻摇混匀，。然后加人37oc预热dmem，补加5ml的hat培养基，轻轻悬浮沉淀细胞，再加入适量新鲜制备的含巨噬细胞的小鼠腹水，最后补加hat培养基至50ml。分装于96孔细胞培养板，每孔100-200μl，然后将96孔细胞培养板置37oc，5%co2细胞培养箱内培养。5天后用hat培养基换出一半培养基。每天观察杂交瘤细胞的生长情况，待其细胞培养上清变黄或克隆分布至孔底面积的1/10以上时，吸取适量细胞上清，采用间接elisa法筛选分泌抗人血清白蛋白抗体的杂交瘤细胞株，对所得阳性克隆株采用有限稀释法进行亚克隆。
杂交瘤细胞株的筛选：经过3-6次亚克隆和间接elisa筛选，筛选到数个细胞株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。对所获得稳定分泌单克隆抗体的免疫杂交瘤细胞株分别命名和制种保藏，供进一步分析测定用。
实施例4小鼠杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体之效价测定方法
以小鼠杂交瘤细胞株fr1028为例，将细胞株培养在含10-20%胎牛血清的rpmi-1640培养基中培养传代，每3天传代一次，每次传代均留样进行单克隆抗体测定。
实施例5细胞培养液上清效价测定
将传代的细胞按1×106细胞个数接种量，接种到6ml含20%胎牛血清的rpmi-1640培养基中，在37oc含5%co2细胞培养箱中培养3-5天，然后将细胞培养液在800×g离心5分钟，收集上清，用间接elisa法测定细胞上清液中单克隆抗体效价。
实施例6小鼠腹水效价测定
将balb/c小鼠腹腔注射0.5ml石蜡油，7-14天后，每只小鼠腹腔注射实施例3所得的细胞1×106，待小鼠腹部明显膨大后抽取腹水，在4oc下，8000×g离心10分钟，收集上清液。用间接elisa法测定上清中单克隆抗体，效价为1:1×105-1:5×105。
实施例7杂交瘤细胞株的传代培养
将细胞株fr1028在含有20%胎牛血清的rpmi-1640培养基中培养传代，每3天传代一次，传代到30代后，杂交瘤细胞株fr1028仍然能生长良好、稳定传代，培养液上清效价仍然可以达到1:50,000-1:100,000的水平。可见，本发明所得的细胞株fr1028能够稳定传代，可以持续、稳定产生抗人血清白蛋白的单克隆抗体。
实施例8应用细胞株fr1028制备抗人血清白蛋白的单克隆抗体
单克隆抗体的制备:将balb/c小鼠腹腔注射0.5ml石蜡油，7-14天后，每只小鼠腹腔注射1-2×106个杂交瘤细胞fr1028细胞，待小鼠腹部明显膨大后抽取腹水，在4oc下，8000×g离心10分钟，收集上清。然后，用proteina-sepharose4fastflow填料（gehealthcare公司生产）纯化腹水上清。弃掉流穿液和洗杂液，然后用甘氨酸-hcl，ph3.0洗脱液洗脱。收集洗脱液，用tris-hcl，1m，ph9.0缓冲液中和至ph6.5，最后得到抗人血清白蛋白单克隆抗体（mab1028）。
实施例9单克隆抗体mab1028的鉴定
抗体纯度鉴定：可用12.5%分离胶的sds-page电泳鉴定鼠单抗的纯度。电泳图如图1所示，从杂交瘤细胞株中产生的鼠特异性hsa单抗的示例。mk表示分子量蛋白质标准；a、b、c则分别为mab1026、mab1027和mab1028鼠单抗体（加还原剂dtt，加热煮沸）；d、e、f则为鼠单抗体在不加还原剂dtt条件下，煮沸10分钟后上样。在还原状态下（a、b、c）鼠单抗体则可分成了两个片段（50kd和23kd）。非还原状态下鼠单抗体则呈现为分子量约150kd的条带。
鼠单抗mab1028经proteina填料纯化后的纯度可达≥95%。
抗体亚型鉴定：采用小鼠抗体分型试剂盒（sigma公司生产）鉴定抗体亚型，具体操作参照厂家提供的说明书进行。测定结果表明，抗体亚型为igg1κ型。
抗体与抗原的灵敏度鉴定：采用不同浓度的重组人血清白蛋白或多肽seqidno.fr1028来包被96孔板（corning公司生产），以elisa直接法测定单克隆抗体mab1028检测灵敏度和灵敏能力。检测结果见表1:
其免疫灵敏度检测曲线图则见图2：elisa检测杂交瘤细胞fr1028产生的单克隆抗体对抗原重组人血清白蛋白和短肽seqidno.1028的灵敏度和特异性实验。图中横坐标表示不同的浓度的重组人血清白蛋白和不同浓度的短肽1028作为抗原，纵坐标则为od450读数。
选用表1的最后3个稀释度，再继续以3倍稀释法，连续稀释4个稀释度，分别达到11.29fg/ml、3.76fg/ml、1.25fg/ml。而pbs和牛、兔、猴、鼠血清则无免疫反应，表2的测定结果表明mab1028单克隆抗体的特异性也符合要求。
抗原与抗体的特异性鉴定：mab1028与牛血清、兔血清、猴血清和鼠血清都显著的免疫反应。由此可见，mab1028仅与人血清白蛋白有特异免疫反应，可识别人血清白蛋白，并具超高的灵敏度和超强的特异性。
实施例10mab1028单克隆抗体对各种重组人血清白蛋白融合蛋白的检测
重组人血清白蛋白融合蛋白（表2）可以是将治疗用细胞因子蛋白直接基因融合，分子结构可以是治疗用蛋白成熟肽与人血清白蛋白成熟肽的n端或c末端直接融合，之间不设有连接肽。然后根据治疗用蛋白是非糖基化（使用酵母菌）还是糖基化蛋白（需用cho细胞），来选用酵母菌或是cho细胞表达的生产制备。理论上治疗用蛋白与人血清白蛋白c末端直接连接时，可能会影响到mab1028单克隆抗体识别的表面抗原结合域（抗原决定簇）的。因为mab1028是使用人血清白蛋白c末端的最后19个氨基酸序列来制备的单克隆抗体。
方法是，梯度包被不同分子结构的重组人血清白蛋白融合蛋白（100μl/孔），pbs4稀释，4度过夜。倒掉包被液，洗板3次，加封闭液，1%bsa，200μl/孔，37度，2h。倒掉，拍干，加入50000倍稀释的mab1028鼠单抗，100μl/孔，37度，1h。倒掉孵育液，pbst300μl/孔，洗板5次，拍干。加入hrp标记的goatanti-mouse二抗，pbst稀释1:5000倍，100μl/孔，37度，1h孵育。倒掉，pbst300μl/孔，洗板5次，拍干。然后加入tmb100μl/孔，37度，10min左右，加入1m硫酸终止反应，450nm测od值。分析实验结果见表3。
结果显示不同的治疗用细胞因子在与人血清白蛋白c末端直接连接形成的融合蛋白，还是因治疗用蛋白不同的缘故，而显示出具有一定的灵敏度差异；治疗用细胞因子蛋白与人血清白蛋白n端直接连接，则理论上没有显著影响仅识别人血清白蛋白c末端的本发明单克隆抗体结合能力（代码：9555是人白介素-2变异体融合蛋白在人血清白蛋白成熟肽的n端，rhil-2/sa）。同时酵母菌表达的不同融合蛋白灵敏度可有近1倍或以上的免疫反应差异。在使用不同表达生产体系，毕赤酵母菌或cho细胞之间，似乎没有显示出有特别的差异。这是因为1882(rhsa/epo)是由cho细胞表达，epo处于人血清白蛋白c末端，且是直接连接，其与酵母工程菌表达的9075(rhsa/gh)相同，gh处于人血清白蛋白c末端，且是直接连接，二者在相同抗体上的免疫反应灵敏度上倒是没有显著差异。
同时试验考察到融合蛋白与人血清白蛋白单体相比，融合蛋白还是有更显著的空间位阻效应。即1个融合蛋白当与单克隆抗体包被的elisa板免疫亲和反应时，如果融合蛋白与1个抗体结合，更大的融合蛋白，占据更多该抗体周围的抗体空间，使之不能再与抗原结合，结果就显示出检测灵敏度大大下降的现象。这不少于免疫反应灵敏度和特异性的问题，而是产生空间位阻的缘故。
实施例10细胞株fr1028产生的单克隆抗体用于制备人血清白蛋白检测试剂盒
基于本发明所述的免疫杂交瘤细胞株fr1028生产的mab1028单克隆抗体,对抗原人血清白蛋白具有超高灵敏度和超强的特异性，可以应用于检测痕量或样品中残留的痕量人血清白蛋白。具体方法叙述如下。采用elisa抗体夹心法，一抗为mab1028,二抗为商业化的美国sigma公司cat＃a6684抗人血清白蛋白单克隆抗体或兔抗人血清白蛋白多抗。使用辣根过氧化物酶标记的hpr-羊抗鼠或兔单克隆抗体作为增强显色剂。封闭液则使用无蛋白封闭液（上海）。加入待检测的样品，志愿者尿液经0.9%生理盐水稀释，上样量为100μl。同时，用不同浓度的人血清白蛋白做蛋白质标准曲线，分别是1ng/ml，100pg/ml，10pg/ml，1pg/ml，100fg/ml，10fg/ml，1fg/ml、0.1fg/ml和0.01fg/ml。检测中空白对照：用pbs代替hsa；阴性对照：用小牛血清白蛋白（bsa），浓度为50mg/ml；加入100μl单组分tmb显色，用1n硫酸终止反应，最后在酶标仪450nm比色。实验设复孔，每个样品有2个复孔。以od450读数为检测结果确定。结果表明志愿者尿液中的痕量白蛋白含量为1-10fg/ml。
实施例11细胞株fr1028产生的单克隆抗体用于免疫亲和层析
用于人血清白蛋白分离纯化的亲和抗体柱层析制备用填料为nhs-acticvaledsepharose4fastflow购自于gehealthcare公司，cat#17090601、17090602或17090604。nhs(n-羟基琥珀酰亚胺)偶联与含有伯胺基的配体可形成化学稳定的酰胺键。按制造商使用说明书所提供的方法进行，将mab1028抗体偶联到活化的琼脂糖凝胶填料上。用封闭液封闭未发生偶联的活化基团，再经冲洗缓冲液处理，即可成为用于人血清白蛋白亲和层析纯化目的的填料。结果表明mg抗体与每升l活化琼脂糖凝胶填料的结合量约在20-30mg/l，符合制造商的技术指标。
实施例12制备的mab1028免疫亲和层析柱用于纯化人血清白蛋白
单克隆抗体偶联好的免疫亲和层析填料装填人层析柱中，经平衡缓冲液（20mmna2hpo4和nah2po4,ph7.2）平衡后，导入经capto-mmc分离富集的重组人血清白蛋白粗纯中间品。毕赤酵母菌宿主蛋白/hcp残留量检测方法可参见发明人的发明专利申请公开号：cn109851674a。对流穿液按阶段留样用于分析人血清白蛋白的载量。上样后再经平衡液平衡；使用20mmna2hpo4和nah2po4,2mnacl,ph7.2可作为洗脱液。结果表明白蛋白的亲和载量约可在40-50mghsa/ml。
结果显示，经capto-mmc先分离和富集的毕赤酵母菌表达生产的rhsa，上样前的纯度约为75%，宿主蛋白残留量约在50ng/mg，通过mab1028免疫亲和层析柱纯化后的rhsahplc纯度为99%，宿主蛋白(hcp)残留量则为未检出。
由此可见，小鼠免疫获得的杂交瘤细胞fr1028产生的单克隆抗体（mab1028）可用于制备的免疫亲和填料，显著特征在于，当用于分离富集人血清白蛋白或培养液中的重组人血清白蛋白，较之发明人在先发明《一种重组人血清白蛋白及其融合蛋白的分离纯化工艺》，专利号：zl200810089645.1，可收获具更高纯度和更好得率的重组人血清白蛋白。发明人确认该鼠单克隆抗体具极高的商业化和产业化应用前景。
序列表
<120>抗人血清白蛋白单克隆抗体
<141>2020-11-09
<160>8
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>16
<212>prt
<213>seqidno.fr1026
<400>1
gluasnphelysalaleuvalleuilealaphealaglntyrleugln
151015
<210>2
<211>20
<212>prt
<213>seqidno.fr1027
<400>2
leuleuargleualalysthrtyrgluthrthrleuglulyscyscys
151015
alaalaalaasp
20
<210>3
<211>19
<212>prt
<213>seqidno.fr1028
<400>3
cysphealaglugluglylyslysleuvalalaalaserglnalaala
151015
leuglyleu
<210>4
<211>18
<212>prt
<213>seqidno.fr1011
<400>4
valargprogluvalaspvalmetcysthralaphehisaspasnglu
151015
gluthr
<210>5
<211>20
<212>prt
<213>seqidno.fr1012
<400>5
leuleuargleualalysthrtyrgluthrthrleuglulyscyscys
151015
alaalaalaasp
20
<210>6
<211>12
<212>prt
<213>seqidno.fr1013
<400>6
alalysvalpheaspgluphelysproleuvalglu
1510
<210>7
<211>12
<212>prt
<213>seqidno.fr1014
<400>7
serlyscyscyslyshisproglualalysargmet
1510
<210>8
<211>12
<212>prt
<213>seqidno.fr1015
<400>8
valprolysglupheasnalagluthrphethrphe
1510
序列表
<110>中美福源生物技术（北京）股份有限公司
天津溥瀛生物技术有限公司
北京美福源生物医药科技有限公司
天津林达生物科技有限公司
<120>抗人血清白蛋白单克隆抗体
<141>2020-11-09
<160>8
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>16
<212>prt
<213>seqidno.fr1026
<400>1
gluasnphelysalaleuvalleuilealaphealaglntyrleugln
151015
<210>2
<211>20
<212>prt
<213>seqidno.fr1027
<400>2
leuleuargleualalysthrtyrgluthrthrleuglulyscyscys
151015
alaalaalaasp
20
<210>3
<211>19
<212>prt
<213>seqidno.fr1028
<400>3
cysphealaglugluglylyslysleuvalalaalaserglnalaala
151015
leuglyleu
<210>4
<211>18
<212>prt
<213>seqidno.fr1011
<400>4
valargprogluvalaspvalmetcysthralaphehisaspasnglu
151015
gluthr
<210>5
<211>20
<212>prt
<213>seqidno.fr1012
<400>5
leuleuargleualalysthrtyrgluthrthrleuglulyscyscys
151015
alaalaalaasp
20
<210>6
<211>12
<212>prt
<213>seqidno.fr1013
<400>6
alalysvalpheaspgluphelysproleuvalglu
1510
<210>7
<211>12
<212>prt
<213>seqidno.fr1014
<400>7
serlyscyscyslyshisproglualalysargmet
1510
<210>8
<211>12
<212>prt
<213>seqidno.fr1015
<400>8
valprolysglupheasnalagluthrphethrphe
1510
1.经计算机分析人血清白蛋白氨基酸序列及空间构象，选择出可能具特异性表面抗原决定簇的氨基酸序列区域，经选择的氨基酸序列短肽人工合成，用于免疫小鼠，制备鼠免疫杂交瘤细胞，其可分泌抗人血清白蛋白的单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述单克隆抗体，来自于人血清白蛋白表面抗原决定簇，选择抗原决定簇的氨基酸序列有seqidno.fr1026、seqidno.fr1027,以及seqidno.fr1028。
3.根据权利要求1所述人工合成短肽，免疫小鼠后，经构建抗体表达鼠杂交瘤细胞株，产生抗人血清白蛋白的单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆抗体可与人血清白蛋白产生抗原抗特异反应，抗体为igg1亚型抗体。
4.根据权利要求1所述的鼠抗人血清白蛋白单克隆抗体，优选地是mab1026、mab1027和mab1028,更更优选的是mab1028。
5.根据权利要求1所述由鼠杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，可用于临床上对痕量人血清白蛋白检测中的应用。
6.根据权利要求1所述由鼠杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，其特征在于，可用于制备elisa检测试剂盒,该试剂盒可用于痕量人血清白蛋白的检测目的需求。
7.根据权利要求1所述由鼠杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，其特征在于，将鼠杂交瘤细胞株生产的单克隆抗体，可用于纯化血源人血清白蛋白或和外源表达体系生产的重组人血清白蛋白的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，将鼠杂交瘤细胞株生产的单克隆抗体用于制备可用于纯化重组人血清白蛋白的特异性免疫亲和层析填料。
9.根据权利要求1所述由鼠杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，其可在工业化生产中获得应用。
技术总结