本发明属于生物医药
技术领域：
，涉及抗cd123纳米抗体及其应用。
背景技术：
：30多年前，“3 7”方案(柔红霉素化疗3天联合阿糖胞苷化疗7天)使约60％的aml患者的病情得到缓解，成为治疗儿童和成人急性白血病的标准诱导方案。上世纪90年代，临床专家开始关注缓解后治疗方案及其获益，并进行了大量研究，其中包括高剂量阿糖胞苷化疗或造血干细胞移植(hsct)。虽然儿童急性白血病的缓解率和总生存率目前已分别达到大于90％和60％，但是现有的治疗方案仍然局限于基于蒽环类药物、核苷类似物和密集的缓解后治疗。为了提高aml患者的预后，临床采用包括米托蒽醌与去甲氧柔红霉素的替代治疗、阿糖胞苷强化治疗等方案，然而大多数临床研究显示各治疗组的结局不存在显著差异。干细胞移植治疗白血病的疗效表明，抗肿瘤免疫可以有效消除和防止白血病复发。事实上，许多研究发现，与化疗相比，造血干细胞移植的复发率明显降低。然而，由于造血干细胞移植的死亡率高，在缓解期进行造血干细胞移植存在争议。近年来，随着支持治疗的改进，全面的hla和nk分型有助于降低造血干细胞移植治疗的副作用。酪氨酸激酶抑制剂(tkis)已成为重要的化疗方案之一。例如，flt3基因(flt3itd)可引发约15％的儿童aml和30％的成人aml，且与不良结局相关，flt3-itd/野生型flt3比例较高的个体表现出更为显著的预后不良。索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼和其他flt3抑制剂可以有效抑制flt3突变，但是长期使用这些药物会出现耐药现象，这主要与d835或f691激酶区点突变有关。新型酪氨酸激酶抑制剂crenolanib，对索拉非尼(sorafenib)耐药的aml小鼠模型有较好的治疗作用，提示该抑制剂可以延长临床受益。虽然tkis提供了不同的白血病治疗方案，但是仍然处于发展阶段，临床需要更多的治疗策略。嵌合抗原受体修饰t淋巴细胞(chimericantigenreceptortcells，car-t)的概念早在1989年就已出现，但是在临床试验中一直未能达到理想的效果。此后的二十多年时间里，科学家们不断地对该技术进行优化，直到2011年，靶向cd19(blymphocyteantigencd19，cd19)的car-t细胞在治疗复发/难治性慢性b淋巴细胞白血病方面取得了惊人疗效，car-t细胞在肿瘤治疗上的应用开启了新的篇章。嵌合抗原受体是人工合成的功能类似于t细胞受体的融合蛋白，主要包括信号肽、抗原识别区、铰链区、跨膜区和胞内信号区。在结合靶抗原后，嵌合抗原受体形成聚体、通过胞内信号分子活化t细胞，分泌穿孔素和颗粒酶素b，实现对靶细胞的杀伤。car-t细胞识别靶细胞不依赖于主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex，mhc)，避免了因肿瘤细胞mhc分子下调而导致的免疫逃逸。近年来，嵌合抗原修饰的t淋巴细胞(car-t)发展迅速，目前已有两款产品获美国fda批准上市，国内也有多个产品取得药物临床试验批准。cd123也称cd3受体α链，表达于白血病细胞和白血病干细胞上，正常造血干细胞不表达或弱表达，在内皮细胞和单核细胞、浆细胞dc上也表达，但是cd123阳性的单核细胞和浆细胞在反应性淋巴结中只占很小的比例。高表达cd123促进了肿瘤细胞的增殖。cd123是目前研究较多的一种aml抗原，现已研发出几种靶向cd123的单克隆抗体类药物，如7g3、csl360和csl362正在进行临床前及临床试验。此外，靶向cd123的car-t治疗也已完成临床前研究并显示出显著的抗瘤效应。将抗cd123的嵌合抗原受体基因通过基因工程方法导入t细胞制备cd123car-t，使得cd123car-t细胞特异性识别表达cd123的急性髓系白血病细胞并清除肿瘤细胞，从而实现其抗肿瘤作用。因此，靶向cd123的免疫治疗方法具有较大的临床转化价值。技术实现要素：针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了抗cd123纳米抗体及其应用，利用噬菌体展示技术筛选到高亲和力的抗cd123纳米抗体，作为嵌合抗原受体分子的抗原结合结构域构建car-t细胞，所述car-t细胞能够特异性识别杀伤cd123阳性细胞，在肿瘤的治疗领域具有重要的应用前景。为达此目的，本发明采用以下技术方案：第一方面，本发明提供了抗cd123的纳米抗体，所述纳米抗体包括重链可变区；所述重链可变区包括seqidno:1所示的cdr1，seqidno:2所示的cdr2，和seqidno:3所示的cdr3；seqidno:1：gftfssyd；seqidno:2：ikpgpvgt；seqidno:3：argsryswnldgpl。本发明中，从cd123免疫骆驼vhh免疫文库中筛选具有高亲和性的抗体，发现当抗体重链可变区的cdr区为seqidno:1～3所示的氨基酸序列时，与不同的框架区fr组合可以获得特异性结合cd123、且亲和力强的抗体，因此，seqidno:1～3所示的cdr区对于抗体与cd123的亲和性具有决定性作用。优选地，所述纳米抗体的重链可变区包括seqidno:4或seqidno:5所示的氨基酸序列；seqidno:4：evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfssydmswvrqapgkglewvshikpgpvgtdytdsvkgrftisrdnakntlylqmdslktedtavyycargsryswnldgplrgqgtqvtvss；seqidno:5：evqlvesggdlvqpggslrlscaasgftfssydmswvrqapgkglewvshikpgpvgtdytdsvkgrftisrdnakntlylqmdslktedtavyycargsryswnldgplrgqgtqvtvss。本发明中，利用噬菌体展示技术对cd123免疫骆驼vhh文库进行筛选，得到了仅含有重链可变区的抗cd123纳米抗体cd123-9(seqidno:4)和cd123-12(seqidno:5)，两种纳米抗体具有相同的cdr区seqidno:1～3，对cd123亲和性高，在构建靶向cd123的嵌合抗原受体方面具有重要的应用前景。第二方面，本发明提供了核酸分子，所述核酸分子包括编码第一方面所述的纳米抗体的dna片段。优选地，所述核酸分子包括seqidno:6或seqidno:7所示的核酸序列，其中，seqidno:6为cd123-9的编码序列，seqidno:7为cd123-12的编码序列；seqidno:6：gaggtgcagctggtggagagcggaggaggcctggtgcagcctggcggcagcctgagactgtcttgtgccgcctctggctttacattttcttcttatgatatgagctgggtgagacaggctccaggaaaaggactggagtgggtgtctcatatcaaacctggaccagtgggcaccgattatacagatagcgtgaaaggcagattcacaatttctagagataatgccaaaaatacactgtatctgcagatggacagcctgaagaccgaggacaccgccgtgtactactgcgccagaggcagcagatacagctggaacctggacggccccctgagaggccagggcacccaggtgaccgtgagcagc；seqidno:7：gaggtgcagctggtggagtctggcggcgatctggtgcagcctggcggatctctgagactgtcttgcgctgcctccggattcacattttctagctatgatatgtcttgggtgagacaggccccaggaaagggactggaatgggtgtctcacatcaagcctggacctgtgggaacagattatacagatagcgtgaaaggaaggtttacaatttctagagataatgccaaaaatacactgtatctgcagatggattctctgaaaacagaggataccgccgtgtattattgtgccagaggatctagatattcttggaatctggatggacctctgagaggccagggcacacaggtgaccgtgagctct。第三方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括信号肽、抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域和信号转导结构域；所述抗原结合结构域为第一方面所述的纳米抗体。本发明中，以第一方面所述的纳米抗体作为嵌合抗原受体的胞外区，靶向结合cd123，构建的嵌合抗原受体、表达嵌合抗原受体的免疫细胞对cd123阳性细胞具有高效靶向作用，在cd123阳性肿瘤治疗领域具有重要意义。优选地，所述信号肽包括cd8α信号肽。优选地，所述铰链区包括cd8α铰链区。优选地，所述跨膜结构域包括cd8α跨膜区、cd28跨膜区或dap10跨膜区中的任意一种或至少两种的组合，cd8α跨膜区的序列可参照nm_001145873，cd28跨膜区的序列可参照nm_006139，dap10跨膜区的序列可参照nm_014266。优选地，所述信号转导结构域包括cd3ζ，序列可参照nm_198053。优选地，所述信号转导结构域还包括4-1bb、cd28胞内区、ox40、icos或dap10胞内区中的任意一种或至少两种的组合，4-1bb的序列可参照nm_001561，cd28胞内区的序列可参照nm_006139，ox40的序列可参照nm_003327，icos的序列可参照nm_012092，dap10的序列可参照nm_014266。在本发明一具体实施方式中，所述信号转导结构域自n端至c端依次包括4-1bb和cd3ζ。优选地，所述嵌合抗原受体自n端至c端依次包括第一方面所述的纳米抗体、cd8α跨膜区、4-1bb和cd3ζ。优选地，所述嵌合抗原受体自n端至c端依次包括第一方面所述的纳米抗体、cd28跨膜区、cd28胞内区和cd3ζ。优选地，所述嵌合抗原受体自n端至c端依次包括第一方面所述的纳米抗体、cd8α跨膜区、ox40和cd3ζ。优选地，所述嵌合抗原受体自n端至c端依次包括第一方面所述的纳米抗体、cd8α跨膜区、icos和cd3ζ。优选地，所述嵌合抗原受体自n端至c端依次包括第一方面所述的纳米抗体、cd28跨膜区、cd28胞内区、ox40和cd3ζ。优选地，所述嵌合抗原受体包括seqidno:8或seqidno:9所示的氨基酸序列；seqidno:8(cd8α信号肽-cd123-9-cd8αhinge-tm-41bb-cd3ζ)：malpvtalllplalllhaarpevqlvesggglvqpggslrlscaasgftfssydmswvrqapgkglewvshikpgpvgtdytdsvkgrftisrdnakntlylqmdslktedtavyycargsryswnldgplrgqgtqvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr；seqidno:9(cd8α信号肽-cd123-12-cd8αhinge-tm-41bb-cd3ζ)：malpvtalllplalllhaarpevqlvesggdlvqpggslrlscaasgftfssydmswvrqapgkglewvshikpgpvgtdytdsvkgrftisrdnakntlylqmdslktedtavyycargsryswnldgplrgqgtqvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr。第四方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包括第三方面所述的嵌合抗原受体的编码基因。优选地，所述表达载体为含有第三方面所述的嵌合抗原受体的编码基因的慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体中的任意一种，优选为慢病毒载体。本发明中，构建含有第三方面所述的嵌合抗原受体的编码基因的病毒载体、尤其是慢病毒载体，并利用基因工程方法构建抗cd123car-t细胞，实现了抗肿瘤效果。第五方面，本发明提供了一种重组慢病毒，所述重组慢病毒由转染有第四方面所述的表达载体和辅助质粒的哺乳细胞制备得到。第六方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体免疫细胞，所述嵌合抗原受体免疫细胞表达第三方面所述的嵌合抗原受体。优选地，所述嵌合抗原受体免疫细胞包括第四方面所述的表达载体和/或第五方面所述的重组慢病毒。优选地，所述免疫细胞包括t细胞、b细胞、nk细胞、肥大细胞或巨噬细胞中的任意一种或至少两种的组合。第七方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括第六方面所述的嵌合抗原受体免疫细胞。优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。第八方面，本发明提供了第一方面所述的纳米抗体、第二方面所述的核酸分子、第三方面所述的嵌合抗原受体、第四方面所述的表达载体、第五方面所述的重组慢病毒、第六方面所述的嵌合抗原受体免疫细胞或第七方面所述的药物组合物在制备恶性肿瘤治疗药物中的应用。优选地，所述恶性肿瘤包括血液肿瘤。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：(1)本发明利用瞬时转染方式将包含cd123蛋白胞外区基因片段的质粒导入到真核细胞中，表达重组cd123蛋白用于免疫双峰驼，构建噬菌体展示纳米抗体库，筛选到cd123-9、cd123-12可特异性结合cd123抗原的纳米抗体；(2)本发明进一步利用筛选的纳米抗体改造成为嵌合抗原受体，利用基因工程方法表达于免疫细胞中，由此构建的表达抗cd123嵌合抗原受体的免疫细胞对cd123阳性肿瘤细胞具有细胞毒性作用，与cd123阳性细胞共培养后高效分泌细胞因子il-2、tnf-α和ifn-γ，在治疗cd123阳性急性髓系白血病方面具有重要的应用前景。附图说明图1a为biacore检测cd123-9抗体的亲和力，图1b为biacore检测cd123-12抗体的亲和力；图2为facs检测cd123-9和cd123-12纳米抗体识别细胞表面的cd123抗原；图3为prrl.ef1α-cd123car-wpre慢病毒载体质粒图谱；图4为表达cd123的嵌合抗原受体结构示意图；图5为t淋巴细胞的嵌合抗原受体表达率；图6为cd123car-t细胞对cd123阳性肿瘤细胞的杀伤效果；图7为cd123car-t细胞分泌il-2的水平；图8为cd123car-t细胞分泌tnfα的水平；图9为cd123car-t细胞分泌ifnγ的水平。具体实施方式为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。实施例1噬菌体纳米抗体库的构建、淘选和elisa初步筛选(1)噬菌体纳米抗体库的构建本实施例首先采用cd123抗原胞外区免疫双峰驼，elisa验证效价后，抽取200ml外周血；从外周血中分选淋巴细胞，获得外周血单核淋巴细胞沉淀，进行rna提取；以提取的rna为模板，利用反转录酶合成第一链cdna，随后利用巢式pcr扩增vhh基因；将扩增的vhh基因插入pmecs噬菌体展示载体中，电转化tg1感受态细胞，取适量菌液进行文库鉴定，剩余所有培养物均匀涂布于lb/ampglu平板上；待菌长出后收集菌苔，加入1/3体积50％甘油，混匀分装，置于-80℃保存，即为库容大于109的噬菌体展示骆驼vhh免疫文库。(2)噬菌体纳米抗体库的淘选对免疫文库进行3轮固相筛选，富集得到具有结合活性的噬菌体克隆；对单克隆噬菌体进行原核诱导表达后，利用elisa进一步筛选可以结合cd123抗原胞外区的噬菌体克隆；将纯化的cd123重组蛋白用pbs缓冲液稀释至4μg/ml，取96孔酶标板，选择3复孔，每孔加入100μl(400ng/孔)cd123重组蛋白稀释液，4℃包被过夜，并设置pbs阴性对照组；弃去包被液，每孔加入150μl2％脱脂奶粉，室温封闭1h，制备包被cd123重组蛋白的酶标板；将酶标板用pbst洗涤4次后，取制备好的噬菌体溶液用2％脱脂奶粉稀释至5×1011pfu/ml，随后以100μl/孔的量加入到酶标板中，室温孵育2h；弃去噬菌体样品，用pbst洗涤10次，再用pbs洗涤5次，每孔加入100μl新鲜配制的0.1m三乙胺，室温静置10min；吸出洗脱液迅速用等体积1mtris-hcl(ph＝7.4)中和；取部分洗脱液测定噬菌体滴度；另取400μl洗脱液侵染4ml对数期tg1菌液(od600约0.6)，37℃孵育30min；随后加入16ml2×yt/氨苄青霉素/葡萄糖(2×yt/amp-glu)，37℃、200r/min继续培养至od600达到0.6～0.8；取100μl细菌悬液进行梯度稀释后均匀涂抹于2×yt/氨苄青霉素/葡萄糖琼脂平板上，进行文库库容和多样性测定；取100μl细菌悬液接种于2×yt/amp-glu培养基中，培养至对数期，加入辅助噬菌体，实施文库救援，获得噬菌体颗粒进行噬菌体滴度检测，随后浓缩纯化得到噬菌体粒子用于下一轮筛选；筛选操作重复3次；剩余菌液经过离心后使用适当体积的2×yt培养液重悬，涂抹于带有筛选抗性的平板上进行过夜培养；使用适量的液体培养液从平板上刮取细菌，加入含1/3体积50％甘油的2×yt培养液重悬后分装，保存于-80℃中。(3)噬菌体包装将100μl步骤(2)淘选的菌液加入到100ml2×yt/ampgl培养液中，37℃、200rpm振荡培养至对数期(od600值为0.6～0.8)；加入90μl辅助噬菌体m13k07(1.7×1013pfu/ml)，37℃静置30min，2800g离心10min收集菌体，用200ml2×yt/amp-kan培养基重悬，37℃、200rpm振荡培养12h；4℃、3800g离心30min，收集上清，加入1/5体积预冷的peg/nacl混匀，沉淀噬菌体2h；4℃、3800g离心30min，收集噬菌体，用终体积为2mlpbs溶液重悬菌体，并转移至15ml离心管中；4℃、12000g离心15min，收集上清，加入1/5体积预冷的peg/nacl溶液，上下颠倒混匀，冰上静置2h；4℃、10000g离心10min，弃上清，用1mlpbs重悬噬菌体沉淀，4℃摇床孵育过夜，使噬菌体颗粒充分溶解，噬菌体溶液与等体积60％甘油混合后分装至1.5mlep管中，保存于-80℃中。(4)elisa初步筛选由于在步骤(2)中采用cd123抗原对噬菌体文库进行了3轮淘选，为了避免丢失序列多样性，对第2轮和第3轮的淘选产物进行elisa初步筛选，从淘选产物中随机挑选出阳性克隆并进行诱导表达，表达上清即为粗提vhh抗体，通过测序确定单克隆菌株的vhh抗体序列。实施例2facs筛选候选克隆本实施例按照标准细胞培养方案进行细胞培养：使用胰酶消化细胞，制备cd123阳性细胞或cd123阴性细胞悬液，300g离心5min去除培养液，采用flowbuffer重悬细胞至细胞浓度为2×106个/ml；向v形底96孔板中的每孔中加入2×105个细胞，300g离心5min去除上清，添加vhh抗体粗提物重悬细胞，4℃孵育1h；300g离心5min去除上清，采用flowbuffer重悬细胞，并加入100μlflowbuffer稀释的apcanti-his抗体(2μg/ml)，4℃孵育1h；flowbuffer清洗细胞3次后，使用200μlflowbuffer重悬细胞，进行流式检测。实施例3vhh-migg2afc纳米抗体的表达、纯化和亲和力测定为了进一步对筛选的抗体进行鉴定，本实施例构建表达vhh的载体c-4pcp.stuffer-mcg2a-fc(带有小鼠fc标签)，步骤如下：pcr扩增抗cd123重链可变区编码基因，其中，cd123-9(seqidno:6)的上游引物为hd-f、下游引物为hd-b12-r2，cd123-12(seqidno:7)的上游引物为hd-f、下游引物为hd-cd-12-r，序列如表2所示，pcr反应体系如表3所示，反应条件为95℃预变性1min，95℃变性10s、55℃退火10s、72℃延伸10s，30个循环，72℃延伸5min，4℃保存。表2表3对空载体在37℃条件下进行酶切处理6h，体系如表4所示，酶切后的载体用pcr纯化试剂盒进行纯化回收，溶解于45μl水中，进行dna浓度检测。表4试剂用量c-4pcp.stuffer-mcg2a-fc～5μg10×酶切缓冲液(10×reactionbuffer)5μlfspai2μlpfi23ii2μlddh2o补齐至50μl将pcr扩增产物采用同源重组的方式连接入酶切的线性化载体中，体系如表5所示，条件为37℃水浴30min。表5试剂体积(μl)exnaseii12×exnaseiibuffer2线性化载体(linearizedvector)4扩增产物(insertfragment)3将全部同源重组反应体系加入dh5α感受态细胞中，转化条件如表6所示。表6程序温度(℃)时间冰浴05min加热421min冰浴03min加入500μllb培养基，220rpm振荡培养371.5h吸取200μl，涂布于lb/amp平板37过夜(16～18h)从转化平板挑选单克隆进行pcr预鉴定，体系如表7所示，条件为95℃预变性3min，95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，35个循环，72℃延伸5min，4℃保存，将扩增产物送测序公司进行测序鉴定。发现测序结果符合预期，说明成功构建了带有小鼠fc标签的表达vhh的载体c-4pcp.stuffervhh-mcg2a-fc。表7试剂体积(μl)pef1a1psv4012×fasttaqmix15ddh2o补齐至30在质粒转染前约24h，传代培养293e细胞至细胞密度约为0.6×106个/ml；当细胞密度为(1.0～1.2)×106个/ml、活率>95％时，采用pei将0.15μgc-4pcp.stuffervhh-mcg2a-fc转染至100ml293e细胞中，质粒dna和pei的比例为1:2；转染质粒后的293e细胞在37℃、130rpm、8％co2摇床中培养5～7天，3000rpm离心30min收集上清，经millex-gpfilterunit0.45μm无菌过滤后，用mabselecttmsuretm离心浓缩，1×pbs洗涤柱体，0.1mgly-hcl洗脱蛋白，并用1/10体积、ph＝8.5的tris-hcl中和，得到抗体蛋白；将得到的抗体蛋白在4℃下透析过夜，用nanodrop2000定量检测抗体浓度，并用sec-hplc测定抗体纯度。将纯化的抗cd123vhh抗体cd123-9(seqidno:4)、cd123-12(seqidno:5)用biacore进行亲和力测定，biacore是基于表面等离子共振(surfaceplasmonresonance，spr)开发的生物分析传感技术，可检测跟踪溶液中的分子与芯片表面分子的结合、解离变化过程，以传感图的形式进行记录，并提供动力学和亲和力数据。测定过程中，将抗体固化到芯片表面，流动相为含有抗原的溶液。测定结果如表8、图1a和图1b所示。表8固定性流动相ka(1/ms)kd(1/s)kd(m)0.5μg/mlcd123-9humanil-3rα/cd123蛋白3.05e 051.42e-054.66e-110.5μg/mlcd123-12humanil-3rα/cd123蛋白2.95e 051.62e-055.51e-11实施例4流式检测抗cd123vhh纳米抗体将k562(cd123-)、kg-1α(cd123 )、thp-1(cd123 )肿瘤细胞与纯化的重组抗cd123-9/21抗体混合后，冰浴30min，随后加入apc标记羊抗鼠igg抗体，孵育30min，采用流式细胞仪检测。结果如图2所示，说明纳米抗体可识别细胞表面的cd123抗原。实施例5嵌合抗原受体的表达载体的设计与构建本实施例构建表达car分子的慢病毒载体，efs-anti-cd123vhhcar-wpre图谱如图3所示，car分子的示意图如图4所示，包括cd8α信号肽(seqidno:13)、anticd123vhh(seqidno:4/seqidno:5)、cd8α铰链区和跨膜区(seqidno:14)、4-1bb(seqidno:15)、cd3ζ(seqidno:16)，氨基酸序列如seqidno:8或seqidno:9；seqidno:13：malpvtalllplalllhaarp；seqidno:14：tttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyc；seqidno:15：krgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel；seqidno:16：rvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr。(1)pcr扩增anticd123vhh编码基因，引物见表9，体系见表10(试剂来源于toyoboinc.)，pcr程序见表11；表9表10试剂体积(μl)10×buffer52mmdntp525mmmgso4310μm上游引物110μm上游引物1模板dna(cdnaclone)1pcrgradewater33kod-plus-neo1表11(2)利用pcr在scfv片段前加cd8α信号肽，引物如表12所示，pcr反应体系如表13所示，按照表11的pcr程序进行pcr反应；反应结束后，pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收460bp左右的片段，紫外吸收法定量检测；表12表13(3)利用pcr扩增cd8α铰链区-跨膜区-41bb-cd3ζ(cd8αhinge-tm-41bb-cd3z)，引物如下：cd8αh-f(seqidno:22)：accacgacgccagcgccgcgac；vector-r(seqidno:23)：tcgataagcttgatatcg；pcr反应体系如表14所示(试剂来源于toyoboinc.)，按照表11的pcr程序进行pcr反应；反应结束后，pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收780bp左右的片段，紫外吸收法定量检测；表14(4)将5μghdcd19car质粒进行bamhi和ecori双酶切，37℃水浴2h，回收载体。将上述片段用重组酶37℃水浴连接0.5h，反应体系如表15所示，连接产物按照常规方法转化至大肠杆菌stbl3感受态细胞。从固体培养基上挑选单克隆过夜培养，进行pcr鉴定，体系如表16所示，程序如表17所示，pcr结束后挑选阳性克隆进一步测序鉴定，测序结果符合预期。表15试剂用量hdcd19car184.54ngcd8αsignalcd123vhh31.32ngcd8αhinge-tm-41bb-cd3z29.72ng5×cebuffer2μlexnasetmii1μlpcrgradewater补齐至10μl表16试剂体积(μl)taqpcrmastermix1010μmfseq-tref1a-f110μmrvector-r1模板dna菌液1pcrgradewater7表17实施例6慢病毒包装、浓缩和滴度检测(1)慢病毒包装将1.6×107个293t细胞接种于15cm培养皿中，培养基为含10％胎牛血清(fetalbovineserum，fbs)的dmem，37℃、5％co2过夜培养；将30μgprrl.ef1α-cd123car-wpre慢病毒载体、12.5μggag/pol辅助质粒和10μgvsvg包膜质粒加入2000μl无血清dmem培养液中，混匀；将157.5μgpei(1μg/μl)溶解于2000μl无血清dmem培养液中，轻轻混匀(或1000rpm涡旋5秒钟)，室温孵育5min；将pei混合液加入dna混合液中，随后立即涡旋混合或轻轻混匀，室温孵育20min；将4ml转染复合物滴加入293t细胞中，4～5h小时后更换新鲜培养基；48h后，收集病毒上清液。(2)慢病毒浓缩将病毒上清液用0.45μm滤膜过滤后收集于50ml离心管中，加入1/4体积peg-nacl病毒浓缩液，上下颠倒混匀，4℃过夜；4℃、3500rpm离心30min，去上清，加入适量的rpmi1640培养基(含10％fbs)，重悬病毒沉淀；浓缩后的慢病毒悬液分装成50μl每份，保存于-80℃环境中。(3)慢病毒滴度检测将500μlk562细胞(1×105个细胞)接种于24孔细胞培养板，分别加入1μl、0.2μl和0.04μl浓缩后的慢病毒，并添加polybrene至终浓度为5μg/ml，37℃、5％co2培养过夜，更换新鲜培养基；感染72h后，400g离心5min收集细胞，加入100μlpbs 2％fbs重悬细胞，并加入1μghcd123-ecd-fc抗体，冰上孵育30min；pbs 2％fbs清洗1次后，加入100μlpbs 2％fbs重悬细胞，并加入apcanti-humaniggfc抗体，冰上孵育30min；pbs 2％fbs清洗2次后，加入300μlpbs 2％fbs重悬细胞，采用流式细胞仪检测感染效率，取阳性率为5～20％的细胞样品为宜，按照以下公式计算慢病毒滴度。滴度(tu/ml)＝细胞数量(105)×阳性率/病毒体积(ml)实施例7慢病毒转导t淋巴细胞用pbs将抗人cd3抗体和抗人cd28抗体分别稀释至终浓度为1μg/ml和0.5μg/ml，包被孔板，4℃静置过夜；弃去孔板中的抗体包被液，用1mlpbs清洗两次；向人pbmc中加入x-vivo 10％fbs il-2(300u/ml)t细胞培养基，调整细胞密度为1×106/ml，随后接种到cd3和cd28抗体包被的孔板中，活化48h；收集活化的t细胞，调整细胞密度为1×106/ml，按照感染复数(multiplicityofinfection，moi)＝10加入慢病毒，添加polybrene至终浓度为5μg/ml，于37℃、5％co2环境中培养过夜后更换新鲜培养基，每2～3天进行传代；t细胞感染慢病毒5天后，取3×105个t细胞，4℃、400g离心5min，弃上清，pbs 2％fbs清洗一次；加入100μlpbs 2％fbs重悬细胞，并加入0.25μghumancd123protein抗体，冰上孵育30min，pbs 2％fbs清洗1次；加入100μlpbs 2％fbs重悬细胞，并加入apcanti-humaniggfc抗体，冰上孵育30min；pbs 2％fbs清洗2次后，加入300μlpbs 2％fbs重悬细胞。采用流式细胞仪检测慢病毒感染效率，结果如图5显示。实施例8car-t细胞的体外毒性实验将293t(cd123-)、293t-cd123(cd123 )、bxpc3-cd123(cd123 )调整细胞浓度为1×105/ml，作为靶细胞取100μl接种于96孔板中；按照效靶比为0.3:1、1:1和3:1向96孔板中加入cd123car-t细胞和对照t细胞；每组设置3个复孔。实验组和对照组如下：实验组：各靶细胞 car-t；对照组1：靶细胞最大释放ldh；对照组2：靶细胞自发释放ldh；对照组3：效应细胞自发释放ldh；效应细胞与靶细胞共培养18h后，采用cytotox96非放射性细胞毒性检测试剂盒(promega公司)检测效应细胞对靶细胞的杀伤作用。该方法基于比色法，通过检测乳酸脱氢酶(ldh)的含量反映细胞的裂解程度。ldh是一种稳定的胞质酶，细胞裂解后释放出来，释放方式与51cr在放射性分析中的释放方式基本相同，释放出的ldh可以通过偶联酶反应进行检测，在酶反应中ldh使一种四唑盐(int)转化为红色的甲臜(formazan)，生成的红色产物的量与裂解的细胞数成正比。具体参照cytotox96非放射性细胞毒性检测试剂盒说明书。根据以下细胞毒性计算公式计算效应细胞对靶细胞的杀伤能力：细胞毒性％＝(实验组-对照组2-对照组3)/(对照组1-对照组2)×100％结果如图6所示，cd123car-t细胞对cd123阳性的肿瘤细胞具有杀伤活性，而对cd123阴性细胞无杀伤作用。实施例9car-t细胞因子分泌取效靶比为1:1的细胞培养物400g离心10min，去除沉淀物，取100μl上清置于酶标板的样品孔中，随后加入50μl检测抗体稀释液(1:100稀释)，使用封板膜封板，室温300rpm/min振荡孵育2小时；弃掉液体，每孔加入300μl洗液洗板6次，每次洗板后将酶标板在吸水纸上拍干；每孔加入100μl辣根过氧化物酶标记链霉亲和素稀释液(1:100稀释)，使用新的封板膜封板，室温300rpm/min振荡孵育45min；弃掉液体，每孔加入300μl洗液洗板6次，每次洗板后将酶标板在吸水纸上拍干；每孔加入100μl显色底物tmb，避光室温孵育5～30min，随后每孔加入100μl终止液，颜色由蓝色变为黄色，使用酶标仪测定450nm最大吸收波长和570nm或630nm参考波长下的od值，校准后的od值为450nm的测定值减去570nm或630nm的测定值。il-2、tnf-α、ifn-γ因子分泌结果分别如图7、图8和图9所示，构建的car-t细胞与cd123阳性肿瘤细胞共孵育后释放细胞因子，而与cd123阴性细胞共孵育后无明显细胞因子分泌。综上所述，本发明利用噬菌体展示技术对cd123免疫的骆驼vhh免疫文库进行筛选，获得了高亲和力的抗cd123纳米抗体；以所述抗cd123纳米抗体作为抗原结合结构域构建嵌合抗原受体，将嵌合抗原受体基因通过基因工程方法导入免疫细胞，制备的cd123嵌合抗原受体免疫细胞能够特异性识别表达cd123的肿瘤细胞并将其杀死，实现了抗肿瘤作用。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属
技术领域：
的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。序列表<110>华道（上海）生物医药有限公司<120>抗cd123纳米抗体及其应用<130>20201210<160>23<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>8<212>prt<213>人工序列()<400>1glyphethrphesersertyrasp15<210>2<211>8<212>prt<213>人工序列()<400>2ilelysproglyprovalglythr15<210>3<211>14<212>prt<213>人工序列()<400>3alaargglyserargtyrsertrpasnleuaspglyproleu1510<210>4<211>121<212>prt<213>人工序列()<400>4gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysalaalaserglyphethrphesersertyr202530aspmetsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval354045serhisilelysproglyprovalglythrasptyrthraspserval505560lysglyargphethrileserargaspasnalalysasnthrleutyr65707580leuglnmetaspserleulysthrgluaspthralavaltyrtyrcys859095alaargglyserargtyrsertrpasnleuaspglyproleuarggly100105110glnglythrglnvalthrvalserser115120<210>5<211>121<212>prt<213>人工序列()<400>5gluvalglnleuvalgluserglyglyaspleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysalaalaserglyphethrphesersertyr202530aspmetsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval354045serhisilelysproglyprovalglythrasptyrthraspserval505560lysglyargphethrileserargaspasnalalysasnthrleutyr65707580leuglnmetaspserleulysthrgluaspthralavaltyrtyrcys859095alaargglyserargtyrsertrpasnleuaspglyproleuarggly100105110glnglythrglnvalthrvalserser115120<210>6<211>363<212>dna<213>人工序列()<400>6gaggtgcagctggtggagagcggaggaggcctggtgcagcctggcggcagcctgagactg60tcttgtgccgcctctggctttacattttcttcttatgatatgagctgggtgagacaggct120ccaggaaaaggactggagtgggtgtctcatatcaaacctggaccagtgggcaccgattat180acagatagcgtgaaaggcagattcacaatttctagagataatgccaaaaatacactgtat240ctgcagatggacagcctgaagaccgaggacaccgccgtgtactactgcgccagaggcagc300agatacagctggaacctggacggccccctgagaggccagggcacccaggtgaccgtgagc360agc363<210>7<211>363<212>dna<213>人工序列()<400>7gaggtgcagctggtggagtctggcggcgatctggtgcagcctggcggatctctgagactg60tcttgcgctgcctccggattcacattttctagctatgatatgtcttgggtgagacaggcc120ccaggaaagggactggaatgggtgtctcacatcaagcctggacctgtgggaacagattat180acagatagcgtgaaaggaaggtttacaatttctagagataatgccaaaaatacactgtat240ctgcagatggattctctgaaaacagaggataccgccgtgtattattgtgccagaggatct300agatattcttggaatctggatggacctctgagaggccagggcacacaggtgaccgtgagc360tct363<210>8<211>365<212>prt<213>人工序列()<400>8metalaleuprovalthralaleuleuleuproleualaleuleuleu151015hisalaalaargprogluvalglnleuvalgluserglyglyglyleu202530valglnproglyglyserleuargleusercysalaalaserglyphe354045thrphesersertyraspmetsertrpvalargglnalaproglylys505560glyleuglutrpvalserhisilelysproglyprovalglythrasp65707580tyrthraspservallysglyargphethrileserargaspasnala859095lysasnthrleutyrleuglnmetaspserleulysthrgluaspthr100105110alavaltyrtyrcysalaargglyserargtyrsertrpasnleuasp115120125glyproleuargglyglnglythrglnvalthrvalserserthrthr130135140thrproalaproargproprothrproalaprothrilealasergln145150155160proleuserleuargproglualacysargproalaalaglyglyala165170175valhisthrargglyleuaspphealacysaspiletyriletrpala180185190proleualaglythrcysglyvalleuleuleuserleuvalilethr195200205leutyrcyslysargglyarglyslysleuleutyrilephelysgln210215220prophemetargprovalglnthrthrglnglugluaspglycysser225230235240cysargpheproglugluglugluglyglycysgluleuargvallys245250255pheserargseralaaspalaproalatyrlysglnglyglnasngln260265270leutyrasngluleuasnleuglyargarggluglutyraspvalleu275280285asplysargargglyargaspproglumetglyglylysproargarg290295300lysasnproglngluglyleutyrasngluleuglnlysasplysmet305310315320alaglualatyrsergluileglymetlysglygluargargarggly325330335lysglyhisaspglyleutyrglnglyleuserthralathrlysasp340345350thrtyraspalaleuhismetglnalaleuproproarg355360365<210>9<211>365<212>prt<213>人工序列()<400>9metalaleuprovalthralaleuleuleuproleualaleuleuleu151015hisalaalaargprogluvalglnleuvalgluserglyglyaspleu202530valglnproglyglyserleuargleusercysalaalaserglyphe354045thrphesersertyraspmetsertrpvalargglnalaproglylys505560glyleuglutrpvalserhisilelysproglyprovalglythrasp65707580tyrthraspservallysglyargphethrileserargaspasnala859095lysasnthrleutyrleuglnmetaspserleulysthrgluaspthr100105110alavaltyrtyrcysalaargglyserargtyrsertrpasnleuasp115120125glyproleuargglyglnglythrglnvalthrvalserserthrthr130135140thrproalaproargproprothrproalaprothrilealasergln145150155160proleuserleuargproglualacysargproalaalaglyglyala165170175valhisthrargglyleuaspphealacysaspiletyriletrpala180185190proleualaglythrcysglyvalleuleuleuserleuvalilethr195200205leutyrcyslysargglyarglyslysleuleutyrilephelysgln210215220prophemetargprovalglnthrthrglnglugluaspglycysser225230235240cysargpheproglugluglugluglyglycysgluleuargvallys245250255pheserargseralaaspalaproalatyrlysglnglyglnasngln260265270leutyrasngluleuasnleuglyargarggluglutyraspvalleu275280285asplysargargglyargaspproglumetglyglylysproargarg290295300lysasnproglngluglyleutyrasngluleuglnlysasplysmet305310315320alaglualatyrsergluileglymetlysglygluargargarggly325330335lysglyhisaspglyleutyrglnglyleuserthralathrlysasp340345350thrtyraspalaleuhismetglnalaleuproproarg355360365<210>10<211>42<212>dna<213>人工序列()<400>10cgcgattcttaagggtgtccagtgcgaggtgcagctggtgga42<210>11<211>45<212>dna<213>人工序列()<400>11gcatggaggacagggcttgattgtggggctgctcacggtcacctg45<210>12<211>45<212>dna<213>人工序列()<400>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2 3
技术特征：1.抗cd123的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体包括重链可变区；
所述重链可变区包括seqidno:1所示的cdr1，seqidno:2所示的cdr2，和seqidno:3所示的cdr3。
2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的重链可变区包括seqidno:4或seqidno:5所示的氨基酸序列。
3.核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括编码权利要求1或2所述的纳米抗体的dna片段；
优选地，所述核酸分子包括seqidno:6或seqidno:7所示的核酸序列。
4.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括信号肽、抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域和信号转导结构域；
所述抗原结合结构域为权利要求1或2所述的纳米抗体。
5.根据权利要求4所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述信号肽包括cd8α信号肽；
优选地，所述铰链区包括cd8α铰链区；
优选地，所述跨膜结构域包括cd8α跨膜区、cd28跨膜区或dap10跨膜区中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述信号转导结构域包括cd3ζ；
优选地，所述信号转导结构域还包括4-1bb、cd28胞内区、ox40、icos或dap10胞内区中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述嵌合抗原受体包括权利要求1或2所述的纳米抗体、cd8α跨膜区、4-1bb和cd3ζ；
优选地，所述嵌合抗原受体包括权利要求1或2所述的纳米抗体、cd28跨膜区、cd28胞内区和cd3ζ；
优选地，所述嵌合抗原受体包括权利要求1或2所述的纳米抗体、cd8α跨膜区、ox40和cd3ζ；
优选地，所述嵌合抗原受体包括权利要求1或2所述的纳米抗体、cd8α跨膜区、icos和cd3ζ；
优选地，所述嵌合抗原受体包括权利要求1或2所述的纳米抗体、cd28跨膜区、cd28胞内区、ox40和cd3ζ；
优选地，所述嵌合抗原受体包括seqidno:8或seqidno:9所示的氨基酸序列。
6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括权利要求4或5所述的嵌合抗原受体的编码基因；
优选地，所述表达载体为含有权利要求4或5所述的嵌合抗原受体的编码基因的慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体中的任意一种，优选为慢病毒载体。
7.一种重组慢病毒，其特征在于，所述重组慢病毒由转染有权利要求6所述的表达载体和辅助质粒的哺乳细胞制备得到。
8.一种嵌合抗原受体免疫细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体免疫细胞表达权利要求4或5所述的嵌合抗原受体；
优选地，所述嵌合抗原受体免疫细胞包括权利要求6所述的表达载体和/或权利要求7所述的重组慢病毒；
优选地，所述免疫细胞包括t细胞、b细胞、nk细胞、肥大细胞或巨噬细胞中的任意一种或至少两种的组合。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求8所述的嵌合抗原受体免疫细胞；
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
10.权利要求1或2所述的纳米抗体、权利要求3所述的核酸分子、权利要求4或5所述的嵌合抗原受体、权利要求6所述的表达载体、权利要求7所述的重组慢病毒、权利要求8所述的嵌合抗原受体免疫细胞或权利要求9所述的药物组合物在制备恶性肿瘤治疗药物中的应用；
优选地，所述恶性肿瘤包括血液肿瘤。
技术总结本发明提供了抗CD123纳米抗体及其应用，所述纳米抗体包括重链可变区；所述重链可变区包括SEQ ID NO:1所示的CDR1，SEQ ID NO:2所示的CDR2，和SEQ ID NO:3所示的CDR3。本发明从骆驼VHH免疫文库中筛选的抗体具有SEQ ID NO:1～3所示的CDR区，与不同的框架区FR组合形成的纳米抗体与CD123亲和力强，由此构建的嵌合抗原受体、嵌合抗原受体免疫细胞对CD123阳性细胞具有显著的细胞毒性，在肿瘤治疗领域具有广泛的应用前景。
技术研发人员：狄升蒙;侯莉;石磊;刘芳;茅健;余学军
受保护的技术使用者：华道(上海)生物医药有限公司
技术研发日：2020.12.11
技术公布日：2021.03.12
