本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种抗tnfr2抗体及其用途，特别是在疾病（例如肿瘤）治疗中的用途。
背景技术：
tnfrsf1b（tnfreceptorsuperfamilymember1b）为tnf受体超家族成员,也称为tnfr2，主要表达在肿瘤微环境中的treg细胞和多种肿瘤细胞中（如卵巢癌和肠癌）。其配体tnf主要识别tnfr1进行凋亡，依赖tnfr2进行与t细胞存活相关的功能-通过nf-κb信号促进pro-survival基因的转录，从而促进细胞增殖和生存。许多实验表明阻断型抗体可以特异性杀伤肿瘤微环境中的treg细胞和肿瘤细胞，用于治疗多种肿瘤；而激活型抗体可以激活treg细胞，进而抑制teff细胞，从而治疗自身免疫疾病，为免疫治疗提供了新的靶点。
癌症是目前导致人类死亡率最高的疾病之一。因此，研发能够更高效靶向tnfr2信号通路的抗体药物，将为多种肿瘤和免疫系统相关疾病的治疗提供可能，具有巨大的应用潜力和市场价值。
技术实现要素：
本发明提供了一种特异性结合tnfr2蛋白的抗体或其抗原结合部分。
具体地，所述tnfr2蛋白为人或者其他灵长目动物tnfr2蛋白。
具体地，上述其他灵长目动物包括各种猴类，例如，但不限于，长尾猴、猕猴、狒狒、山魈等等；具体地，所述猕猴包括恒河猴、食蟹猕猴、蛮猴等等。
具体地，所述抗体或其抗原结合部分可特异性结合人tnfr2，并阻断人tnfr2与tnfa的相互作用。
具体地，所述抗体或其抗原结合部分包括重链可变区和轻链可变区。
具体地，所述重链可变区包含vhcdr1、vhcdr2和vhcdr3，其中：
所述vhcdr1-3的氨基酸序列分别如seqidno:5、seqidno:6和seqidno:7所示，或所述vhcdr1-3的氨基酸序列分别与seqidno:5、seqidno:6和seqidno:7所示的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的同源性（根据kabat编号）；或，
所述vhcdr1-3的氨基酸序列分别如seqidno:11、seqidno:12和seqidno:13所示，或所述vhcdr1-3的氨基酸序列分别与seqidno:11、seqidno:12和seqidno:13所示的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的同源性（根据kabat编号）；或，
所述vhcdr1-3的氨基酸序列分别如seqidno:17、seqidno:18和seqidno:19所示，或所述vhcdr1-3的氨基酸序列分别与seqidno:17、seqidno:18和seqidno:19所示的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的同源性（根据chothia编号）；或，
所述vhcdr1-3的氨基酸序列分别如seqidno:23、seqidno:24和seqidno:25所示，或所述vhcdr1-3的氨基酸序列分别与seqidno:23、seqidno:24和seqidno:25所示的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的同源性（根据chothia编号）；
以及，所述轻链可变区包含vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3，其中：
所述vlcdr1-3的氨基酸序列分别如seqidno:8、seqidno:9和seqidno:10所示，或所述vlcdr1-3的氨基酸序列分别与seqidno:8、seqidno:9和seqidno:10所示的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的同源性（根据kabat编号）；或，
所述vlcdr1-3的氨基酸序列分别如seqidno:14、seqidno:15和seqidno:16所示，或所述vlcdr1-3的氨基酸序列分别与seqidno:14、seqidno:15和seqidno:16所示的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的同源性（根据kabat编号）；或，
所述vlcdr1-3的氨基酸序列分别如seqidno:20、seqidno:21和seqidno:22所示，或所述vlcdr1-3的氨基酸序列分别与seqidno:20、seqidno:21和seqidno:22所示的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的同源性（根据chothia编号）；或，
所述vlcdr1-3的氨基酸序列分别如seqidno:26、seqidno:27和seqidno:28所示，或所述vlcdr1-3的氨基酸序列分别与seqidno:26、seqidno:27和seqidno:28所示的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的同源性（根据chothia编号）。
在本发明的一个实施方式中，对于所述抗体或其抗原结合部分，所述重链可变区的vhcdr1-3分别如seqidno:5、seqidno:6和seqidno:7所示，以及，轻链可变区的vlcdr1-3分别如seqidno:8、seqidno:9和seqidno:10所示。
在本发明另一个实施方式中，对于所述抗体或其抗原结合部分，所述重链可变区的vhcdr1-3分别如seqidno:11、seqidno:12和seqidno:13所示，以及，轻链可变区的vlcdr1-3分别如seqidno:14、seqidno:15和seqidno:16所示。
更具体地，所述重链可变区的氨基酸序列如seqidno:1所示，或所述重链可变区的氨基酸序列包含与seqidno:1所示的氨基酸序列至少具有同源性为90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的氨基酸序列，以及
所述轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:2所示，或所述轻链可变区的氨基酸序列包含与seqidno:2所示的氨基酸序列至少具有同源性为90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的氨基酸序列。
更具体地，所述重链可变区的氨基酸序列如seqidno:3所示，或所述重链可变区的氨基酸序列包含与seqidno:3所示的氨基酸序列至少具有同源性为90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的氨基酸序列，以及
所述轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:4所示，或所述轻链可变区的氨基酸序列包含与seqidno:4所示的氨基酸序列至少具有同源性为90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的氨基酸序列。
在本发明的一个实施方式中，对于所述抗体或其抗原结合部分，所述重链可变区的氨基酸序列如seqidno:1所示，以及，所述轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:2所示。
在本发明另一个实施方式中，对于所述抗体或其抗原结合部分，所述重链可变区的氨基酸序列如seqidno:3所示，以及，所述轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:4所示。
具体地，对于本发明的抗体或其抗原结合部分，其中所述的抗体或其抗原结合部分为全抗体、多特异性抗体（例如双特异性抗体）、多特异性单链抗体（例如双特异性单链抗体）、单链抗体（scfv）、fab、fab’、f（ab’）2、线性抗体或fv抗体，以及任何包含抗体结合域或同源的抗体结合域的多肽。其中，抗体结合域可以包括完整的重链和/或轻链cdr、完整的抗体的重链和/或轻链可变区、完整的全长重链和/或轻链、或者来自所述抗体的单个、两个、三个、四个、五个或六个cdr。单链抗体包含一个重链可变区和一个轻链可变区。
具体地，本发明的抗体或其抗原结合部分，使用蛋白免疫法或者dna免疫法获得；进一步，所述的蛋白免疫法包括以上述人tnfr2蛋白为免疫原进行免疫获得抗体或其抗原结合部分；所述的dna免疫法包括以编码上述人tnfr2蛋白的dna质粒为免疫原进行免疫获得抗体或其抗原结合部分。
本发明另一方面，提供一种分离的dna，所述dna编码上述的抗体或其抗原结合部分。
本发明的另一方面，提供一种载体，所述载体包括上述任意的dna。
具体地，所述载体能够在体内或体外或离体条件下表达。进一步优选的，所述的表达载体在体内细胞中持续高水平表达。具体地，所述表达载体为原核表达载体、慢病毒表达载体、质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。更具体地，所述原核表达载体为大肠杆菌系列。
本发明的另一方面，提供一种细胞，所述细胞包括上述dna或者载体。
具体地，所述细胞可以是真核的或者原核的。更具体地，所述的细胞可以为酵母细胞、293细胞、cho细胞、大肠杆菌等。
本发明另一方面，提供一种制备上述抗体或其抗原结合部分的方法，所述方法包括蛋白免疫法、dna免疫法制备抗体或其抗原结合部分或者培养包含上述dna或者载体的细胞。
具体地，所述的蛋白免疫法包括以人tnfr2蛋白为免疫原进行免疫获得抗体或其抗原结合部分；收集tnfr2免疫后非人动物的脾细胞，将收集的脾细胞与sp2/0细胞融合获得杂交瘤细胞，培养所述杂交瘤细胞，分离纯化上述抗体或其抗原结合部分。优选将杂交瘤细胞导入非人动物，以及收集非人动物腹水的步骤。
具体地，所述的dna免疫法包括以编码人tnfr2蛋白的dna质粒为免疫原进行免疫获得抗体或其抗原结合部分。
具体地，所述培养细胞的步骤包括培养包含上述dna或者载体的细胞，获得特异性结合tnfr2的抗体或其抗原结合片段。
本发明另一方面，提供了一种杂交瘤细胞的制备方法，所述方法包括用人tnfr2免疫非人动物获得，收集tnfr2免疫后非人动物的脾细胞，将收集的脾细胞与sp2/0细胞融合获得杂交瘤细胞。
本发明的另一方面，提供一种杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞能产生上述抗体或其抗原结合部分。
具体地，所述人tnfr2蛋白为重组人tnfr2融合蛋白，具体来说该蛋白还含有人fc标签。
具体地，所述人tnfr2蛋白如seqidno:31所示。
本发明另一方面，提供了一种t细胞抗原受体或car分子，所述的t细胞抗原受体或car分子包含上述抗tnfr2抗体或其抗原结合片段。
本发明的另一方面，提供一种抗体药物偶联物（antibody-drugconjugate,adc），其包含与药物共价结合的上述抗体或其抗原结合片段。
具体地，上述adc中的药物可以为化学合成药、抗生素或者各种生物药。
本发明的另一方面，提供一种药物组合物，其包含本发明上述抗体或其抗原结合片段，或，t细胞抗原受体或car分子，或上述抗体药物偶联物，以及药用载体。
具体地，上述药用载体可以是一种也可以是多种，所述载体包括但不限于稀释剂、粘合剂、致湿剂、表面活性剂、润滑剂或崩解剂等等。
具体地，上述药物组合物可包含在纳米载体、病毒载体、微胶囊、脂质体等中给予。
具体地，上述药物组合物还可以含有治疗相同或不同适应症的其他活性成分。
本发明的另一方面，提供一种试剂盒，其包含本发明上述抗体或其抗原结合片段。
本发明的另一方面，提供一种芯片，其包含本发明上述抗体或其抗原结合片段。
本发明的另一方面，提供一种上述抗体或其抗原结合部分、上述分离的dna、载体、细胞、t细胞抗原受体或car分子、抗体药物偶联物、药物组合物、试剂盒、芯片在tnfr2相关研究方面的应用。
具体地，上述应用为本发明所述抗体或其抗原结合部分、分离的dna、载体、细胞、t细胞抗原受体或car分子、抗体药物偶联物、药物组合物在制备预防和/或治疗疾病的药物、筛选预防和/或治疗疾病的药物中的应用。
具体地，上述疾病为tnfr2信号通路相关的疾病，例如肿瘤、自身免疫性疾病、移植排斥反应等等。具体地，所述肿瘤包括恶性肿瘤，例如癌症、肉瘤、血液系统恶性肿瘤等。在一个具体实施例，所述恶性肿瘤例如黑色素瘤、淋巴癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、头颈癌、结肠癌。具体地，上述自身免疫性疾病，例如，但不限于，系统性红斑狼疮、重症肌无力、类风湿性关节炎、多发性硬化症、炎症性肠病、葡萄膜炎、糖尿病等。具体地，上述移植排斥反应可以为移植物抗宿主病（graft-versus-hostdisease,gvhd）或宿主抗移植物病（host-versus-graftdisease,hvgd）。
具体地，上述应用还可以为本发明所述抗体或其抗原结合部分、试剂盒、芯片在制备检测tnfr2的产品中的应用。
具体地，上述检测可以为定性检测，也可以为定量检测。
在本发明的另一个方面，本发明提供一种治疗疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本发明所述抗体或其抗原结合部分、t细胞抗原受体或car分子、抗体药物偶联物、药物组合物的步骤。
具体地，上述疾病为tnfr2信号通路相关的疾病，例如肿瘤、自身免疫性疾病、移植排斥反应等等。具体地，所述肿瘤包括恶性肿瘤，例如癌症、肉瘤、血液系统恶性肿瘤等。在一个具体实施例，所述恶性肿瘤例如黑色素瘤、淋巴癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、头颈癌、结肠癌。具体地，上述自身免疫性疾病，例如，但不限于，系统性红斑狼疮、重症肌无力、类风湿性关节炎、多发性硬化症、炎症性肠病、葡萄膜炎、糖尿病等。具体地，上述移植排斥反应可以为移植物抗宿主病（graft-versus-hostdisease,gvhd）或宿主抗移植物病（host-versus-graftdisease,hvgd）。
在本发明的另一个方面，提供了一种联合治疗受试者中的恶性肿瘤的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的本发明所述抗体或其抗原结合部分、t细胞抗原受体或car分子、抗体药物偶联物、药物组合物，还包括向所述受试者施用治疗有效量的其它治疗恶性肿瘤的药剂或施用其它治疗恶性肿瘤的方法，例如化疗药物、手术治疗、放射治疗、生物治疗、中医中药治疗、微创治疗等等。
具体地，上述恶性肿瘤可以选自：黑色素瘤、淋巴癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、头颈癌、结肠癌。
本发明的另一方面，提供了一种诱导免疫应答的方法，所述的方法包括向受试者施用本发明所述抗体或其抗原结合部分、t细胞抗原受体或car分子、抗体药物偶联物、药物组合物。
本发明的另一方面，提供了一种tnfr2的检测方法，所述的检测方法包括将待检测样品与本发明所述抗体或其抗原结合片段接触，然后检测tnfr2与所述抗体或其抗原结合片段形成的复合物。
具体地，所述的检测方法为检测tnfr2的存在或含量。其中，所述的存在表示有无，所述的含量可以为表达量或蛋白浓度等。具体地，所述检测可以为免疫组织化学检测。
本发明的另一方面，提供了一种tnfr2相关的疾病的诊断方法，所述的诊断方法包括将待检测样品与本发明所述抗体或其抗原结合片段接触，然后检测tnfr2与所述抗体或其抗原结合片段形成的复合物。
本发明的有益效果：本发明经过筛选得到的抗体或其抗原结合片段能够特异性地与人tnfr2结合，具有高亲和力，表现稳定。此外，该抗体或其抗原结合片段能有效抑制肿瘤生长，并且个体用药安全，可用于治疗与tnfr2信号通路相关的疾病（例如肿瘤）。
附图说明
图1所示为不同抗tnfr2抗体阻断人tnfr2与tnfa之间的结合的流式细胞检测结果，pbs用作阴性对照。
图2所示为抗tnfr2抗体处理后，实验动物的体重随时间变化的折线图，生理盐水（g1）用作阴性对照。
图3所示为抗tnfr2抗体处理后，实验动物体内的肿瘤体积随时间变化的折线图，生理盐水（g1）用作阴性对照。
具体实施方式
除非本文另有定义，与本发明结合使用的科学和技术术语及其缩略语应具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。以下列举了本文中使用的部分术语和缩略语。
抗体：antibody，ab；
免疫球蛋白：immunoglobulin，ig；
重链：heavychain，hc；
轻链：lightchain，lc；
重链可变区：heavychainvariabledomain，vh；
重链恒定区：heavychainconstantdomain，ch；
轻链可变区：lightchainvariabledomain，vl；
轻链恒定区：lightchainconstantdomain，cl；
互补决定区：complementaritydeterminingregion，cdr，是指抗体的抗原互补结合区；
fab片段：antigenbindingfragment，fab；
fc片段：fragmentcrystallizableregion，fc；
单克隆抗体：monoclonalantibodies，mabs；
双特异性抗体：bispecificantibody，bsab。
如本文所用，术语“抗体”指包含至少一个抗原识别位点并能特异性结合抗原的免疫球蛋白分子。本发明所提及的术语“抗体”以其最广泛的含义理解，并包含单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段、包含至少两个不同的抗原结合结构域的多特异性抗体（例如双特异性抗体）。抗体还包括鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体以及其它来源的抗体。本发明的抗体可以来源于任何动物，包括但不限于人、非人灵长类动物、小鼠或大鼠等的免疫球蛋白分子。抗体可以含有另外的改变，如非天然氨基酸，fc效应子功能突变和糖基化位点突变。抗体还包括翻译后修饰的抗体、包含抗体的抗原决定簇的融合蛋白，以及包含对抗原识别位点的任何其它修饰的免疫球蛋白分子，只要这些抗体展现出所期望的生物活性。
根据抗体重链恒定区的氨基酸序列，可以将免疫球蛋白分为5类：iga、igd、ige、igg和igm，其还可以进一步分成不同的亚类（同种型），如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1、iga2等。根据轻链氨基酸序列，可将轻链分类为λ链或κ链。本发明的抗体可以是任何种类（如iga、igd、ige、igg和igm）或亚类（如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1或iga2）。
术语“抗原结合片段”包括但不限于：fab片段，其具有vl、cl、vh和ch1域；fab'片段，其是在ch1域的c端具有一个或多个半胱氨酸残基的fab片段；fd片段，其具有vh和ch1域；fd'片段，其具有vh和ch1域和在ch1域的c端的一个或多个半胱氨酸残基；fv片段，其具有抗体的单一臂的vl和vh域；dab片段，其由vh域或vl域组成；分离的cdr区；f(ab')2片段，其是包含由铰链区处的二硫桥连接的两个fab'片段的二价片段；单链抗体分子(例如单链fv；scfv)；具有两个抗原结合位点的"双抗体"，其包含同一多肽链中与轻链可变域(vl)连接的重链可变域(vh)；"线性抗体"，其包含一对串联fd区段(vh-ch1-vh-ch1)，该区段与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区；和任何前述物质的修饰的形式，其保留了抗原结合活性。
如本文所用，术语“cdr”是指抗体可变序列内的互补决定区。对于每个可变区，在重链和轻链的每个可变区中有三个cdr，其称为cdr1、cdr2和cdr3。这些cdr的确切边界根据不同的系统而不同定义。kabat等人(kabatetal,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest(nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1987)和(1991))描述的系统不仅提供了适用于抗体可变区的明确的残基编号系统，而且还提供了限定三个cdr的残基边界。这些cdr可以称为kabatcdr。每个互补决定区可以包含来自如由kabat定义的“互补决定区”的氨基酸残基。chothia等人(chothia&lesk,j.mol.biol,196:901-917(1987)和chothiaetal.,nature342:877-883(−1989))发现，kabatcdr内的某些子部分采用几乎相同的肽骨架构象，尽管在氨基酸序列水平上具有大的多样性。这些子部分分别称为l1、l2和l3或h1、h2和h3，其中“l”和“h”分别表示轻链和重链区。这些区域可以称为chothiacdr，其具有与kabatcdr重叠的边界。还有其它cdr边界定义可以不严格遵循上述系统之一，但是仍将与kabatcdr重叠，本文使用的方法可以利用根据任何这些系统定义的cdr，尽管优选实施方案使用kabat或chothia定义的cdr。如本文所用，“抗体可变区”是指抗体分子的轻链和重链中包括互补决定区(cdr，即cdr1、cdr2和cdr3)和框架区(fr)的氨基酸序列的部分。vh是指重链的可变域。vl是指轻链的可变域。
如本文所用的术语“嵌合抗体”是指其中可变区衍生自非人物种(例如衍生自啮齿动物)并且恒定区衍生自不同物种(例如人)的抗体。嵌合抗体可以通过抗体工程化生成。“抗体工程化”是一般用于抗体的不同种类的修饰的术语，并且用于抗体工程化的方法是本领域技术人员公知的。因此，嵌合抗体可以是遗传或工程化的重组抗体。生成嵌合抗体的方法是本领域技术人员已知的，并因此，嵌合抗体的生成可以通过除本文所述之外的其他方法进行。开发用于人类治疗应用的嵌合单克隆抗体以降低非人抗体(例如啮齿动物抗体)的预期抗体免疫原性。它们通常可含有非人(例如鼠或兔)可变区，其对感兴趣的抗原具有特异性，和人恒定抗体重链和轻链结构域。如在嵌合抗体的上下文中所用的术语“可变区”或“可变结构域”是指包含免疫球蛋白的重链和轻链两者的cdr和框架区的区域，如下所述。
如本文所用的术语“人源化抗体”是指遗传工程改造的非人抗体，其含有经修饰的人抗体恒定结构域和非人可变结构域，以含有与人可变结构域具有高水平的序列同源性。这可以通过将六个非人抗体cdr(其一起形成抗原结合位点)移植到同源人受体框架区(fr)上来实现。为了完全重建亲本抗体的结合亲和力和特异性，可能需要将框架残基从亲本抗体(即非人抗体)置换到人框架区中(回复突变)。因此，人源化抗体可以包含非人cdr序列，主要是人框架区，其任选地包含对非人氨基酸序列的一个或多个氨基酸回复突变，和完全人恒定区。任选地，可以应用另外的氨基酸修饰(其不一定是回复突变)，以获得具有优选特征的人源化抗体，例如亲和力和生化特性和/或可以在恒定区引入另外的氨基酸突变。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本均质的抗体群体获得的抗体，即构成群体的各抗体是相同的，除了可以少量存在的可能的天然存在的突变外。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆制剂中的每种抗体针对抗原上相同的单一决定簇。如本文使用，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体，并且修饰语“单克隆抗体”不应被解释为需要通过任何特定方法生产抗体。
本发明所述的“施用”包括但不限于口服、肠给药、皮下注射、皮内注射、肌肉注射、动脉内注射、静脉注射、鼻腔给药、透皮给药、结膜下给药、腹腔内注射、眼球内给药、眼眶给药、眼球后给药、视网膜给药、脉络膜给药、鞘内注射等。
本发明所述的“有效量”是指在以单个或多个剂量给予至患者或器官或个体之后提供所希望的治疗的本发明所述的产品（优选抗tnfr2抗体或其抗原结合片段）的量或剂量。
如本文所用，术语“化疗药物”是指具有在治疗以异常细胞生长为特征的疾病中的治疗有用性的任何化学试剂。如本文所用的化学治疗剂包括化学剂和生物剂。这些试剂发挥功能以抑制癌细胞实现持续存活所依赖的细胞活性。化疗剂的类别包括烷化/生物碱剂、抗代谢物、激素或激素类似物，以及各种各样的抗新生物药物。
本发明所述的“诊断”是指以查明患者过去、诊断时或将来是否患有疾病或病症，或者是查明疾病的进展或将来可能的进展，或者是评估患者对治疗的反应。
本发明所述“治疗”表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。
本发明所述的“受试者”为哺乳动物，尤其灵长类动物，尤其是人。
本发明所述的“肿瘤”选自白血病、淋巴瘤、卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、肺癌（例如非小细胞肺癌等）、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征以及肉瘤。其中，所述的白血病选自由以下各项组成的组：急性淋巴细胞性(成淋巴细胞性)白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自由以下各项组成的组：霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括b细胞淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区b细胞淋巴瘤、t细胞淋巴瘤和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；并且所述肉瘤选自由以下各项组成的组：骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、腺泡状软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤以及软骨肉瘤。
本发明所述的“癌症”是指起源于上皮组织的恶性肿瘤，为恶性肿瘤中最常见的一类。相对于的，起源于间叶组织的恶性肿瘤称为“肉瘤”，起源于血液系统的恶性肿瘤称为“血液系统恶性肿瘤”。
非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组dna和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：molecularcloningalaboratorymanual，2nded.，ed.bysambrook，fritschandmaniatis(coldspringharborlaboratorypress：1989)；dnacloning，volumesiandii(d.n.glovered.，1985)；immunochemicalmethodsincellandmolecularbiology(mayerandwalker，eds.，academicpress，london，1987)；handbookofexperimentalimmunology，volumesv(d.m.weirandc.c.blackwell，eds.，1986)。
本发明所述的“和/或”包括择一列出的项目以及任何数量的项目组合。
本发明所述的“包括”或“包含”是开放式的描述，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响技术效果的其他指定成分或步骤。其在本申请中用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有本发明所述的活性。
本文所引用的各种出版物、专利和公开的专利说明书，其公开内容通过引用整体并入本文。
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1：抗体生成
通过使用重组人tnfr2蛋白（htnfr2，seqidno：31）或编码重组人tnfr2蛋白的表达质粒免疫小鼠。具体来说，以100μg/ml的浓度以20μg/小鼠用经人fc标记的人tnfr2免疫接种6-8周大的雌性balb/c小鼠。将经fc标记的人tnfr2蛋白用佐剂乳化，并注射在小鼠背部的四个位置。对于第一次皮下（s.c.）注射，将稀释的抗原用等体积的完全弗氏佐剂（cfa）乳化。在随后的皮下注射中，将蛋白质用等体积的不完全弗氏佐剂（ifa）乳化。在第三次注射或加强免疫接种之后三天，收集血液（血清）并使用elisa分析抗体效价。
在另一个实验中，通过将编码人tnfr2的表达质粒注射到小鼠中来免疫接种6-8周大的雌性balb/c小鼠。通过使用基因枪以1000μg/μl的浓度以每只小鼠60μg将编码抗原的质粒注射到小鼠的胫骨前肌中（肌内注射；i.m.注射）。进行至少四次注射，每次注射之间间隔至少14天。在最后一次免疫接种之后7天收集血液（血清），并通过elisa测试血清的抗体效价。
在前一次免疫接种之后至少十四天还进行了增强免疫接种的程序（通过注射质粒或通过注射蛋白质）。将在表面表达ox40抗原的cho细胞通过尾静脉静脉内注射到小鼠体内。然后在注射之后四天收集脾。首先通过cd3ε微珠和抗小鼠igm微珠选择脾细胞，然后使其与sp2/0细胞融合。然后将细胞平板接种在具有次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷（hat）培养基的96孔板中。
根据标准程序，使用荧光激活细胞分选（fluorescence-activatedcellsorting，facs）对96孔板中的杂交瘤上清液进行初步筛选。在筛选之前，将中国仓鼠卵巢（chinesehamsterovary，cho）细胞添加到96孔板中（每孔2×104个细胞）。使用50μl上清液。实验中使用的抗体是：
（1）荧光素（fitc）缀合的affinipuref(ab)2片段山羊抗小鼠igg，fcγ片段特异性的；和
（2）alexafluor®647缀合的affinipuref(ab)2片段山羊抗人igg，fcγ片段特异性的。
使用clonepix2进行亚克隆。简单地说，将在初步筛选中鉴定出的阳性孔转移到半固体培养基中，并鉴定和测试igg阳性克隆。使用fitc抗小鼠iggfc抗体。
将1×106个阳性杂交瘤细胞腹腔内注射至b-ndg®小鼠（北京百奥赛图，中国北京（beijingbiocytogen,beijing,china））。通过使杂交瘤细胞在小鼠腹腔内生长来产生单克隆抗体。杂交瘤细胞在小鼠腹部扩增并且产生腹水。腹水含有高浓度的抗体，可将其收获以备后用。
根据制造商的说明，利用geakta蛋白色谱全自动纯化仪（gehealthcare）进行抗体纯化。获得了本发明的抗tnfr2单克隆抗体10-5e6（有时简称为“5e6”）和10-1h5（有时简称为“1h5”）。上述抗体的重链可变区（vh）和轻链可变区（vl）的氨基酸序列如以下表1至表3所示。
5e6的重链cdr1、cdr2和cdr3和轻链cdr1、cdr2和cdr3氨基酸序列示出在seqidno:5-10（kabat编号）或seqidno:17-22（chothia编号）中。
1h5的重链cdr1、cdr2和cdr3和轻链cdr1、cdr2和cdr3氨基酸序列示出在seqidno:11-16（kabat编号）或seqidno:23-28（chothia编号）中。
除非在本公开内容中特别指出，否则在本公开内容中默认使用kabat编号。
表1.抗体的vh和vl序列
表2.kabatcdr序列
表3.chothiacdr序列
实施例2：抗体的体外检测
抗体阻断检测
本实验用于检测实施例1制备的抗tnfr2抗体（10-5e6和10-1h5）对tnfr2和tnfa的阻断能力。具体实验操作如下：取96孔细胞培养板，每孔加入表达人源化tnfr2蛋白的cho-s-htnfr2(t)-egfp细胞（25μl，2x104细胞/孔）。将纯化抗体按照50、5、0.5、0.05、0.005μg/ml的浓度进行稀释，每孔加入25μl，并于4℃静置30分钟。
在用磷酸缓冲盐水（pbs）洗涤两次之后，将50μl的biotinylatedhumantnf-alphaprotein,his，avitag（百普赛斯，货号tna-h82e3）（1μg/ml）添加到每个孔中，在4℃孵育15分钟，然后用pbs洗涤2次后，每个孔中加入50μl1:100稀释的streptavidin-pe（jacksonimmunoresearch，货号109-116-098），在4℃孵育30分钟后用pbs洗涤2次，每孔加入200μlpbs并进行流式细胞分析。结果如图1所示。
从图1所示的结果可以看出，随着抗tnfr2抗体（10-5e6和10-1h5）浓度的增加，pe标记荧光强度逐渐减弱，表明本发明的抗tnfr2抗体可以有效阻断与人tnfr2与tnfa之间的结合。
抗体亲和力检测
随后，利用biacoret200（biacore）的proteina传感芯片捕获抗体的方法，检测这些抗tnfr2抗体与htnfr2-his（acro，货号：tn2-h5227）结合的亲和力。
具体实验操作如下：将抗tnfr2抗体10-5e6和10-1h5注入传感芯片（10μl/min，50s），蛋白捕获为45-100ru。然后将htnfr2-his蛋白分别以200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625或0.78125nm的浓度注入传感芯片（30μl/min，100-400s），解离时间为300-1000s。用ph2.0的甘氨酸（30μl/min，10-30s）再生芯片后读取检测结果。动力结合速率（kineticassociationrates,kon）和动力解离速率（kineticdissociationrates,koff）可通过bioacoret200测评软件进行1：1朗缪尔结合模型拟合获得（(karlsson,r.roos,h.fagerstam,l.petersson,b.,1994.methodsenzymology6.99-110）。亲和力速率常数kd=koff/kon，抗体亲和力检测拟合结果如表4所示。
表4.抗tnfr2抗体亲和力检测
实施例3：抗体的体内药效检测
为了检测实施例1制备的抗tnfr2抗体（10-5e6和10-1h5）的体内药效，使用了tnfr2基因人源化小鼠制备肿瘤动物模型。该小鼠表达人鼠嵌合tnfr2蛋白（seqidno:29），其中鼠tnfr2蛋白的胞外区被人源序列替换：鼠tnfr2蛋白（seqidno:30）的第33-260位氨基酸被人tnfr2蛋白（seqidno:31）的第33-259位氨基酸替换。该b-htnfr2小鼠模型为tnfr2单抗药物的临床前动物实验提供了新的检测方法，极大地提高了临床实验的可预测性（参见pct申请号pct/cn2020/113618和中国申请号202010922139.7，上述文献通过引用整体并入本文）。
肿瘤动物模型的制备过程如下：在b-htnfr2小鼠体内通过皮下注射接种鼠mc-38细胞（结肠癌细胞）。待肿瘤体积达到150±50mm3后，将小鼠随机分成抗tnfr2抗体给药组和对照组（生理盐水）进行肿瘤抑制药效实验。通过腹腔注射给药。每周定期测量小鼠体重和肿瘤体积2次。肿瘤体积（mm3）=0.5x长径x短径2。接种后单只小鼠肿瘤体积达到3000mm3时执行安乐死结束试验。
肿瘤生长抑制率（tgi）计算公式：tgi（%）=[1-(ti-t0)/(vi-v0)]×100，其中ti是治疗组第i天的平均肿瘤体积；t0是治疗组第0天的平均肿瘤体积；vi是对照组第i天的平均肿瘤体积；v0是对照组第0天的平均肿瘤体积。使用t-检验进行统计学分析。当tgi%大于60%时，表示对肿瘤生长具有显著抑制效果。p<0.05表示统计结果具有显著差异。
取5-9周龄的b-htnfr2小鼠，皮下接种mc38细胞（5x105/只），待肿瘤体积达到150±50mm3后随机分为3组，每组6只。给药组分别用抗tnfr2抗体10-5e6和10-1h5通过腹腔注射给药处理，剂量为10mg/kg，对照组注射生理盐水。每3天给药一次，共给药6次。每周2次测量小鼠的体重和肿瘤体积，5周后结束实验。如图2所示，对照组和给药组小鼠的平均体重在整个实验周期都稳定增长，且组间无明显差异，表明抗tnfr2抗体给药后没有对小鼠产生明显的毒性。如图3中的结果所示（分组后35天的肿瘤体积数据），与对照组相比，给药组中肿瘤的生长都受到不同程度的抑制。以下表5显示了各组的tgi%结果。
表5.肿瘤生长抑制率
上述结果表明，本发明的抗tnfr2抗体10-5e6和10-1h5都显示出肿瘤抑制效果，其中10-5e6具有最好的肿瘤抑制效果。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
序列表
<110>百奥赛图（北京）医药科技股份有限公司
<120>抗tnfr2抗体及其用途
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1.一种特异性结合tnfr2蛋白的抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述抗体或其抗原结合部分包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含vhcdr1、vhcdr2和vhcdr3，所述轻链可变区包含vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3，其中，
所述vhcdr1-3分别如seqidno:5、seqidno:6和seqidno:7所示，以及，所述vlcdr1-3分别如seqidno:8、seqidno:9和seqidno:10所示；或，
所述vhcdr1-3分别如seqidno:11、seqidno:12和seqidno:13所示，以及，所述vlcdr1-3分别如seqidno:14、seqidno:15和seqidno:16所示。
2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列如seqidno:1所示，以及，所述轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:2所示；或，
所述重链可变区的氨基酸序列如seqidno:3所示，以及，所述轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:4所示。
3.如权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述的抗体或其抗原结合片段特异性结合人tnfr2，并阻断人tnfr2与tnfa的相互作用。
4.一种分离的dna，其特征在于，所述dna编码权利要求1-3任一项所述的抗体或其抗原结合部分。
5.一种载体，其特征在于，所述载体包括权利要求4所述的dna。
6.一种细胞，其特征在于，所述细胞包括权利要求4所述的dna或者权利要求5所述的载体。
7.一种权利要求1-3任一项所述的抗体或其抗原结合部分的制备方法，其特征在于，所述方法包括培养权利要求6所述的细胞的步骤。
8.一种抗体药物偶联物，其包含与药物共价结合的权利要求1-3任一所述的抗体或其抗原结合片段。
9.一种药物组合物，其包含权利要求1-3任一所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求8所述的抗体药物偶联物，以及药用载体。
10.如权利要求1-3任一所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求8所述的抗体药物偶联物或权利要求9所述的药物组合物在制备预防和/或治疗疾病的药物、筛选预防和/或治疗疾病的药物中的应用，其中，所述疾病为tnfr2信号通路相关的疾病。
技术总结