本发明涉及生物检测领域，特别涉及抗psma蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用。
背景技术：
前列腺癌是男性最常见的恶性肿瘤，世界范围内男性癌症相关死亡率第三位。据统计，目前约有1-2％的男性死于前列腺癌。近年来,随着社会的高速发展，人们生活质量得到提高,人口平均寿命延长及诊疗技术也在日益进步,但前列腺癌发病率仍然呈逐渐上升的趋势，目前前列腺癌的发病率约为11.2％。前列腺癌的早期诊断,也日益受到学者的重视。
前列腺特异性膜抗原(psma)在前列腺癌细胞的表面上以及在多种实体瘤的新脉管系统中独特地过度表达。因此，psma作为用于前列腺癌的检测和治疗的临床生物标记已引起了注意。前列腺特异膜抗原，简称psma，首次发现于1987年。它是一个ⅱ型跨膜糖蛋白，它由750个氨基酸构成包含19个氨基酸的胞内区、24个氨基酸的跨膜区和707个氨基酸的胞外区，蛋白质的分子量为84kda,经糖基化作用后，分子量约100kda。psma的基因定位于11号染色体的断臂上，全长60kb,包括19个外显子和18个内含子。
pmsa高表达于前列腺癌上皮细胞膜，其表达量与肿瘤细胞的数量及侵袭性呈正相关。psma主要表达与前列腺上皮细胞膜上，在前列腺癌有非常高比例的表达，在恶性度较高的、转移性的及激素难治性的前列腺癌其表达进一步增高。因此，psma具有较高的前列腺特异性，与恶性肿瘤疾病进程密切相关，是较理想的肿瘤标记物和前列腺癌生物治疗靶点。免疫组化显示，psma在前列腺的正常组织，良性增生组织，上皮内增生，癌组织中均有表达，且表达强度依次上升，在前列腺癌中表达强度最高；在前列腺癌淋巴结转移灶，骨转移灶中表达呈阳性。同时psma在多种非前列腺的恶性肿瘤也有一定的表达，这些肿瘤主要包括肾透明细胞癌，膀胱移行细胞癌，结肠腺癌，胰导管癌，非小细胞肺癌，如组织肉瘤，乳腺癌等。psma具有较高的特异性和位于前列腺上皮细胞膜的特性，其在前列腺癌及其转移灶中表达增高，在前列腺癌的靶向治疗中具有重要意义。
技术实现要素：
发明人提供了一种抗psma蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列分别是seqidno.2和seqidno.3所示的氨基酸序列。
进一步地，所述单克隆抗体重链和轻链可变区氨基酸序列分别是seqidno.4和seqidno.5所示的核苷酸序列所编码。
进一步地，所述单克隆抗体特异性识别psma蛋白。
进一步地，所述单克隆抗体特异性识别中seqidno.1所示的氨基酸序列。
进一步地，所述单克隆抗体由保藏号为cgmccno.19683的杂交瘤细胞系产生。所述细胞株为小鼠杂交瘤细胞系11d1e5e10，分类命名为：小鼠杂交瘤细胞系，该细胞系已于2020年04月24日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
进一步地，所述抗psma蛋白为小鼠igg1亚型单克隆抗体。
进一步地，所述抗psma蛋白单克隆抗体以重组蛋白为免疫原进行制备所述重组蛋白包含具有抗原性的psma片段以及组氨酸蛋白标签，所述psma片段为人psma蛋白的第307位至第750位氨基酸片段。
发明人还提供了一株分泌抗psma蛋白的杂交瘤细胞系，所述细胞株为小鼠杂交瘤细胞系11d1e5e10，所述细胞系保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为：中国北京，保藏日期为2020年4月24日，保藏号为：cgmccno.19683。
发明人还提供上述任一所述的抗psma蛋白单克隆抗体，在psma蛋白免疫检测中的用途。
进一步地，所述免疫检测包括免疫组织化学法，免疫印迹法和酶联免疫法。
区别于现有技术，上述技术方案选择适宜可溶表达又具有良好免疫原性的psma第307位至第750位氨基酸区域用于重组表达。6个his的组氨酸标签可作为融合蛋白的纯化标签。对小鼠进行免疫，经细胞融合、筛选和亚克隆，获得高效分泌抗psma蛋白单克隆抗体的单克隆细胞系11d1e5e10,以及由该细胞系所分泌的抗psma蛋白单克隆抗体。本方案得到的抗体具有高特异性、敏感性，可以特异性识别表达psma蛋白的细胞，适用于免疫学检测，特别是免疫组化检测,可降低误读，提高诊断的准确性。
附图说明
图1：纯化后psma单克隆抗体的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
图2：前列腺癌免疫组化染色结果图；左为(11d1e5e10)的psma，右为市售psma(1d6)。
具体实施方式
实施例1重组psma蛋白片段的制备
一、基因克隆
从uniprot数据库(http://www.uniprot.org)中选择编号q04609的psma蛋白序列作为标准序列。依据其与dna结合的结构、抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构，选择具有区别于其他类似蛋白、长度适宜且具有特殊抗原性的区域作为抗原肽。选定psma氨基酸序列第307位至第750位序列，其对应的核苷酸序列为seqidno.1。将目的蛋白片段连接于质粒载体petβ2m上(petβ2m载体采购自武汉金开瑞生物工程有限公司，内含β2m蛋白序列及his标签)合成以上psma重组蛋白质粒。转化至大肠杆菌感受态细胞top10中，挑取平板上的克隆接种扩培，提取质粒dna，进行pcr鉴定。将pcr显示目的基因阳性的克隆进行测序分析，序列完全正确的克隆用于进行下一步实验。
β2m为i类主要组织相容性复合物(mhc)的组分，参与抗原肽向免疫系统的呈递，促进抗体的生成。6-his的组氨酸标签可作为融合蛋白的纯化标签。
二、重组蛋白表达纯化
将重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞rosetta中，挑取平板上的克隆接种扩培，保菌。接菌液至4ml含50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，在37℃，270rpm条件下振荡培养过夜。然后转接至200ml含50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，在37℃、270rpm条件下振荡培养8h后,收集菌体。将表达重组蛋白的菌体进行超声波破碎处理。将菌液8000g离心10min，去上清培养基，保留菌体用适量的pbs缓冲液重悬洗涤，菌体中加入镍柱平衡缓冲液进行超声破碎。超声破碎至菌液澄清后，离心，分别收集沉淀及上清。将破碎上清、沉淀以及经诱导表达的菌体进行sds-page电泳，分析重组蛋白的存在位置。
采用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白。纯化主要步骤参照常州天地人和生物科技有限公司说明书进行。纯化后的目的蛋白进行透析除盐，并用超滤管进行浓缩。最后通过紫外微量分光光度计测定蛋白浓度，通过sds-page电泳检测蛋白纯度，通过elisa检测分析、确定其特异性。表1为psma抗原特异性检测结果。图1：纯化后psma单克隆抗体的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
表1：elisa检测psma抗原特异性
注：over表示超过仪器的测量范围，即反应很强。
实施例211d1e5e10杂交瘤细胞系的建立
一、免疫
将实施例1中获得的psma蛋白稀释至1mg/ml，然后与等体积的完全弗氏佐剂(cfa,sigma公司)混合乳化，对18-20g的balb/c小鼠(购自福州吴氏实验动物)进行腹部注射免疫，注射剂量为50μg/只。此后每14天加强免疫一次，抗原使用弗氏非完全佐剂(ifa,sigma公司)乳化，剂量为25μg/只。第2次加强免疫
后14天以间接elisa(波长450nm)检测小鼠血清中抗免疫原的多抗效价，效价最高的小鼠以尾静脉注射冲击免疫，抗原用pbs溶液混匀，剂量为50μg/只。
二、细胞融合
无菌制备免疫达标的小鼠脾细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0(atcc)以5:1比例混合，1000rpm离心10min，弃上清后，在1分钟内由慢到快加入1ml预热至37℃的peg(sigma公司)溶液，加入过程中需轻轻转动离心管，使细胞与peg充分接触。室温静置90s后，2min内由慢到快加入4ml预热至37℃的无血清dmem(hyclone公司)培养基，随后的2min内再加入10ml预热无血清dmem培养基，最后2min内加完剩余的预热无血清dmem培养基，定容至50ml，整个加入过程需要缓慢摇动离心管，确保混合均匀，减轻对细胞的伤害。室温静置10min后离心(1000rpm，5min)，弃上清，用10-20mlhat(sigma公司)培养基重悬细胞，并用hat培养基稀释至终浓度为0.5×106cells/ml，所有溶液转移至96孔板中，200μl/孔，并做好标记。将96孔培养板小心转移至37℃，5％co2培养箱中培养。定期检查细胞的生长状态及潜在的污染，注意尽量少开合培养箱，确保培养环境稳定。融合后第5天，向培养板中补加hat培养基，50μl/孔。
三、elisa筛选阳性杂交瘤细胞
当融合细胞直径长至大概为1-2mm时，吸取50-200μl培养液上清进行首次细胞筛选(elisa、ihc-p及其他方法检测)，同时往培养孔中补加hat培养基至200μl。elisa检测该培养液上清，将检测得到阳性结果的培养孔内细胞培养液全部转移至24孔培养板，补加ht培养基，2ml/孔，培养3天。
重复筛选24孔板中各细胞株，剔除不是阳性结果的培养孔细胞，获得阳性结果较好的培养孔细胞。将这些24孔培养板得到的阳性孔细胞采用有限稀释法进行亚克隆筛选，即将有限稀释法得到细胞液加入96孔培养板中转移至co2培养箱培养11天，待克隆细胞直径为1-2mm时，重复进行细胞筛选。根据检测结果，每个亚克隆细胞株，选取4个生长良好的单克隆阳性培养孔，并转移至24孔板中继续培养。一段时间后再次筛选24孔板中克隆得到的阳性克隆细胞株，即为分泌特定单克隆抗体的杂交瘤细胞株11d1e5e10。将此细胞株转入t-75培养瓶中扩增至对数生长期保种或进行后续实验。
实施例3体外培养法制备单克隆抗体
一、体外培养
获得稳定的杂交瘤细胞系后，主要采用体外培养法获取单抗。
以含10％胎牛血清的dmem完全培养基培养杂交瘤细胞，然后低速离心后收集培养上清，4℃储存备用。
二、单克隆抗体的纯化
用rproteinasepharosefastflow(ge公司)亲和层析柱纯化抗体：①装柱，将购买的proteina填料适量装于重力层析柱中用平衡缓冲液(0.1mtris溶液，ph7.0)冲洗至平衡；②上样，将经过0.22μm滤膜过滤的腹水加入装好的层析柱中，控制流速1滴/秒；③平衡，上完样液后使用平衡缓冲液冲洗至平衡；④洗脱，加入洗脱缓冲液(0.1m柠檬酸溶液，ph3.0)冲洗柱子并收集洗脱液；⑤再生，洗脱完成后加入平衡缓冲液冲洗柱子至平衡，2倍柱体积的20％乙醇冲洗后置于4℃保存。最后采用sds-page法鉴定抗体纯度(如附图2),纯度达95％以上，紫外微量分光光度计法测定抗体浓度，浓度达到3.0mg/ml以上。
实施例4单克隆抗体特性鉴定
一、亚型鉴定
将细胞上清稀释成1μg/ml包被酶标板,每孔加100μl，4℃包被过夜，倾空液体，用含0.05％tween的pbs(pbs-t)洗板3次，每孔加入200μl封闭液(含2％bsa的pbs-t溶液)，37℃孵育1h。倾空液体，用pbs-t清洗3次。每孔加入稀释5倍的0.1ml杂交瘤细胞株培养液上清，37℃孵育1h。倾空液体，用pbs-t清洗3次。用封闭液1：400稀释hrp标记的羊抗鼠(κ,λ，igm，igg1，igg2a，igg2b，igg3，iga)抗体(southernbiotech公司)，每孔分别加入0.1ml，37℃孵育1h。倾空液体，用pbs-t清洗3次。每孔加100μltmb(湖州英创生物科技有限公司)底物(a、b等体积混合溶液)进行显色,室温反应15min，每孔加入50μl1nhcl溶液终止显色反应，然后酶标仪测定450nm波长下的od值。结果显示，本发明单克隆抗体为igg1型鼠源单克隆抗体。
二、亲和常数测定
包被psma蛋白，包被浓度为100μg/ml,100μl/孔，4℃包被过夜，pbs-t洗3次。每孔加200μl封闭液37℃封闭1h，pbs-t洗3次。实施例4中纯化的单克隆抗体，稀释成以下浓度(单位：ng/ml)：2000、500、125、62.5、31.25、15.625、3.125、0.625，37℃孵育1h，pbs-t洗3次。hrp标记的羊抗鼠二抗1：5000稀释，每孔100μl，37℃孵育1h，pbs-t洗3次。每孔加入100μltmb(湖州英创生物科技有限公司)显色液，显色13min，加100μl1.0n盐溶液终止反应。用酶标仪测定波长450nm的吸光值。画出od值对应抗体稀释倍数的曲线，找出1/2“平台od值”对应的抗体浓度a。利用下列公式计算出亲和常数为4.96×109l×mol-1。
实施例6组织芯片染色和鉴定
一、组织蜡块制备过程
对样本组织进行he切片染色，以确定肿瘤病变部位。对病变位点画圈，预备打孔。制作受体蜡块时，将塑料架置于模具上，将融化的石蜡(熔点在56～58℃)倒入模具，将组织块放入模具中的蜡液中后再加入适量蜡液使组织块完全包埋在蜡液中，冷却至室温后将模具放入-20℃冰箱6min，将蜡块从模具中取出，切片或放入4℃冰箱内保存备用。修片后进行连续切片，厚度定为4μm，将连续切片漂40％酒精中,让其自然展开，再将分开的切片转移到45℃的温水中展片30秒，用经2％apes丙酮液处理过的载玻片裱贴切片，将制成的组织芯片放入60℃烤箱内烤片2小时，取出室温冷却，放入-4℃冰箱保存。
二、ihc染色及分析
常规二甲苯脱蜡3次，每次6分钟，100％、100％、95％、95％、85％梯度乙醇中水化，每次3分钟，最后自来水冲洗。进行抗原修复，然后将切片放入湿盒中，pbs冲洗3×3分钟。滴加3％h2o2孵育10分钟，pbs冲洗3×3分钟。甩去pbs，滴加过氧化物酶阻断剂室温孵育10分钟。甩干切片，滴加适当比例稀释的一抗(首次稀释根据抗体浓度来设计抗体的稀释比例)室温(25℃)孵育1小时，pbs冲洗3×3分钟，滴加二抗室温孵育30分钟，pbs冲洗3×3分钟，甩去pbs，用新鲜配置的dab显色液显色3-10分钟。苏木素复染20秒，pbs返蓝。按照85％(3分钟)、95％(3分钟)、95％(3分钟)、100％(3分钟)、100％(3分钟)的酒精梯度依次脱水，最后两次二甲苯透明10分钟，中性树胶封片。
免疫组化染色结果分为：阳性和阴性。阳性表达必须在细胞和组织特定的抗原部位才能视为阳性。在组织染色分布清晰及细胞定位准确的情况下，染色结果根据染色强度的差异进行进一步划分，具体如下：
1、样本为弱阳性；标记为“ ”；
2、样本为中度阳性；标记为“ ”；
3、样本为高度阳性；标记为“ ”；
4、样本为阴性，标记为“-”。
三、样本检测结果：
用抗psma蛋白单克隆抗体(11d1e5e10)和对照抗体-市售psma抗体1d6在33例粒前列腺癌上进行同步检测，结果如下表所示。
结果显示:抗psma蛋白单克隆抗体(11d1e5e10)的染色定位准确，染色清晰且无非特异性染色，背景干净，说明抗psma蛋白单克隆抗体(11d1e5e10)特异性强。并且在33例前列腺癌中，使用抗psma蛋白单克隆抗体(11d1e5e10)的阳性细胞数和阳性强度与使用对照试剂的阳性细胞数和阳性强度相当，说明抗psma蛋白单克隆抗体(11d1e5e10)的敏感性和亲和力与市售抗体相当。
而用抗psma蛋白单克隆抗体(11d1e5e10)和对照抗体-市售1d6，在正常组织芯片上进行同步检测，样本阳性和阴性结果一致，说明本抗体在正常组织的特异性同市售抗体相当。图2为一例前列腺癌免疫组化染色结果图；左为(11d1e5e10)的psma，右为市售psma(1d6)。
序列表
<110>福州迈新生物技术开发有限公司
<120>抗pmsa蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用
<130>2020
<160>5
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>444
<212>prt
<213>智人(homosapiens)
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<213>人工序列(artificial)
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1.一种抗psma蛋白单克隆抗体，其特征在于,所述单克隆抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列分别是seqidno.2和seqidno.3所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于,所述单克隆抗体重链和轻链可变区氨基酸序列分别是seqidno.4和seqidno.5所示的核苷酸序列所编码。
3.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体特异性识别psma蛋白。
4.根据权利要求3所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体特异性识别psma蛋白中seqidno.1所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由保藏号为cgmccno.19683的杂交瘤细胞系产生。
6.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于,所述抗psma蛋白单克隆抗体为小鼠igg1亚型单克隆抗体。
7.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由重组蛋白为免疫原进行制备，所述重组蛋白包含具有抗原性的psma片段以及组氨酸蛋白标签，所述psma片段为人psma蛋白的第307位至第750位氨基酸片段。
8.一株分泌抗psma蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系，所述细胞系为小鼠杂交瘤细胞系11d1e5e10，所述细胞系保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：cgmccno.19683。
9.权利要求1-8任一所述的抗psma蛋白单克隆抗体，在psma蛋白免疫检测中的用途。
10.根据权利要求9所述的免疫检测，其特征在于，所述免疫检测包括免疫组织化学法，免疫印迹法和酶联免疫法。
技术总结