本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种基于zzdomain与过氧化物酶apex2的二抗及其制备方法和应用。
背景技术：
在医学和生命科学研究中，许多检测实验都需要利用以过氧化物酶催动的生物化学反应，例如westernblotting、ihc、elisa等。hrp耦连二抗是一种十分常用的检测试剂，通过将辣根植株分离的hrp和动物来源的免疫球蛋白进行化学耦连制备而成。hrp耦连二抗的免疫球蛋白部分可以特异性结合抗原，而hrp是过氧化物酶，可以催化底物生成有色产物或发光，从而实现目标抗原的定量和定性分析。
hrp耦连二抗的分子量较大(免疫球蛋白约为150kda，hrp为40kda)不利于穿透进入细胞内部。此外，hrp需要从辣根中分离纯化，工艺复杂；而免疫球蛋白则需要用抗原多次免疫动物后获得，实验周期长而且需要使用大量实验动物。hrp的过氧化酶活性依赖二硫键，由于胞质的还原环境，原核表达hrp常形成无活性的包涵体，所以现在都是直接从植物中提取。目前解决富含二硫键蛋白原核表达无活性的策略主要是加入信号肽，让蛋白分泌到氧化型环境的周质，但是此方法所得的蛋白产量将大大降低。
技术实现要素：
为解决上述问题，本发明提供一种基于zzdomain与过氧化物酶apex2的二抗抗体，其中主要包含两个主题结构：zzdomain和过氧化物酶apex2。本发明的二抗抗体分子量较小，稳定性较高。
本发明通过以下技术方案实现本发明的目的：
一种基于zzdomain与过氧化物酶apex2的二抗，包括由streptag、zzdomain、ggggslinker和apex2四个组成部分。
优选地，所述zzdomain用于结合igg抗体，所述apex2行使报告基团的功能，所述二抗的氨基酸序列如seqno：1所示。
葡萄球菌包含5个高度同源的igg结合结构域，分别为e、d、a、b和cdomain，而zzdomain是两个经过亲和力优化的串联bdomain序列，对igg有较强亲和力。apex2来源于经过序列优化的豌豆和大豆过氧化物酶，由于缺乏二硫键和钙离子结合位点，可以在还原性细胞质中催化反应。经过本发明对所述二抗的优化，提高了本发明基于zzdomain与过氧化物酶apex2的二抗的稳定性，其能在室温下48h以及-20℃下2个月还能具有一定的活性。
优选地，所述编辑如seqno：1所示的氨基酸序列的核苷酸序列如seqno：2。
本发明还提供一种制备所述二抗的方法，包括以下步骤：
s1获得组分部分的基因片段：通过化学合成的方式合成streptag、zzdomain、ggggslinker和apex2四个组成部分的核苷酸片段；
s2构建表达质粒：将s1的片段通过同源重组的方式连在prseta载体上；
s3转化克隆：将步骤s2的质粒转化克隆宿主菌，进行原核表达培养；
s4诱导表达：从步骤s3中的宿主菌中提取质粒转化表达宿主菌，待宿主菌培养至对数期时加入诱导剂进行诱导；
s5纯化目的蛋白：收集培养液，超声破碎菌体，离心收集上清液，采用strep-tactinxt纯化柱对上清液进行纯化。
优选地，所述步骤s1四个组成部分的核苷酸片段序列如seqidno:2所示。
优选地，所述步骤s2构建的表达质粒载体的序列如seqidno:3所示。
优选地，所述步骤s4诱导剂进行诱导的温度为25～37℃。更优选地，所述诱导的温度为25℃。本发明人针对诱导进行了优化实验，实验结果表明在25℃进行诱导，其表达的蛋白含量最高。
优选地，所述步骤s5纯化使用的洗脱液为：100mmtris-hcl，150mmnacl，1mmedta，50mmbiotin，ph8.0。
本发明还提供了所述基于zzdomain与过氧化物酶apex2的二抗在免疫检测中的应用。
本发明的有益效果为：本发明通过zzdomain和过氧化物酶apex2的融合表达，分别取代传统hrp耦连二抗的免疫球蛋白和hrp部分，构建一种新型二抗，该抗体的分子较小，容易进出细胞，不易形成包涵体，且经过优化所述抗体具有较强的稳定性，不易降解。本发明的制备方法摆脱了传统hrp耦连二抗制备需要从植物提取hrp的复杂过程，也避免了实验动物的大量使用。
附图说明
附图1为重组蛋白zz-apex2的结构示意图，其中包含streptag、zzdomain、ggggslinker和apex2四个组成部分。
附图2为zz-apex2重组蛋白的表达优化结果示意图。(a)所述重组蛋白在原核表达情况示意图(上图)和用streptag标签抗体进行westernblotting检测结果示意图(下图)；(b)表达温度的优化测试：sup为离心后的上清，表示可溶蛋白，pre是离心后的沉淀，表示不溶的包涵体蛋白。
附图3为zz-apex2的纯化和浓度测定结果示意图。(a)经过6倍柱床体积的洗涤可以获得纯度较高的蛋白。lysate和flowthrough分别是上柱前后的流穿；w3-w6分别是不同洗涤次数的流穿；e1-e3分别是0.6、1.6、0.8倍柱床体积的bufferbxt(100mmtris-hcl，150mmnacl，1mmedta，50mmbiotin，ph8.0)洗脱的蛋白液。(b)以bsa为标准品，通过sds-page测定zz-apex2的浓度。marker按分子量从大到小分别为170kda、130kda、100kda、70kda、55kda、40kda、35kda、25kda、15kda。
附图4为过氧化物酶活性检测和westernblotting结果示意图。(a)3ngzz-apex2和ecl发光液混合后滴在纸片上进行化学发光检测，结果显示zz-apex2具有催化ecl底物发光的良好特性。(b)鼠源抗gapdhigg孵育nc膜后剪成三份，分别为孵育羊抗鼠igg-hrp二抗(1μg/ml)、终浓度分别为1μg/ml和2μg/ml的zz-apex2，然后进行常规ecl检测。zz-apex2实验组孵育后用pbs漂洗2次，每次1分钟；羊抗鼠igg-hrp二抗用pbst(含0.5％tween20)漂洗4次，每次10分钟。结果显示，zz-apex2可以有效的结合鼠源igg，并催化发光反应，而且无需常规步骤里的多次重复的剧烈漂洗过程(加入去污剂)，节约试剂成本和时间。
附图5为zz-apex2稳定性测定结果示意图。
附图6为愈创木酚比色法测定zz-apex2的过氧化氢酶活性示意图。(a、b)愈创木酚氧化的动力学曲线，愈创木酚浓度分别为1mm(a)和2mm(b)；(c)酶促动力学的lineweaver-burk作图；(d)酶促反应的转化数(kcat)示意图。
具体实施方式
为了更加简洁明了地展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例和附图详细说明本发明的技术方案。
实施例1构建zz-apex2蛋白
1.质粒构建、蛋白表达和纯化
1.1材料
原核表达载体prseta、大肠杆菌菌株ecoli.dh5α、表达菌bl21、高效无缝克隆试剂盒(莫纳生物，mc40101)、质粒提取试剂盒(omega)、strep-tactinxtstarterkit(iba)。其他试剂：lb培养基、氨苄青霉素、异丙基硫代-β-d-半乳糖苷(iptg)、pbs缓冲液(ph＝7.4)、甘油。
1.2表达质粒的构建
重组蛋白zz-apex2的结构如图1所示，其包含streptag、zzdomain、ggggslinker和apex2四个组成部分，其氨基酸序列如seqno：1所示，核苷酸序列如seqno：2所示。基因序列通过化学合成，然后通过同源重组的方式连在prseta载体上，并转化大肠杆菌ecoli.dh5α。prseta使用的酶切位点为xbai和ecori。克隆引物为5’-ccacaacggtttccctaataattttgtttaactttaag-3’和5’-gccggatcaagcttcgttaggcatcagcaaacccaag-3’，其prseta原核表达载体序列如seqno：3所示。
1.3重组蛋白原核表达和条件优化
(1)表达：从ecoli.dh5α中提取质粒，转化表达宿主菌bl21，隔夜培养后挑取菌斑于1ml添加了氨苄青霉素(100μg/ml)的lb培养基中，37℃震荡培养。菌液加入等量50％甘油，-80℃保存菌种。菌种按1：1000接种于1ml新鲜培养基，37℃培养过夜，次日按1：100接种于100ml的新鲜培养基。以220rpm转速在37℃培养约4h，当od600达0.3-0.4时，加入终浓度为0.1mm的iptg，继续培养3h后，4500×g离心收取细菌，并进行sds-page(图2a，上图)和westernblotting检测(图2a，下图)。
(2)表达温度优化：菌种按(1)活化后，次日按1：100接种于100ml的新鲜培养基。以220rpm转速在37℃培养约4h，当od600达0.3-0.4时，加入终浓度为0.1mm的iptg，将菌液分成3份，分别在25℃、30℃、37℃诱导表达3h(图2b)，结果发现诱导表达温度为25℃时，其表达量最高，包涵体蛋白含量最低。
1.4蛋白大量表达和纯化
(1)大量表达：菌种按1：1000接种于10ml新鲜培养基，37℃培养过夜，次日按1：100接种于1l的新鲜培养基。以220rpm转速在37℃培养约4h，当od600达0.3-0.4时，将菌液降温至25℃，加入终浓度为0.1mm的iptg，继续培养3h后，4500×g离心收取细菌。
(2)蛋白纯化：菌体先用pbs漂洗一次，再用bufferw(100mmtris-hcl，150mmnacl，1mmedta，ph8.0)重悬，1l菌液收集的菌体用10mlbufferw重悬，补加终浓度为1mm的pmsf。超声破碎菌体，功率为70％，总破碎时间30min，工作时破碎10s，休息5s，破碎在4℃水浴进行，菌液呈现透亮即表明菌体已经破碎。菌液用15000×g离心20min后取上清，上清接种用0.22μm滤器进行过滤。strep-tactinxt纯化柱先用2倍柱床体积的bufferw进行平衡，然后将上清上柱，接着用6倍柱床体积的bufferw洗涤柱床，最后分别用0.6、1.6、0.8倍柱床体积的bufferbxt(100mmtris-hcl，150mmnacl，1mmedta，50mmbiotin，ph8.0)洗脱蛋白。用sds-page测定zz-apex2的浓度，结果如图3所示。蛋白溶液用超滤离心柱进行浓缩并把buffer置换成pbs(含50％甘油)，-20℃保存，获得本发明的过氧化物酶zz-apex2二抗。
实施例2过氧化物酶zz-apex2westernblotting应用及其活性检测
1、过氧化物酶zz-apex2westernblotting应用
将3ngzz-apex2蛋白和20μlecl发光液混合，取5μl混合液滴在纸片上，用化学发光仪进行信号检测(biorad)。结果如图4a可以看出，本发明的过氧化物酶zz-apex2二抗能够清楚的检测到发光点，说明本发明zz-apex2二抗具备过氧化物酶的底物催化功能。
取6μg总蛋白(肠癌细胞hct116裂解液)进行sds-page，并将蛋白转移到nc膜上，5％bsa室温孵育1h，pbst(含0.5％tween-20)漂洗4次，每次5min。将鼠源抗gapdhigg孵育nc膜后剪成三份，分别孵育羊抗鼠igg-hrp二抗、终浓度为1μg/ml和2μg/ml的zz-apex2，室温孵育1h，然后进行常规ecl检测。孵育羊抗鼠igg-hrp的nc膜用pbst(含0.5％tween-20)漂洗4次，每次5min；孵育zz-apex2的nc膜用pbs漂洗2次，每次1min。结果如图4b所示，zz-apex2可以有效的结合鼠源igg，并催化发光反应，而且无需常规步骤里的多次重复的剧烈漂洗过程(加入去污剂)，节约试剂成本和时间。
2、稳定性检测
为了检测本发明zz-apex2的过氧化氢酶的稳定，将实施例1制备的蛋白溶液置于室温保存48h以及在-20℃保存2个月后，然后进行化学发光实验。结果由图5可知，本发明的过氧化物酶zz-apex2分别在室温保存48h与-20℃保存2个月后均显示出了发光点，说明本发明的zz-apex2具有较强的稳定性，可长时间保持催化活力。
3、过氧化氢酶活性的测定
(1)愈创木酚比色法的反应体系：
取100μl置于96孔板，在470nm下每分钟测一次od值。
(2)采用双倒数法做图，得到km和vmax值，并根据公式kcat＝vmax/[e]total计算转换数。结果由图6a、6b可知，在相同浓度的底物(愈创木酚)和相同摩尔数的酶条件下，与rab-hrp和mou-hrp相比，本发明的zz-apex2催化产生更多的有色底物。此外，由图6c、6d可知，与rab-hrp和mou-hrp相比，本发明的zz-apex2具有更大的kcat(s-1)值，说明其具有更强的催化能力。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
1.一种基于zzdomain与过氧化物酶apex2的二抗，其特征在于，由streptag、zzdomain、ggggslinker和apex2四个部分组成。
2.如权利要求1所述的二抗，其特征在于，所述zzdomain用于结合igg抗体，所述apex2行使报告基团的功能，所述二抗的氨基酸序列如seqno：1所示。
3.如权利要求2所述的二抗，其特征在于，所述编辑如seqno：1所示的氨基酸序列的核苷酸序列如seqno：2。
4.一种制备如权利要求1所述的二抗的方法，其特征在于，包括以下步骤：
s1获得四个部分的基因片段：通过化学合成的方式合成streptag、zzdomain、ggggslinker和apex2四个组成部分的核苷酸片段；
s2构建表达质粒：将s1的片段通过同源重组的方式连在prseta载体上；
s3转化克隆：将步骤s2的质粒转化克隆宿主菌，进行原核表达培养；
s4诱导表达：从步骤s3中的宿主菌中提取质粒转化表达宿主菌，待宿主菌培养至对数期时加入诱导剂进行诱导；
s5纯化目的蛋白：收集培养液，超声破碎菌体，离心收集上清液，采用strep-tactinxt纯化柱对上清液进行纯化。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤s1四个组成部分的核苷酸片段序列如seqidno:2所示。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤s2构建的表达质粒载体的序列如seqidno:3所示。
7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤s4诱导剂进行诱导的温度为25～37℃。
8.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述诱导的温度为25℃。
9.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤s5纯化使用的洗脱液为：100mmtris-hcl，150mmnacl，1mmedta，50mmbiotin，ph8.0。
10.如权利要求1所述的基于zzdomain与过氧化物酶apex2的二抗在免疫检测中的应用。
技术总结