本发明涉及基因技术领域，具体涉及一种针对实体瘤以免疫检查点tigit和pd-1为靶点的新型car构建方法及应用。
背景技术：
肿瘤一直以来严重危害着人类健康，近年来，肿瘤免疫疗法发展迅速，成为肿瘤治疗领域的热点和突破口。肿瘤免疫疗法包括免疫细胞治疗、免疫检查点抑制剂、细胞因子、细胞疫苗等。其中，嵌合抗原受体t细胞（chimericantigenreceptort-cell,car-t细胞）疗法是一种新型的细胞疗法，主要通过基因工程技术人工改造肿瘤患者的t细胞，在体外大量培养后生成肿瘤特异性car-t细胞，再将其回输至患者体内用以攻击癌细胞，其靶向更精确、杀伤力更强、作用更持久。
研发人员一直在寻找新一代免疫检查点抑制剂与pd-1/pd-l1的联合，提高肿瘤免疫治疗的效果。t细胞免疫球蛋白和itim结构域蛋白（tigit）作为新发现的免疫抑制性分子，成为了癌症免疫疗法研发领域的热点之一。tigit是一种抑制性受体，与抗原呈递细胞或肿瘤细胞上表达的pvr（d155）相互作用可抑制t细胞的激活。tigit在多种癌症类型的肿瘤浸润t细胞中高度表达。阻断人tigit的单克隆抗体已经被开发出来，作为单一治疗或联合抗pd-1/pd-l1单克隆抗体用于治疗晚期实体恶性肿瘤患者。最新研究表明，阻断免疫抑制点除了能够促进t细胞活化、调节肿瘤微环境，还可以提高记忆t细胞的生成数目，产生更多的效应t细胞。因而，同时阻断tigit和pd-1免疫检查点信号通路，可协同激活t细胞，增强抗肿瘤活性，达到更好的杀伤肿瘤的效果。
现有实体瘤免疫细胞治疗指数的技术有将检查点抑制剂（pd-1、ctla-4和lag-3）与car-t细胞联合治疗，以改善肿瘤微环境及提高car-t细胞的杀伤效果。此外还有免疫细胞治疗联合手术、放化疗治疗实体瘤，研究表明是安全和可行的。已公开的一种新型的同时阻断免疫检查点pd-l1和tigit的复制型溶瘤腺病毒和应用（cn201910462985.2），使用溶瘤腺病毒其调控机制较为单一，无法有效应对标志物丢失、存在肿瘤微环境影响和易脱靶效应等问题。以pd-1胞外区为单靶点的car-t（cn201610226230.9），具有一定的杀伤效果，但是单纯阻断效应淋巴细胞的pd-1通路，治疗肿瘤效果不佳。尚未发现将tigit应用于car的相关报道。
现有肿瘤免疫技术多采用抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体和ctla-4抗体治疗肿瘤，但这类药物在抗检查点药物治疗的同时，还包括tigit在内的其他抑制蛋白存在，长期服用抗体药副作用比较大，易出现耐药性，抗肿瘤效果不显著。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明提供一种以tigit和pd-1为靶点的嵌合抗原受体、car-t细胞及其制备方法，通过协同作用增强t细胞的活化，提高car-t与肿瘤细胞的结合效率，更大程度解决肿瘤免疫逃逸引发的复发和转移的问题，提高对靶细胞的杀伤活性。
为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：
一种以tigit和pd-1为靶点的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体，包括tigit胞外区和pd-1胞外区。
以下是对上述技术方案的进一步改进:
所述tigit胞外区的核酸人工序列如seqidno.2所示；所述pd-1胞外区的核酸人工序列如seqidno.4所示。
所述嵌合抗原受体，包括cd8导引子、tigit胞外区、pd-1胞外区、cd8hinge区、
cd8跨膜区、41bb共刺激区、cd3ζ信号传导区。
一种car-t细胞，所述car-t细胞包含如权利要求1所述的嵌合抗原受体。
所述car-t细胞采用如下方法制备得到：将包含上述嵌合抗原受体的基因片段的慢病毒表达质粒进行慢病毒包装，然后利用重组慢病毒感染t细胞。
所述t细胞为tigit和pd-1双基因敲除的t细胞。
所述t细胞，tigit的基因敲除率大于75%，pd-1的基因敲除率大于75%。
所述tigit和pd-1双基因敲除的t细胞的制备，包括crispr/cas9敲除tigit和pd-1表达载体的构建、电转染t细胞；
所述crispr/cas9敲除tigit和pd-1表达载体的构建，将tigitsgrna核酸序列和pd-1sgrna核酸序列分别插入标准载体，连接至crispr/cas9表达载体，分别得到crispr/cas9敲除tigit载体和crispr/cas9敲除pd-1载体。
所述tigitsgrna核酸序列为ccagtcgctgaccgtgaacgata；所述pd-1sgrna核酸序列为acatgagcgtggtcagggcc。
本发明以最新的肿瘤免疫治疗方法-car-t技术为基础，将tigit和pd-1细胞外域联合一起作为car的细胞外域，与cd3zeta作为刺激信号域，提供一种新的抗肿瘤免疫治疗策略。通过协同作用增强t细胞的活化，提高car-t与肿瘤细胞的结合效率，更大程度解决肿瘤免疫逃逸引发的复发和转移的问题。除此之外，本发明还通过基因编辑技术（crispr/cas9）敲除t细胞表面相应免疫抑制因子（tigit和pd-1）以抑制其表达，切断免疫检查点信号通路，提高car-t细胞的活性，使car-t细胞在实体肿瘤治疗中更有效。
与现有技术相比，本发明取得以下有益效果：
（1）本发明的以免疫检查点tigit和pd-1为靶点的嵌合抗原受体制备的car-t细胞，
能够促进car-t细胞的增殖，提高car-t细胞的杀伤能力，避免肿瘤细胞发生免疫逃逸，提高car-t细胞治疗的有效性。
本发明的以免疫检查点tigit和pd-1为靶点的嵌合抗原受体制备的car-t细胞与表达pvr和pd-l1基因的阳性细胞（即靶细胞）共培养48h时，用elisa方法分别检测效应细胞il-2、tnf-α和ifn-γ的分泌量，il-2分泌量为4500pg/ml，tnf-α的分泌量为3900pg/ml，ifn-γ的分泌量为4320pg/ml。
实验组a（anti-tigit-pd-1-car-t细胞和靶细胞共培养）的il-2分泌量是实验组b（anti-tigit-car-t细胞和靶细胞共培养）的3倍，tnf-α分泌量是实验组b的3.25倍，ifn–r分泌量是实验组b的3.9倍；实验组a的il-2分泌量是实验组c（anti-pd-1-car-t细胞和靶细胞共培养）的2.5倍，tnf-α分泌量是实验组c的2.9倍，ifn–r分泌量是实验组c的3倍。
（2）本发明制备的anti-tigit-pd-1-car-t细胞增殖能力最强，杀伤靶细胞的效果最显著，杀伤能力是单靶点anti-tigit-car或anti-pd-1-car的3倍左右，是对照组的4倍左右。
本发明的以免疫检查点tigit和pd-1为靶点的嵌合抗原受体制备的car-t细胞，对表达pvr和pd-l1基因的阳性细胞（靶细胞）的杀伤活性为98.5%。
附图说明
图1anti-tigit-pd-1-car表达载体结构示意图。
图2px330a-tigit表达载体结构示意图。
图3px330a--pd-1表达载体结构示意图。
图4流式细胞术检测anti-tigit-pd-1-car载体在t细胞表面的表达效率图。
图5流式细胞术检测anti-tigit-car载体在t细胞表面的表达效率图。
图6流式细胞术检测anti-pd-1-car载体在t细胞表面的表达效率图。
图7不同car-t细胞il-2、tnf-α和ifn-γ因子分泌量比较图。
图8不同car-t细胞杀伤活性比较图。
具体实施方式
实施例1tigit和pd-1双靶点car表达载体的构建
anti-tigit-pd-1-car模块示意图1。anti-tigit-pd-1-car载体各模块核酸序列如下：
（1）cd8导引子leader核酸人工序列(seqidno.1)
（2）tigit胞外区的核酸人工序列(seqidno.2)
（3）linker核酸人工序列(seqidno.3)
（4）pd-1胞外区的核酸人工序列(seqidno.4)
（5）cd8hinge区(cd8α)核酸人工序列(seqidno.5)
（6）cd8跨膜区(cd8tm)核酸人工序列(seqidno.6)
（7）41bb共刺激区核酸人工序列(seqidno.7)
（8）cd3ζ信号传导区核酸人工序列(seqidno.8)
（9）plent-c-gfp载体(seqidno.9)。
依次将seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7、seqidno.8序列委托生工生物工程(上海)有限公司合成其整个表达框并插入标准载体puc57载体上，得到puc-tigit-pd-1-car。将puc-tigit-pd-1-car和plent-c-gfp（seqidno.9）载体进行fastdigestasisi(购自thermofisher公司)和fastdigestnoti(购自thermofisher公司)双酶切后，16℃进行过夜连接形成plent-tigit-pd-1-car双靶点表达载体。将上述plent-tigit-pd-1-car转化到e.coli(dh5α)。提取质粒并委托生工生物工程(上海)有限公司进行测序，测序正确后该质粒命名为anti-tigit-pd-1-car。
anti-tigit-car和anti-pd-1-car单靶点载体构建步骤同上述anti-tigit-pd-1-car，最终得到测序正确的anti-tigit-car和anti-pd-1-car表达载体。
实施例2tigit和pd-1双基因敲除t细胞的制备
1、crispr/cas9敲除tigit和pd-1表达载体的构建
根据网站http://chopchop.cbu.uib.no/设计sgrna（见下表1），并从tigit基因(seqidno.10)中筛选脱靶位点少、特异性强的sgrna片段(tigitsgrna)，从pd-1基因(seqidno.11)中筛选出sgrna片段(pd-1sgrna)。
表1
将筛选得到的tigitsgrna核酸序列和pd-1sgrna核酸序列委托生工生物工程(上海)有限公司合成并分别插入标准载体连接至crispr/cas9表达载体px330a（购自上海遐永医药科技有限公司，seqidno.12）的bbsi酶切位点，分别得到px330a-tigit载体和px330a-pd-1载体（见图2和3）。
、t细胞的制备
取50ml患者自体外周血，用tbd样本密度分离液(购自天津灏洋华科生物)，分离获得pmbc。用含有1000iu/ml重组干扰素α2a(购自沈阳三生制药)的100mldmem培养基(购自corning公司，88-551-cm)诱导培养24小时后，加入1000iu/ml的重组il-2(购自沈阳三生制药)、50ng/ml的okt-3和5%的患者自体血浆诱导继续培养24小时。每隔两天倍比加液（培养至第4天加100mldmem培养基，第7天加200mldmem培养基，第10天加400mldmem培养基，第13天加800mldmem培养基），培养至第16天，流式细胞术检测t细胞中的cd3 、cd56 的阳性表达率(cd3-fitc，cd16/cd56-pe抗体购自beckman公司，a07735)。cd3 阳性率>80%，cd3 cd56 双阳性率>20%，视为t细胞诱导成功。
、px330a-tigit载体和px330a-pd-1载体共同电转染t细胞
(1)清洗电转杯，将电转杯置于75%酒精中浸泡2h，然后在紫外灯下照射15min。
(2)取1×107个上述诱导的t细胞，加入500μl电转缓冲液重悬细胞，并上下吹打均匀。
(3)细胞悬液中分别加入px330a-tigit载体（5ug）和px330a-pd-1载体质粒（5ug），上下吹打均匀，并转入相应规格的电转杯中（0.2cm），按照预定条件设置参数：300v，10ms，进行2次电击操作。
(4)电击完成后，将电转杯置于冰上孵育10min，以使核酸充分进入细胞。
(5)将电击杯从冰上取出，将细胞从电转杯中转移出来，过滤后计数，按照一定的细胞密度（3×106/ml）接种于新鲜的dmem培养基中，置于37℃、5％co2培养箱培养。
(6)培养48h-72h后，即可进行细胞电转效率的检测。
流式细胞技术检测电转染前的t细胞tigit和pd-1表达率分别为38%和42%，转染后表达率为8%和9.2%，电转染效率计算公式为：（电转染前基因表达率-电转染后基因表达率）/电转染前基因表达率*100%，tigit电转染效率=（38%-8%）/38%*100%=78.9%，pd-1电转染效率=（42%-9.2%）/42%*100%=78.1%，即本发明构建的tigit和pd-1双基因敲除的效率为78%左右，能够满足后续实验需求，视为成功获得tigit和pd-1双基因敲除的t细胞。
电转效率即基因敲除率。
实施例3慢病毒包装及滴度检测
将慢病毒包装细胞系293t接种于含有dmem 10
