本发明涉及分子生物学、病毒学、免疫学和医学领域。本发明提供了一种组合物，其包含：病毒样颗粒qβ(vlp)和一种gnrh-i6重复多肽蛋白，其中qβ(vlp)和gnrh-i6重复多肽蛋白彼此连接形成gnrh-i6-qβ病毒样颗粒。
背景技术：
1971年,baba等耶amoss等分别在猪和绵羊的下丘脑中发现gnrh-i并确定其分子结构,由于其具有促进垂体释放促黄体素(luteinizinghormone,lh)的功,因此被命名为促黄体激素释放激素(luteinizinghormonereleasinghormone,lhrh)。后来研究发现这种激素也能促进垂体释放促卵泡素(fouiclestimulatehormone,fsh),所以又称为促卵泡激素释放激素(folliclestimuatinghormone-releasinghormone,fshrh)。人们总称为促性腺激素择放激素(gonadotropinreleasinghormonei,gnrh-i)。
自20世纪70年代发现gnrh-i并确定其分子结构来,至今己发现gnrh-i家族至少有24个家族,而且gnrh-i的氨基酸序列在所有哺乳动物间高度保守。其氨基酸序列为焦谷氨酸(pglu)—组氨酸(his)—色氨酸(trp)—丝氨酸(ser)—酪氨酸(tyr)—甘氨酸(gly)—亮氨酸(leu)—精氨酸(arg)—脯氨酸(pro)—甘酰胺(gly-nh2),分子量为1.181kdw。
生理剂量的gnrh-i可促使促性腺激素浓度升高(如fsh轻度升島和lh明显升高),促进性腺激素(如雌二醇、孕酮及睾酮等)的合成分泌,促使卵泡发育成熟而排卵或睾丸发育和精子成熟,发生并维持第二性征。另外,gnrh-i还可以直接影响性腺,调节性腺类固醇激素的合成分泌,促进配子形成，已经报道了针对源自gnrh的抗原的免疫。
自身抗原蛋白通常难以诱导针对自身抗原的抗体应答。提高疫苗接种效率的一种方法是提高所应用抗原的重复性。与分离的蛋白质不同，病毒在没有任何佐剂的情况下及在有和没有t细胞帮助的情况下都能诱导迅速有效的免疫反应(bachmann和zinkernagel，ann.rev.immunol：15：235-270(1991))。与少数几种蛋白质相比，它们能够触发比其分离成分强得多的免疫反应。对于b细胞反应，众所周知，病毒免疫原性的一个关键因素是表面表位的重复性和顺序。许多病毒表现出准晶体表面，该表面具有规则排列的表位，可以有效地交联b细胞上的表位特异性免疫球蛋白(bachxnann和zinkernagel，immunol。today17：553-558(1996))。b细胞表面免疫球蛋白的这种交联是一个强激活信号，直接诱导细胞周期进程和igm的产生抗体。此外，这种触发的b细胞能够激活t辅助细胞，进而诱导b细胞中igm抗体向igg抗体的转换以及任何疫苗接种的长寿b细胞记忆目标的产生。(zinkernagel，ann.rev.immunol.15：235-270(1997))。病毒结构甚至与自身免疫性疾病中抗抗体的产生有关，并且是对病原体的自然应答的一部分(参见fehr，t.，等人，j.exp.med.185：1785-1792(1997))。因此，由高度组织化的病毒表面呈递的抗原能够诱导针对抗原的强抗体应答。
cvlp通过基因融合表达或以vlp为载体通过化学偶联的方法将外源抗原与其偶联制备而成，后一种方法制备的重组vlp也常被称作偶联vlp。
融合表达的方法如下，在制备无包膜vlp的基础上，将外源抗原dna与具有自我组装能力的多肽基因融合，进一步制备无包膜cvlp；类似于有包膜vlp的制备方法，将不同种(型)的病毒蛋白或嵌合蛋白组合，形成cvlp(包膜型或无包膜型)。但是嵌合疫苗产量比较低，生产成本比较高，且在大规模生产时，易导致产品结构和组分上不相容，限制了其在疫苗中的发展。
从金黄色葡萄球菌中分离得到转肽酶sortasea，它能够选择性识别特异性多肽序列lpxtg，并在特定位点切断氨基酸的肽键，进而将其与一个新的肽链连接，在体外将抗原与预装配的vlp相连。其优势在于靶抗原的大小和结构不受vlp单体折叠和颗粒组装等条件的限制，可以在vlp表面展示短线性肽、肽环和全长蛋白，甚至多糖和半抗原等非蛋白形式的抗原。瑞士cytos生物制药公司将尼古丁共价偶联与噬菌体qβ(vlp)表面，制备戒烟疫苗，ⅰ/ⅱ期临床评估结果表明，尼古丁-qβ病毒样颗粒可以诱导高滴度尼古丁特异性抗体。并且单独的病毒样颗粒可以在大肠杆菌中稳定表达，提高了产量的同时降低了成本。
技术实现要素：
本发明针对现有技术存在的不足，提供一种gnrh-i6病毒样颗粒亚单位疫苗，易于通过菌体培养获得，连接效率高，无his等标签，表达产量高，便于工业化生产,免疫原性强、免疫反应快。
本发明第一方面提供一种重组大肠杆菌表达的gnrh-i-ap205蛋白，将gnrh-i6重复多肽与qβ病毒样颗粒经sortasea酶催化形成一种重组蛋白gnrh-i6-qβ；所述重组蛋白gnrh-i6-qβ氨基酸序列为seqidno.1。
本发明第二方面提供一种重组质粒his-mbp-tev-gnrh-i6-petm41，该重组质粒his-mbp-tev-gnrh-i6-petm41是将seqidno.2所示的核苷酸通过同源重组方法克隆入原核表达载体petm41的ncoi位点和bamhi位点所得。
本发明第三方面提供一种重组质粒his-tev-qβ-pet28a，该重组质粒his-tev-qβ-pet28a是将seqidno.3所示的核苷酸片段克隆入原核表达载体为pet28a的ncoi和xhoi两个酶切位点间所得。
本发明第四方面提供一种重组质粒his-tevprotease-pet28a，该重组质粒his-tevprotease-pet28a是将seqidno.4所示的核苷酸片段克隆入原核表达载体为pet28a的ncoi和xhoi两个酶切位点间所得。
本发明第五方面提供一种重组质粒his-sotasea-pet28a，该重组质粒his-sotasea-pet28a是将seqidno.5所示的核苷酸片段克隆入原核表达载体为pet28a的ncoi和xhoi两个酶切位点间所得。
本发明第六方面提供一种gnrh-i6-qβ病毒样颗粒制备方法，包括如下步骤：
(1)将seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5中的基因序列合成目的基因，构建重组载体，依次分别为：
his-mbp-tev-gnrh-i6-petm41；
his-tev-qβ-pet28a；
his-tevprotease-pet28a；
his-sotasea-pet28a；
(2)将步骤(1)经序列测定正确的重组质粒转化大肠杆菌t7shuffle，分别得到重组表达菌株：
his-mbp-tev-gnrh-i6-petm41-t7shuffle；
his-tev-qβ-pet28a-t7shuffle；
his-tevprotease-pet28a-t7shuffle；
his-sotasea-pet28a-t7shuffle；
(3)分别培养步骤⑵的重组表达菌株，加入iptg进行诱导表达，收集菌体超声破碎，并经镍柱纯化，分别获得重组蛋白：
his-mbp-tev-gnrh-i6重组蛋白；
his-tev-qβ病毒样颗粒；
his-tev酶；
his-sotasea酶；
(4)将步骤⑶中的his-mbp-tev-gnrh-i6重组蛋白及his-tev-qβ病毒样颗粒均由pbs溶液溶解，分别加入所述的his-tev酶进行酶切，按照10ughis-tev酶酶切1mg重组蛋白的比例进行酶切，30摄氏度震荡酶切3h，然后将酶切液分别过镍柱，穿透液分别为gnrh-i6重组蛋白及qβ病毒样颗粒，分别用3k浓缩管进行浓缩；
(5)将步骤⑷中的his-mbp-tev-gnrh-i6重组蛋白及his-tev-qβ病毒样颗粒分别用pbs配制成1mg/ml，按照1：1进行混合，加入将步骤⑶中的his-sotasea酶，按照100ug催化2mg混合蛋白的比例进行37℃震荡催化5h，然后将催化液过镍柱，穿透液为gnrh-i6-qβ病毒样颗粒，用3k浓缩管进行浓缩。
进一步的，将重组表达菌株培养至od600达0.6-0.8时加入终浓度为1mm的iptg进行诱导表达12h，然后收集菌体用10mmpbs混匀菌体进行超声破碎，然后使用镍柱进行纯化，25mm咪唑洗杂10个柱体积，250mm咪唑洗脱目的蛋白。
本发明第七方面提供一种亚单位疫苗，包含第六方面所制备的gnrh-i6-qβ病毒样颗粒及弗斯佐剂，该亚单位疫苗用于生产疫苗。
本发明通过构建qβ病毒样颗粒的大肠杆菌重组表达菌株，成功的获得了一种易于通过菌体培养获得，适合工业化生产，且加了his标签便于纯化qβ病毒样颗粒，降低了成本。
本发明通过tev酶切掉his标签，即可得到无标签的qβ病毒样颗粒。操作简单，效率高适合精细化疫苗生产。
本发明通过tev酶切掉his-mbp标签，即可得到无标签的gnrh-i6重组蛋白。操作简单，效率高适合精细化疫苗生产
本发明中，qβ来源于一种侵染大肠杆菌的噬菌体，为噬菌体衣壳蛋白具有自组装成纳米颗粒的功能，不具有感染性，具有强烈抗原免疫性，且是申请人的vlp筛选平台独有的技术；通过与qβ病毒样颗粒欧联的抗原，显示出高强度的抗原性，可以在小鼠、大鼠、猫、狗和马中诱导高水平的特异性抗体，体液免疫反应快；本发明qβ病毒样颗粒可由大肠杆菌大量表达，生产工艺简单，qβ病毒样颗粒纯度高；本发明的gnrh-i6重组蛋白可由大肠杆菌大量可溶性表达，生产工艺简单，gnrh-i6重组蛋白纯度高；本发明qβ病毒样颗粒与gnrh-i6蛋白体外连接，条件便于控制，连接效率高，易于操作，便于工业化生产；本发明选择的大肠杆菌重组表达菌株具有生长快、易于培养、遗传操作简单、繁殖速度快，对培养条件要求低，培养基廉价，能进行高密度培养，且能耐受较高的液体静压，便于工业化生产等特点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
图1为本发明实施例中提供的gnrh-i6基因与petm41质粒连接后重组质粒示意图；
图2为本发明实施例中提供的qβ基因与pet28a质粒连接后重组质粒示意图；
图3为本发明实施例中提供的tevprotease基因与pet28a质粒连接后重组质粒示意图；
图4为本发明实施例中提供的sortasea基因与pet28a质粒连接后重组质粒示意图；
图5为本发明实施例中提供的gnrh-i6蛋白sds-page跑胶示意图；
图6为本发明实施例中提供的qβ病毒样颗粒蛋白sds-page跑胶示意图；
图7为本发明实施例中提供的his-tev酶蛋白sds-page跑胶示意图；
图8为本发明实施例中提供的his-sortasea蛋白sds-page跑胶示意图；
图9为本发明实施例中提供的gnrh-i6蛋白与qβ病毒样颗粒经his-sortasea催化1h后的结果sds-page跑胶示意图；
图10为本发明实施例中提供的gnrh-i6蛋白与qβ病毒样颗粒经his-sortasea催化5h后的结果sds-page跑胶示意图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明实施例中所采用的酶切、同源重组连接等分子生物学实验方法可参考《分子克隆》第二版。制备本发明gnrh-i6-qβ病毒样颗粒的基础材料包括：qβ蛋白核苷酸序列、gnrh-i6核苷酸序列、tevprotease核苷酸序列、sorteasea核苷酸序列、pet28a质粒、petm41质粒、t7shuffle大肠杆菌菌株、天根质粒小提中量试剂盒、lb培养基、iptg、卡那霉素、镍柱和咪唑等。将核苷酸序列发到华大基因公司合成his-tev-qβ重组质粒、his-mbp-tev-gnrh-i6-pmet41重组质粒、his-tevprotease-pet28a重组质粒、his-sorteasea-pet28a重组质粒。
实施例1
提供一种his-tev-qβ病毒样颗粒制备方法,该his-tev-qβ病毒样颗粒制备方法，包括以下步骤：
(1)重组质粒的构建：将his标签、tev酶切位点及qβ基因直接让华大基因公司合成到pet28a载体ncoi酶切位点及xhoi酶切位点得到重组质粒his-tev-qβ-pet28a；
(2)重组质粒转入表达菌株：将所述his-tev-qβ-pet28a重组质粒转入大肠杆菌t7shuffle表达菌株，得到his-tev-qβ-pet28a-t7shuffle重组表达菌株；
(3)菌体培养及qβ病毒样颗粒纯化：培养所述his-tev-qβ-pet28a-t7shuffle重组表达菌株，iptg诱导表达获得his-tev-qβ病毒样颗粒。
具体的，his-tev-qβ病毒样颗粒表达纯化步骤如下：
(a1)his-tev-qβ-pet28a重组质粒制备
将含有质粒的甘油菌用移液枪吸取5ul接种到5ml的2yt培养基(含50ug/ml卡那霉素)，37℃震荡培养14-16小时，培养后取1ml菌液送测序。剩余菌液用质粒小提取试剂盒提取质粒，蛋白核酸检测仪检测核酸浓度。
(a2)his-tev-qβ病毒样颗粒表达
转化t7shuffle表达菌株，摇菌后离心浓缩，涂布卡那霉素抗性平板，37℃过夜培养，刮取菌落，接种10ml含氨苄青霉素的2×yt培养基，37℃180r摇菌至菌液od值0.8左右。将其转接到500ml含氨苄青霉素的2×yt培养基中，37℃180r摇菌至菌液od值0.8左右。加入终浓度为0.8mmiptg诱导剂，30℃过夜表达。第三天4500rpm，15min离心收集菌体。超声破碎菌体45min，3s开，4s关，功率125w。超声结束后，9500rpm，20min，4℃收集上清液；
(a3)his-tev-qβ病毒样颗粒纯化
离心上清液，过镍柱纯化，镍柱pbs平衡5柱体积。上样，pbs洗杂5柱体积，25mm咪唑洗2柱体积，后再用25mm咪唑洗5柱体积。之后连续用50、100、150、200、250mm咪唑洗脱5柱体积。收集从上样到500mm咪唑的流出液。
从各收集液中吸取10ul加入10ul2×蛋白电泳loadingbuffer后100℃加热4min。之后蛋白电泳，染色观察目的条带所在收集液浓度。将目的蛋白使用3kda超滤管进行超滤，置换成pbs溶剂。
实施例2
参见图1和图5，提供一种his-mbp-tev-gnrh-i6重组蛋白制备方法，该his-mbp-tev-gnrh-i6重组蛋白制备方法，包括以下步骤：
(1)重组质粒的构建：将tev酶切位点及gnrh-i6基因直接让华大基因公司合成到petm41载体ncoi酶切位点及xhoi酶切位点得到重组质粒his-mbp-tev-gnrh-i6-petm41；
(2)重组质粒转入表达菌株：将所述his-mbp-tev-gnrh-i6-petm41重组质粒转入大肠杆菌t7shuffle表达菌株，得到his-mbp-tev-gnrh-i6-petm41-t7shuffle重组表达菌株；
(3)菌体培养及his-mbp-tev-gnrh-i6重组蛋白纯化：培养所述his-mbp-tev-gnrh-i6-petm41-t7shuffle重组表达菌株，iptg诱导表达获得his-mbp-tev-gnrh-i6重组蛋白。
具体的his-mbp-tev-gnrh-i6重组蛋白表达纯化步骤如下：
(b1)his-mbp-tev-gnrh-i6-petm41重组质粒制备
将含有质粒的甘油菌用移液枪吸取5ul接种到5ml的2yt培养基(含50ug/ml卡那霉素)，37℃震荡培养14-16小时，培养后取1ml菌液送测序。剩余菌液用质粒小提取试剂盒提取质粒，蛋白核酸检测仪检测核酸浓度。
(b2)his-mbp-tev-gnrh-i6重组蛋白表达
转化t7shuffle表达菌株，摇菌后离心浓缩，涂布卡那霉素抗性平板，37℃过夜培养，刮取菌落，接种10ml含卡那霉素的2×yt培养基，37℃180r摇菌至菌液od值0.8左右。将其转接到500ml含氨苄青霉素的2×yt培养基中，37℃180r摇菌至菌液od值0.8左右。加入终浓度为0.8mmiptg诱导剂，30℃过夜表达。第三天4500rpm，15min离心收集菌体。超声破碎菌体45min，3s开，4s关，功率125w。超声结束后，9500rpm，20min，4℃收集上清液。
(b3)his-mbp-tev-gnrh-i6重组蛋白纯化
离心上清液，过镍柱纯化，镍柱pbs平衡5柱体积。上样，pbs洗杂5柱体积，25mm咪唑洗2柱体积，后再用25mm咪唑洗5柱体积。之后连续用50、100、150、200、250mm咪唑洗脱5柱体积。收集从上样到500mm咪唑的流出液。
从各收集液中吸取10ul加入10ul2×蛋白电泳loadingbuffer后100℃加热4min。之后蛋白电泳，染色观察目的条带所在收集液浓度。将目的蛋白使用3kda超滤管进行超滤，置换成pbs溶剂；
实施例3
参见图2、图3、图6和图7，提供一种his-tev重组酶制备方法，该his-tev重组酶制备方法包括以下步骤：
(1)重组质粒的构建：tev酶基因直接让华大基因公司合成到pet28a载体ncoi酶切位点及xhoi酶切位点得到重组质粒his-tevprotease-pet28a；
(2)重组质粒转入表达菌株：将his-tevprotease-pet28a重组质粒转入大肠杆菌t7shuffle表达菌株，得到his-tevprotease-pet28a-t7shuffle重组表达菌株；
(3)菌体培养及his-tev重组酶纯化：培养所述his-tevprotease-pet28a-t7shuffle重组表达菌株，iptg诱导表达获得his-tev重组酶。
具体的his-tev重组酶表达纯化步骤如下：
(c1)his-tevprotease-pet28a重组质粒制备
将含有质粒的甘油菌用移液枪吸取5ul接种到5ml的2yt培养基(含50ug/ml卡那霉素)，37℃震荡培养14-16小时，培养后取1ml菌液送测序。剩余菌液用质粒小提取试剂盒提取质粒，蛋白核酸检测仪检测核酸浓度。
(c2)his-tev重组酶表达
转化t7shuffle表达菌株，摇菌后离心浓缩，涂布卡那霉素抗性平板，37℃过夜培养，刮取菌落，接种10ml含卡那霉素的2×yt培养基，37℃180r摇菌至菌液od值0.8左右。将其转接到500ml含氨苄青霉素的2×yt培养基中，37℃180r摇菌至菌液od值0.8左右。加入终浓度为0.8mmiptg诱导剂，30℃过夜表达。第三天4500rpm，15min离心收集菌体。超声破碎菌体45min，3s开，4s关，功率125w。超声结束后，9500rpm，20min，4℃收集上清液。
(c3)his-tev重组酶纯化
离心上清液，过镍柱纯化，镍柱pbs平衡5柱体积。上样，pbs洗杂5柱体积，25mm咪唑洗2柱体积，后再用25mm咪唑洗5柱体积。之后连续用50、100、150、200、250mm咪唑洗脱5柱体积。收集从上样到500mm咪唑的流出液。
从各收集液中吸取10ul加入10ul2×蛋白电泳loadingbuffer后100℃加热4min。之后蛋白电泳，染色观察目的条带所在收集液浓度。将目的蛋白使用3kda超滤管进行超滤，置换成pbs溶剂；
实施例4
参见图4和图8，提供一种his-sortasea重组酶制备方法，该his-sortasea重组酶制备方法，包括以下步骤：
(1)重组质粒的构建：sortasea酶基因直接让华大基因公司合成到pet28a载体ncoi酶切位点及xhoi酶切位点得到重组质粒his-sortasea-pet28a；
(2)重组质粒转入表达菌株：将所述his-sortasea-pet28a重组质粒转入大肠杆菌t7shuffle表达菌株，得到his-sortasea-pet28a-t7shuffle重组表达菌株；
(3)菌体培养及his-sortasea重组酶纯化：培养所述his-sortasea-pet28a-t7shuffle重组表达菌株，iptg诱导表达获得his-sortasea重组酶。
具体的his-sortasea重组酶表达纯化步骤如下：
(d1)his-sortasea-pet28a重组质粒制备
将含有质粒的甘油菌用移液枪吸取5ul接种到5ml的2yt培养基(含50ug/ml卡那霉素)，37℃震荡培养14-16小时，培养后取1ml菌液送测序。剩余菌液用质粒小提取试剂盒提取质粒，蛋白核酸检测仪检测核酸浓度。
(d2)his-sortasea重组酶表达
转化t7shuffle表达菌株，摇菌后离心浓缩，涂布卡那霉素抗性平板，37℃过夜培养，刮取菌落，接种10ml含卡那霉素的2×yt培养基，37℃180r摇菌至菌液od值0.8左右。将其转接到500ml含氨苄青霉素的2×yt培养基中，37℃180r摇菌至菌液od值0.8左右。加入终浓度为0.8mmiptg诱导剂，30℃过夜表达。第三天4500rpm，15min离心收集菌体。超声破碎菌体45min，3s开，4s关，功率125w。超声结束后，9500rpm，20min，4℃收集上清液。；
(d3)his-sortasea重组酶纯化
离心上清液，过镍柱纯化，镍柱pbs平衡5柱体积。上样，pbs洗杂5柱体积，25mm咪唑洗2柱体积，后再用25mm咪唑洗5柱体积。之后连续用50、100、150、200、250mm咪唑洗脱5柱体积。收集从上样到500mm咪唑的流出液。
从各收集液中吸取10ul加入10ul2×蛋白电泳loadingbuffer后100℃加热4min。之后蛋白电泳，染色观察目的条带所在收集液浓度。将目的蛋白使用3kda超滤管进行超滤，置换成pbs溶剂；
实施例5
提供一种qβ病毒样颗粒和gnrh-i6重组蛋白的制备方法，将实施例1的his-tev-qβ病毒样颗粒及实施例2的his-mbp-tev-gnrh-i6重组蛋白均由pbs溶液(10mm)溶解，分别加入实施例3中的his-tev重组酶进行酶切，按照10ugtev酶酶切1mg重组蛋白的比例进行酶切，30摄氏度震荡酶切3h，然后将酶切液分别过镍柱，穿透液为gnrh-i6重组蛋白及qβ病毒样颗粒，而his-tev酶及酶切不完全的重组蛋白则会挂在镍柱上，分别用3k浓缩管对穿透液即gnrh-i6重组蛋白及qβ病毒样颗粒进行浓缩。
实施例6
参见图9和图10，提供一种gnrh-i6-qβ病毒样颗粒的制备方法，将实施例5中的gnrh-i6重组蛋白及qβ病毒样颗粒分别用pbs(10mm)配制成1mg/ml，按照1：1进行混合，加入将实施例4中的his-sotasea5酶，按照100ug催化2mg混合蛋白的比例进行37℃震荡催化5h，然后将催化液过镍柱，穿透液为gnrh-i6-qβ病毒样颗粒，而his-sotasea重组酶会挂在镍柱上，用3k浓缩管用对穿透液即gnrh-i6-qβ病毒样颗粒进行浓缩。
实施例7
提供一种gnrh-i6-qβ病毒样颗粒亚单位疫苗免疫方法，如实施例6所述，将gnrh-i6-qβ病毒样颗粒与氢氧化铝佐剂混合用于免疫。在第0天，第14天，第28天，用50uggnrh-i6-qβ病毒样颗粒疫苗免疫八周大的雄性c57bv/6小鼠(每组五只小鼠)，同时设置gnrh-i6-qβ不加佐剂组、佐剂pbs阴性组、单纯qβ实验组及单纯gnrh-i6实验组。测量这些小鼠的抗gnrh-i6重组蛋白抗体滴度和睾丸激素水平。在免疫后第70天，处死小鼠并测定睾丸重量。
实施例8
小鼠抗gnrh-i6抗体滴度测定
在实验过程中的不同时间点，从免疫小鼠和对照小鼠中收集血清。抗gnrh-i6igg抗体滴定度通过elisa测定如下。用2ug/ml的gnrh-i64摄氏度包被96孔板过夜，每孔100ul，次日用1/1000pbst洗板5次，加入300ul2％bsa封闭板，37℃封闭2h，之后用1/1000pbst洗板5次，将小鼠血清按照1：500为初始两倍为梯度进行稀释，1：1000，1：2000，1：4000，1：8000，1：16000，1：32000，1：64000，1：128000，1：256000进行稀释，稀释液用2％bsa。从高稀释度到低稀释度，每孔100ul，室温振荡孵育45min。用1/1000pbst洗板5次。使用hrp标记的羊抗鼠多抗作为二抗，稀释度1：5000，稀释液用1％脱脂奶粉，每孔100ul，室温振荡孵育45min。tmb显色5-10min，2m硫酸终止，450nm波长直接读数。光密度(od)在450nmelisa读数器(bioradbenchmark)测定。使用这些数据计算得出最大od450血清稀释度。
表1显示，在用gnrh-i6-qβ病毒样颗粒未加佐剂组免疫雄性小鼠中，在第28天平均滴度达到64000，并且在第3针加强后平均滴度仍维持64000并没有大幅度提高。gnrh-i6-qβ病毒样颗粒佐剂组的平均滴度在第28天已经达到256000达到最大滴度，之后滴度始终维持在256000水平。而单纯gnrh-i6免疫组效价28天仅有16000水平，这些结果清楚地表明gnrh-i6-qβ病毒样颗粒能够诱导高抗gnrh的抗体滴度，且加了佐剂免疫效果更好。
表1
小鼠血清中的睾丸激素水平
在上述实验期间的各个时间点，从免疫小鼠和对照小鼠收集血清。使用睾丸激素-elisa(ibl，德国汉堡)测定小鼠血清中的睾丸激素水平。
表2显示在用gnrh-i6-qβ病毒样颗粒不加氢氧化铝佐剂免疫的小鼠中，在免疫后第47天平均睾丸激素水平被大大抑制(<0.5ng/ml)，在第70天水平仍低于0.5ng/ml。在gnrh-i6-qβ补充氢氧化铝免疫的小鼠中，平均睾丸激素水平在第28天下降到<0.2ng/ml。与对照组gnrh-i6 氢氧化铝免疫小鼠组中枢神经系统的激素平均水平低约30倍。这清楚地证明了诱导的抗体反应的中和活性。
表2
睾丸重量
在第70天处死小鼠，除去睾丸并称重，然后固定在4％甲醛中。
表3显示了在第70天经gnrh-i6免疫的小鼠的睾丸重量大大降低，平均降低了大于50％。与对照组相比，接受gnrh-i6-qβ病毒样颗粒和氢氧化铝佐剂的小鼠的睾丸重量减少了87％，这清楚地表明了诱导的抗体反应的中和活性。
表3
序列：
seqidno.1：
makletvtlgnigkdgkqtlvlnprgvnptngvaslsqagavpalekrvtvsvsqpsrnrknykvqvkiqnptactangscdpsvtrqayadvtfsftqystdeerafvrtelaallaspllidaidqlnpayggggslpetgggehwsyglrpgggggsehwsyglrpgggggsehwsyglrpgggggsehwsyglrpgggggsehwsyglrpgggggsehwsyglrpg*
seqidno.2：
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seqidno.3：
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seqidno.4：
catcatcatcatcatcatatgggagagagcttgttcaagggaccaagggattacaacccaattagctctaccatttgccatttgacaaacgagtctgatggacataccacatctctgtacggaatcggattcggaccttttattattaccaacaagcatctgttcagaagaaataacggtacacttctcgtgcaatctttgcatggtgtgttcaaggtcaagaatacaactacacttcaacaacatcttatcgatggaagagacatgatcatcattagaatgccaaaggatttcccaccttttcctcagaagttgaaattcagagagccacaaagagaagagagaatctgccttgtgacaaccaacttccaaactaagtctatgtctagcatggtgtcagacacttcatgcacattcccttcatctgatggtatcttctggaagcattggattcaaacaaaggatggtcaatgtggatcaccacttgtgtctacaagagatggttttatcgttggtattcattcagcttctaatttcacaaatacaaacaattacttcacaagcgtgccaaagaacttcatggagctgctcacaaatcaagaggctcaacaatgggtttctggatggagacttaatgctgattcagtgttgtggggaggtcataaggttttcatgagcaagcctgaggaaccttttcaaccagttaaggaggctacacagcttatgaatgagttggtttactctcaa
seqidno.5：
catcatcatcatcatcatatgcaggcaaaaccacagattccaaaagataaaagcaaagttgcaggttatatcgaaattccagatgcagatatcaaagaaccagtctatccaggcccggcaacccgtgaacagctgaaccgtggtgtgagctttgcagaagaaaatgaaagcctggatgatcagaacattagcattgcaggtcatacctttattgatcgtccgaattatcagtttaccaatctgaaagcagcaaaaaaaggtagcatggtttattttaaagttggtaatgaaacccgtaaatataaaatgaccagcattcgtaatgttaaaccgaccgcagttggtgttctggatgaacagaaaggtaaagataaacagctgaccctgattacctgtgatgattataatgaagaaaccggtgtttgggaaacccgtaaaatttttgttgcaaccgaagttaaa。
sequencelisting
<110>深圳赫兹生命科学技术有限公司
<120>一种gnrh-i6病毒样颗粒亚单位疫苗
<130>2021
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<170>patentinversion3.5
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<212>prt
<213>人工序列
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metalalysleugluthrvalthrleuglyasnileglylysaspgly
151015
lysglnthrleuvalleuasnproargglyvalasnprothrasngly
202530
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859095
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100105110
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180185190
trpsertyrglyleuargproglyglyglyglyglysergluhistrp
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210215220
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225230
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<213>人工序列
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<212>dna
<213>人工序列
<400>3
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<213>人工序列
<400>4
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<400>5
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1.一种重组大肠杆菌表达的gnrh-i6-qβ蛋白，其特征在于，将gnrh-i6重复多肽与qβ病毒样颗粒经sortasea酶催化形成一种重组蛋白gnrh-i6-qβ；所述重组蛋白gnrh-i6-qβ氨基酸序列为seqidno.1。
2.一种重组质粒his-mbp-tev-gnrh-i6-petm41，其特征在于，该重组质粒his-mbp-tev-gnrh-i6-petm41是将seqidno.2所示的核苷酸通过同源重组方法克隆入原核表达载体petm41的ncoi位点和bamhi位点所得。
3.一种重组质粒his-tev-qβ-pet28a，其特征在于，该重组质粒his-tev-qβ-pet28a是将seqidno.3所示的核苷酸片段克隆入原核表达载体为pet28a的ncoi和xhoi两个酶切位点间所得。
4.一种重组质粒his-tevprotease-pet28a，其特征在于，该重组质粒his-tevprotease-pet28a是将seqidno.4所示的核苷酸片段克隆入原核表达载体为pet28a的ncoi和xhoi两个酶切位点间所得。
5.一种重组质粒his-sotasea-pet28a，其特征在于，该重组质粒his-sotasea-pet28a是将seqidno.5所示的核苷酸片段克隆入原核表达载体为pet28a的ncoi和xhoi两个酶切位点间所得。
6.一种gnrh-i6-qβ病毒样颗粒制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5中的基因序列合成目的基因，构建重组载体，依次分别为：
his-mbp-tev-gnrh-i6-petm41；
his-tev-qβ-pet28a；
his-tevprotease-pet28a；
his-sotasea-pet28a；
(2)将步骤(1)经序列测定正确的重组质粒转化大肠杆菌t7shuffle，分别得到重组表达菌株：
his-mbp-tev-gnrh-i6-petm41-t7shuffle；
his-tev-qβ-pet28a-t7shuffle；
his-tevprotease-pet28a-t7shuffle；
his-sotasea-pet28a-t7shuffle；
(3)分别培养步骤⑵的重组表达菌株，加入iptg进行诱导表达，收集菌体超声破碎，并经镍柱纯化，分别获得重组蛋白：
his-mbp-tev-gnrh-i6重组蛋白；
his-tev-qβ病毒样颗粒；
his-tev酶；
his-sotasea酶；
(4)将步骤⑶中的his-mbp-tev-gnrh-i6重组蛋白及his-tev-qβ病毒样颗粒均由pbs溶液溶解，分别加入所述的his-tev酶进行酶切，按照10ughis-tev酶酶切1mg重组蛋白的比例进行酶切，30摄氏度震荡酶切3h，然后将酶切液分别过镍柱，穿透液分别为gnrh-i6重组蛋白及qβ病毒样颗粒，分别用3k浓缩管进行浓缩；
(5)将步骤⑷中的his-mbp-tev-gnrh-i6重组蛋白及his-tev-qβ病毒样颗粒分别用pbs配制成1mg/ml，按照1：1进行混合，加入将步骤⑶中的his-sotasea酶，按照100ug催化2mg混合蛋白的比例进行37℃震荡催化5h，然后将催化液过镍柱，穿透液为gnrh-i6-qβ病毒样颗粒，用3k浓缩管进行浓缩。
7.根据权利要求6所述的一种gnrh-i6-qβ病毒样颗粒制备方法，其特征在于，将重组表达菌株培养至od600达0.6-0.8时加入终浓度为1mm的iptg进行诱导表达12h，然后收集菌体用10mmpbs混匀菌体进行超声破碎，然后使用镍柱进行纯化，25mm咪唑洗杂10个柱体积，250mm咪唑洗脱目的蛋白。
8.一种亚单位疫苗，其特征在于，包含权利要求6的gnrh-i6-qβ病毒样颗粒及弗斯佐剂。
9.根据权利要求8所述的一种亚单位疫苗，其特征在于，用于生产疫苗。
技术总结