本发明涉及肿瘤细胞治疗领域，具体涉及一种靶向egfrviii的嵌合抗原受体、表达该嵌合抗原受体的脐血有核细胞及其制备方法和应用。
背景技术：
从肿瘤的发生学上来说，肿瘤细胞是由正常细胞转变而来的，这种从“自己”到“非己”的过程往往会收到机体免疫系统的监视，被有效的免疫应答所清除。近年来，由于肿瘤学、免疫学、细胞学及分子生物学等相关学科的理论和技术快速发展和交叉渗透，随着对机体抗肿瘤免疫应答的深入了解，以及对肿瘤免疫逃逸机制和肿瘤微环境的深入认识，肿瘤免疫治疗的新策略和新思路已经得到进一步的研究和拓展，肿瘤的免疫疗法也因其靶向性高、副作用少、治疗效果好等优势受到了前所未有的重视。
免疫治疗(immunotherapy)是指针对机体低下或亢进的免疫状态，人为地增强或抑制机体的免疫功能以达到治疗疾病目的的治疗方法。肿瘤免疫治疗旨在激活人体免疫系统，依靠自身免疫机能杀灭癌细胞和肿瘤组织。与以往的手术、化疗、放疗和靶向治疗不同的是，免疫治疗针对的靶标不是肿瘤细胞和组织，而是人体自身的免疫系统。利用细胞和分子免疫学的理论，增强机体的抗肿瘤免疫，高效、安全地杀伤肿瘤细胞，是肿瘤免疫治疗的焦点所在。
过继性细胞免疫治疗(adoptivecelltherapy，act)是将具有抗肿瘤活性的免疫细胞输注给癌症患者，是一种高度个体化的癌症治疗新手段。利用自体肿瘤浸润淋巴细胞(tumorinfiltrationlymphocytes，til)的act治疗取得了一定的成果，然而，til体外分离培养技术繁杂且费事费力，如何鉴定和寻找抗原特异性t细胞也较为困难。为克服这些不足，嵌合抗原受体-t细胞(chimericantigenreceptor-tcells，car-t细胞)技术应运而生。car-t细胞是将融合基因car以核酸形式导入到宿主t淋巴细胞基因组中构建而成。car的结构包括单链抗体、跨膜区、协同刺激分子及信号转导分子等组分。car-t细胞以主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex，mhc)非限制性的形式特异识别和杀伤表达特定抗原的癌细胞。在血液瘤中取得了70-90％的完全缓解率，然而在实体瘤中却达不到预期效果，这可能与能够浸润到实体瘤中的cart细胞数量不足及其亲和力不高有关。
表皮生长因子受体(egfr)是表皮生长因子(egf)细胞增殖和信号转导的受体，是一个170kd的跨膜糖蛋白受体酪氨酸激酶，egf与egfr结合后会引发一系列细胞内的变化，影响细胞的生长、增值和分化。egfr广泛分布在许多正常和恶性上皮细胞中，其过度表达和自我激活可能与许多肿瘤的发生发展有关，其目前主要用于各种上皮源性恶性肿瘤包括头颈部鳞癌、肺癌、乳腺癌和膀胱癌等的研究。研究表明，egfr与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移及抑制细胞凋亡有关，因此，egfr可作为一个重要的用药靶点进行抗肿瘤研究。专利cn110526992a公开了一种靶向egfr的嵌合抗原受体car-egfr及包含所述嵌合抗原受体的t细胞，可应用于杀灭egfr阳性肿瘤细胞。专利cn105384826a亦公开了一种嵌合抗原受体及其相关的核酸和表达载体、脐血有核细胞、注射液，可用于预防和治疗多种egfrviii阳性肿瘤如神经胶质瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌等，但其在体内对实体肿瘤的杀伤效果仍无法达到预期要求。
因此，亟需开发一种能够更好地浸润实体肿瘤、高亲和结合肿瘤细胞、杀伤效果更强的嵌合抗原受体，用于egfrviii阳性实体肿瘤的治疗和预防。
技术实现要素：
针对上述不足，本发明提供了一种靶向egfrviii的嵌合抗原受体及表达该嵌合抗原受体的细胞，所述的表达该嵌合抗原受体的细胞可以特异性的识别和杀伤egfrviii阳性肿瘤细胞，且靶向及杀伤效果较强。
为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一方面，本发明提供了一种靶向egfrviii的嵌合抗原受体(car)，所述的嵌合抗原受体包括抗原识别结构域，所述的抗原识别结构域包括单克隆抗体scfv片段，所述的单克隆抗体scfv片段的氨基酸序列如seqidno:3所示。
具体地，所述的单克隆抗体scfv片段由专利cn105384826a所述的carscfv片段突变得到，所述的单克隆抗体scfv片段的亲和力更高。
具体地，所述的抗原识别结构域还包括信号肽，所述的信号肽的氨基酸序列如seqidno:2所示。
具体地，所述的嵌合抗原受体还包括跨膜结构域和胞内信号转导结构域。
进一步具体地，所述的跨膜结构域包括铰链结构和跨膜区，所述的铰链结构的氨基酸序列如seqidno:4所示，所述的跨膜区的氨基酸序列如seqidno:5所示。
进一步具体地，所述的胞内信号转导结构域包括协同刺激分子和cd3ζ，所述的协同刺激分子的氨基酸序列如seqidno:6所示，所述的cd3ζ的氨基酸序列如seqidno:7所示。
具体地，所述的抗原识别结构域的氨基酸序列如seqidno:8所示，所述的跨膜结构域的氨基酸序列如seqidno:9所示，所述的胞内信号转导结构域的氨基酸序列如seqidno:10所示。
具体地，所述的嵌合抗原受体的氨基酸序列如seqidno:1所示。
进一步具体地，所述的嵌合抗原受体由专利cn105384826a所述的car突变得到。
又一方面，本发明提供了一种核酸分子，所述的核酸分子编码上述嵌合抗原受体，所述的核酸分子的碱基序列如seqidno:11所示。
具体地，与本发明所述核酸分子序列seqidno:11具有简并碱基的序列也在本发明的保护范围内。
又一方面，本发明提供了一种载体，所述的载体含有上述的核酸分子。此载体能够高效转导细胞并在其中稳定表达。
具体地，所述的载体包括但不限于质粒、病毒和噬菌体。
进一步具体地，所述的病毒载体包括但不限于慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。
又一方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有上述核酸分子或载体。
具体地，所述的宿主细胞包括但不限于hek293t细胞、293细胞、293t细胞、293ft细胞、sw480细胞、u87mg细胞、hos细胞、cos1细胞、cos7细胞。
又一方面，本发明提供了一种表达嵌合抗原受体的脐血有核细胞。
具体地，本发明所述的脐血有核细胞含有上述核酸分子或载体，所述核酸分子或载体通过病毒、脂质体、电转染或转座子系统转染至脐血有核细胞，在靶细胞表达嵌合抗原受体。
进一步具体地，所述的脐血有核细胞来源于人或动物脐血，是通过梯度密度离心、流式分选、免疫磁珠分选方法分离获得的有核细胞群，包括：t细胞、杀伤细胞、造血干细胞、间质干细胞、间质前体细胞和上皮样前体细胞。
又一方面，本发明还提供了上述嵌合抗原受体、核酸分子、载体、宿主细胞及表达嵌合抗原受体的脐血有核细胞在制备治疗和/或预防肿瘤药物中的应用。
具体地，所述的肿瘤为egfrviii阳性肿瘤。
进一步具体地，所述的肿瘤包括但不限于神经胶质瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌。
进一步具体地，所述的药物通过car靶向egfrviii抗原，高效杀伤肿瘤细胞的细胞群。
又一方面，本发明还提供了一种细胞注射液。
具体地，所述的细胞注射液含有本发明所述的嵌合抗原受体、核酸分子、载体、宿主细胞或脐血有核细胞。
与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：
本发明所述的嵌合抗原受体对egfrviii阳性肿瘤细胞的亲和力、靶向及杀伤效果强，能够高效且特异性地杀伤肿瘤细胞，更好地浸润实体肿瘤，可用于egfrviii阳性实体肿瘤的治疗和预防。
附图说明
图1为本申请所述car与专利cn105384826a所述car序列比对图，其中，1为本申请所述car，2为专利cn105384826a所述的car。
图2为质粒转染293t细胞的荧光表达图。
图3为fuw-car及fuw-egfp慢病毒感染脐血有核细胞后的荧光表达图。
图4为细胞流式鉴定图。
图5为体外肿瘤细胞杀伤结果图。
图6为体内肿瘤细胞杀伤结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1嵌合抗原受体及其载体质粒的设计与构建
1.car设计
本发明的嵌合抗原受体(car)，包含人抗体egfrviii的抗原识别结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，其氨基酸序列如seqidno:1所示，通过对专利cn105384826a所述的car突变得到，取得了意想不到的效果。
嵌合抗原受体是人工构建的融合蛋白或多肽，其利用单克隆抗体的抗原结合性质以非mhc限制的方式改变t细胞对选定靶标的特异性和反应性，由此绕过肿瘤逃逸的机制。
本发明的car对表皮生长因子受体变体iii(egfrviii)具有抗原特异性。egfrviii是表皮生长因子受体(egfr)的变体，是在人神经胶质瘤中发现的几种egfr突变中的最普遍的，且在约30％至约50％的多形性成胶质细胞瘤(gbm)中表达。egfrviii的表达源自消除egfr外显子2-7并造成编码序列的外显子1和8的连接的基因内缺失重排。egfrviii由不同癌症的肿瘤细胞表达，例如：成胶质细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌和非小细胞肺癌；头颈鳞状细胞癌；髓母细胞瘤、结直肠癌、前列腺癌和膀肮癌等。本发明的car能够靶向和破坏表达egfrviii的肿瘤细胞，减少或消除肿瘤，促进免疫细胞向肿瘤部位的渗入，增强和延长抗肿瘤反应。egfrviii不在正常的组织中表达，因此本发明的car基本上避免破坏正常的组织和细胞。
本发明中所述的人抗体egfrviii的抗原识别结构域的氨基酸序列如seqidno:8所示，抗原识别结构域包括信号肽和单克隆抗体，信号肽的氨基酸序列如seqidno:2所示，其中序列s4g、s19g，单克隆抗体(scfv)的序列如seqidno:3所示，其中序列k31d、k76d、d165k、d166k、d167k，scfv的重链可变区和轻链可变区由接头肽连接，对egfrviii的结合力较高。
本发明中所述的跨膜结构域的氨基酸序列如seqidno:9所示，跨膜结构域包括铰链结构和跨膜区，铰链结构的氨基酸序列如seqidno:4所示，其中序列k2f，跨膜区的氨基酸序列如seqidno:5所示，其中序列d7f、d11f。
本发明中所述的胞内信号转导结构域的氨基酸序列如seqidno:10所示，胞内信号转导结构域包括协同刺激分子和cd3ζ，所述的协同刺激分子的氨基酸序列如seqidno:6所示，其中序列d26y，其可有效的共剌激信号传导至t细胞，从而促进分化和增强t淋巴细胞的长期存活，所述的cd3ζ的氨基酸序列如seqidno:7所示，其中序列d65y，其可与tcr结合以产生信号。
本申请所述嵌合抗原受体car与专利cn105384826a所述car的序列比对详见图1。
本发明中编码上述嵌合抗原受体的核酸序列如seqidno:11所示。
2.慢病毒表达载体fuw-gfp及fuw-car的构建。
基因序列bamhi-car-ecor1委托上海捷瑞生物科技有限公司合成，fuw空表达载体购于addgene，fuw-egfp由中国科学院广州生物医院与健康研究院惠赠。
将基因序列bamhi-car-ecor1和fuw空表达载体用bamhi和ecori进行双酶切后，胶回收，使用solutioni连接后转化至感受态大肠杆菌，扩增后送测序公司进行测序鉴定，连接正确，获得慢病毒表达载体fuw-car。
3.质粒转染293t细胞包装慢病毒
将生长状态良好的293t细胞传代至10cm培养皿，等细胞增殖至约为80-90％时更换新鲜培养基并进行转染。
取15ml离心管，加入1mlopti-mem，再加入8μg质粒fuw-egfp/fuw-car，2.5μg包膜质粒pmd2g，5.5μg包装质粒pspax2，混匀静置5min。加入64μgpei转染试剂，用力摇匀，静置12-15min。将上述试剂滴加至293t细胞表面，摇匀，37℃培养12h后换液，再培养48h后观察荧光表达(图2)并收获上清，用0.22μm滤器过滤去除细胞碎片，超速离心25000rpm，2.5h。弃上清，加t细胞培养基重悬病毒，过滤除菌-80℃保存。
4.慢病毒滴度测定
将生长状态良好的293t细胞消化计数后稀释至1×105/ml，加入96孔板，100μl/孔，共10个孔。准备10个1.5mlep管，每管加入90μl培养液，往第一个管中加入10μl病毒原液，混匀后，吸取10μl加入第二个管混匀。依此类推，做十个稀释度(10-10-8)。吸取96孔板中原有的培养基，加入含稀释好的病毒液。24h后加液100μl。转染48h后观察结果并计算滴度：在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。假设为x和y，则滴度(tu/ml)＝(x y×10)×1000/2/x孔的病毒液的含量(μl)。
本发明一个实施例中每个10cm皿293t细胞包装病毒滴度约为2*107tu，冻存复苏后滴度约为1.5-1.8*107tu。
实施例2慢病毒转染脐血有核细胞
用梯度密度离心法从健康人脐血中分离有核细胞。以1×106细胞/ml的密度加入含300iu/mlil-2(北京双鹭制药有限公司)的t淋巴细胞培养基gt-t551(takara)培养，并加入5％的同一脐血的血浆，以及80ng/ml的cd3mab(上海微科生物科技有限公司)激活t细胞刺激培养48h，然后以moi＝5用实施例1的重组慢病毒感染脐血有核细胞，感染后的细胞第二天换液，每隔2-3天传代。
细胞培养至10天左右收获，细胞可扩增30-80倍，且细胞再激活后仍能扩增。在荧光显微镜下可观察到同型对照细胞高表达绿色荧光蛋白(图3)，并通过流式检测技术分析转染的脐血有核细胞中各类细胞(t细胞、nk细胞、cik细胞等)比例(图4)，可见大部分细胞为cd3阳性t淋巴细胞。
对比例1
按照专利cn105384826a实施例1和实施例2制备的嵌合抗原受体脐血有核细胞。
实验例1体外肿瘤细胞杀伤
将经本发明实施例1和实施例2制备的嵌合抗原受体脐血有核细胞、对比例1制备的嵌合抗原受体脐血有核细胞、未经制备的脐血有核细胞(阴性对照组)的体外肿瘤细胞的杀伤效果进行比较。具体步骤为：在体外将1×105个效应细胞(本发明制备的嵌合抗原受体脐血有核细胞、对比例1制备的嵌合抗原受体脐血有核细胞、egfp对照细胞、未经制备的脐血有核细胞)与靶细胞(u251人神经胶质细胞瘤细胞)数量比为1:10、1:3、1:1、3:1、10:1的比例，在37℃，5％co2的条件下进行共培养，在培养后的第15-18h收集细胞，检测细胞杀伤情况。结果如图5所示，表明本发明所述的方法制备的靶向egfrviii的嵌合抗原受体脐血有核细胞肿瘤杀伤效果优于对比例及阴性对照组，因此经本发明制备的靶向egfrviii的嵌合抗原受体脐血有核细胞具有高亲和结合肿瘤细胞及更强的肿瘤杀伤能力。
实验例2体内肿瘤细胞杀伤
1.建立免疫缺陷小鼠人脑胶质瘤移植瘤模型
将长到对数期的u251人神经胶质细胞瘤细胞消化收集到15ml离心管，用dmem洗涤，弃上清，加pbs重悬调整细胞密度为5×107/ml。用碘酊和乙醇消毒免疫缺陷小鼠背部皮肤，抽取100ul细胞接种于小鼠右侧背部皮肤皮下，拔针后压迫针孔片刻，接种后送回spf饲养室饲养。接种后每天观察小鼠饮食，排便及精神状况并称重，观察各注射点有无红肿破溃并用游标卡尺测量肿块的长度和宽度。肿瘤体积评估按v＝0.5×a×b2(a为长度，b为宽度)计算。
2.细胞输注
当肿瘤体积达到约500mm3时，将裸鼠按每组5只随机分成4组。从尾静脉移植细胞或pbs至小鼠体内。a组移植1×107本发明制备的表达嵌合抗原受体的脐血有核细胞，b组移植相同数量的对比例1制备的表达嵌合抗原受体的脐血有核细胞，c组移植相同数量的egfp对照细胞，d组移植pbs。输注后，继续观察小鼠，称重并测量评估肿瘤体积，共观察2个月。当肿瘤体积达到2000mm3时，处死小鼠。统计各组数据。
3.实验结果：如图6所示，移植表达car的脐血有核细胞对免疫缺陷小鼠移植瘤的生长具有显著抑制作用。在第10天移植细胞，之后10天左右其肿瘤生长速度显著变慢，再往后其体积呈减小趋势，表明表达car的脐血有核细胞具有良好的抑制肿瘤生长效果并能有效减小杀伤肿瘤细胞，减小肿瘤体积，且本发明的制备的表达嵌合抗原受体的脐血有核细胞的效果明显优于对比例1制备的表达嵌合抗原受体的脐血有核细胞，具有更高效的浸润、杀伤实体瘤的效果。egfp对照细胞与pbs组肿瘤仍持续增长，两者之间没有显著差异。
实验例3细胞注射液的制备
通过密度梯度离心方法从脐血中分离出脐血有核细胞，使用红细胞裂解液裂解其中红细胞后使用无血清t淋巴细胞培养基gt-t551(takara)添加il-2进行培养，以单独cd3mab进行激活，避免了免疫磁珠激活的繁琐步骤及磁珠污染，能够更安全的用于临床。
激活后第2天，用包装的病毒感染细胞(参见实施例1和2)，感染后48-72h可见对照细胞表达绿色荧光。每2-3天可进行扩大培养，10-14天收获细胞质量检测合格品冻存。
使用时复苏洗涤后添加生理盐水注射液制成表达嵌合抗原受体的脐血有核细胞混悬液。
本实施例所述的细胞注射液包括本发明所述的表达嵌合抗原受体(car)的脐血有核细胞，可用于制备治疗或预防神经胶质瘤、乳腺癌、卵巢癌及肺癌等肿瘤的药物。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110>广州熙帝生物科技有限公司
<120>一种嵌合抗原受体、嵌合抗原受体脐血有核细胞及应用
<130>20201130
<160>11
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>527
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
metglytrpglycysileileleupheleuvalalathralathrgly
151015
valhisglyglnvallysleuglnglnserglyglyglyleuvallys
202530
proglyalaserleulysleusercysvalthrserglyphethrphe
354045
argasppheglymetsertrpvalargglnthrserasplysargleu
505560
glutrpvalalaserileserthrglyglytyrasnthrtyrtyrser
65707580
aspasnvallysglyargphethrileserarggluasnalaaspasn
859095
thrleutyrleuglnmetserserleulyssergluaspthralaleu
100105110
tyrtyrcysthrargglytyrserprotyrsertyralametasptyr
115120125
trpglyglnglythrthrvalthrvalserserserglyglyglyser
130135140
glyglyglyglyserglyglyglyglyseraspilegluleuthrgln
145150155160
serproalaserleuservalalathrglyglulysvalthrilearg
165170175
cysmetthrserthraspilelyslyslysmetasntrptyrglngln
180185190
lysproglygluproprolyspheleuilesergluglyasnthrleu
195200205
argproglyvalproserargpheserserserglythrglythrasp
210215220
phevalphethrilegluasnthrleusergluaspvalglyasptyr
225230235240
tyrcysleuglnsertrpasnvalproleuthrpheglyaspglythr
245250255
lysleugluilelysalapheprothrthrthrproalaproargpro
260265270
prothrproalaprothrilealaserglnproleuserleuargpro
275280285
glualacysargproalaalaglyglyalavalhisthrargglyleu
290295300
phephealacyspheiletyriletrpalaproleualaglythrcys
305310315320
glyvalleuleuleuserleuvalilethrleutyrlysargglyarg
325330335
lyslysleuleutyrilephelysglnprophemetargprovalgln
340345350
thrthrglngluglutyrglycyssercysargpheproglugluglu
355360365
gluglyglycysgluleuargserlysargserargleuleuhisser
370375380
asptyrmetasnmetthrproargargproglyprothrarglyshis
385390395400
gluglnprotyralaproproargaspphealaalatyrargserarg
405410415
vallyspheserargseralaaspalaproalatyrglnglnglygln
420425430
asnglnleutyrasngluleuasnleuglyargarggluglutyrasp
435440445
valleuasplysargargglyargaspproglumetglyglylyspro
450455460
argarglysasnproglngluglyleutyrasngluleuglnlystyr
465470475480
lysmetalaglualatyrsergluileglymetlysglygluargarg
485490495
argglylysglyhisaspglyleutyrglnglyleuserthralathr
500505510
lysaspthrtyraspalaleuhismetglnalaleuproproarg
515520525
<210>2
<211>19
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
metglytrpglycysileileleupheleuvalalathralathrgly
151015
valhisgly
<210>3
<211>242
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
glnvallysleuglnglnserglyglyglyleuvallysproglyala
151015
serleulysleusercysvalthrserglyphethrpheargaspphe
202530
glymetsertrpvalargglnthrserasplysargleuglutrpval
354045
alaserileserthrglyglytyrasnthrtyrtyrseraspasnval
505560
lysglyargphethrileserarggluasnalaaspasnthrleutyr
65707580
leuglnmetserserleulyssergluaspthralaleutyrtyrcys
859095
thrargglytyrserprotyrsertyralametasptyrtrpglygln
100105110
glythrthrvalthrvalserserserglyglyglyserglyglygly
115120125
glyserglyglyglyglyseraspilegluleuthrglnserproala
130135140
serleuservalalathrglyglulysvalthrileargcysmetthr
145150155160
serthraspilelyslyslysmetasntrptyrglnglnlysprogly
165170175
gluproprolyspheleuilesergluglyasnthrleuargprogly
180185190
valproserargpheserserserglythrglythraspphevalphe
195200205
thrilegluasnthrleusergluaspvalglyasptyrtyrcysleu
210215220
glnsertrpasnvalproleuthrpheglyaspglythrlysleuglu
225230235240
ilelys
<210>4
<211>37
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
alapheprothrthrthrproalaproargproprothrproalapro
151015
thrilealaserglnproleuserleuargproglualacysargpro
202530
alaalaglyglyala
35
<210>5
<211>34
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>5
valhisthrargglyleuphephealacyspheiletyriletrpala
151015
proleualaglythrcysglyvalleuleuleuserleuvalilethr
202530
leutyr
<210>6
<211>83
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>6
lysargglyarglyslysleuleutyrilephelysglnprophemet
151015
argprovalglnthrthrglngluglutyrglycyssercysargphe
202530
proglugluglugluglyglycysgluleuargserlysargserarg
354045
leuleuhisserasptyrmetasnmetthrproargargproglypro
505560
thrarglyshisgluglnprotyralaproproargaspphealaala
65707580
tyrargser
<210>7
<211>112
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>7
argvallyspheserargseralaaspalaproalatyrglnglngly
151015
glnasnglnleutyrasngluleuasnleuglyargarggluglutyr
202530
aspvalleuasplysargargglyargaspproglumetglyglylys
354045
proargarglysasnproglngluglyleutyrasngluleuglnlys
505560
tyrlysmetalaglualatyrsergluileglymetlysglygluarg
65707580
argargglylysglyhisaspglyleutyrglnglyleuserthrala
859095
thrlysaspthrtyraspalaleuhismetglnalaleuproproarg
100105110
<210>8
<211>261
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>8
metglytrpglycysileileleupheleuvalalathralathrgly
151015
valhisglyglnvallysleuglnglnserglyglyglyleuvallys
202530
proglyalaserleulysleusercysvalthrserglyphethrphe
354045
argasppheglymetsertrpvalargglnthrserasplysargleu
505560
glutrpvalalaserileserthrglyglytyrasnthrtyrtyrser
65707580
aspasnvallysglyargphethrileserarggluasnalaaspasn
859095
thrleutyrleuglnmetserserleulyssergluaspthralaleu
100105110
tyrtyrcysthrargglytyrserprotyrsertyralametasptyr
115120125
trpglyglnglythrthrvalthrvalserserserglyglyglyser
130135140
glyglyglyglyserglyglyglyglyseraspilegluleuthrgln
145150155160
serproalaserleuservalalathrglyglulysvalthrilearg
165170175
cysmetthrserthraspilelyslyslysmetasntrptyrglngln
180185190
lysproglygluproprolyspheleuilesergluglyasnthrleu
195200205
argproglyvalproserargpheserserserglythrglythrasp
210215220
phevalphethrilegluasnthrleusergluaspvalglyasptyr
225230235240
tyrcysleuglnsertrpasnvalproleuthrpheglyaspglythr
245250255
lysleugluilelys
260
<210>9
<211>71
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>9
alapheprothrthrthrproalaproargproprothrproalapro
151015
thrilealaserglnproleuserleuargproglualacysargpro
202530
alaalaglyglyalavalhisthrargglyleuphephealacysphe
354045
iletyriletrpalaproleualaglythrcysglyvalleuleuleu
505560
serleuvalilethrleutyr
6570
<210>10
<211>195
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>10
lysargglyarglyslysleuleutyrilephelysglnprophemet
151015
argprovalglnthrthrglngluglutyrglycyssercysargphe
202530
proglugluglugluglyglycysgluleuargserlysargserarg
354045
leuleuhisserasptyrmetasnmetthrproargargproglypro
505560
thrarglyshisgluglnprotyralaproproargaspphealaala
65707580
tyrargserargvallyspheserargseralaaspalaproalatyr
859095
glnglnglyglnasnglnleutyrasngluleuasnleuglyargarg
100105110
gluglutyraspvalleuasplysargargglyargaspproglumet
115120125
glyglylysproargarglysasnproglngluglyleutyrasnglu
130135140
leuglnlystyrlysmetalaglualatyrsergluileglymetlys
145150155160
glygluargargargglylysglyhisaspglyleutyrglnglyleu
165170175
serthralathrlysaspthrtyraspalaleuhismetglnalaleu
180185190
proproarg
195
<210>11
<211>1581
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>11
atgggctggggctgcatcatcctgttcctggtggccaccgccaccggcgtgcacggccag60
gtgaagctgcagcagagcggcggcggcctggtgaagcccggcgccagcctgaagctgagc120
tgcgtgaccagcggcttcaccttcagggacttcggcatgagctgggtgaggcagaccagc180
gacaagaggctggagtgggtggccagcatcagcaccggcggctacaacacctactacagc240
gacaacgtgaagggcaggttcaccatcagcagggagaacgccgacaacaccctgtacctg300
cagatgagcagcctgaagagcgaggacaccgccctgtactactgcaccaggggctacagc360
ccctacagctacgccatggactactggggccagggcaccaccgtgaccgtgagcagcagc420
ggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcgacatcgagctgacccag480
agccccgccagcctgagcgtggccaccggcgagaaggtgaccatcaggtgcatgaccagc540
accgacatcaagaagaagatgaactggtaccagcagaagcccggcgagccccccaagttc600
ctgatcagcgagggcaacaccctgaggcccggcgtgcccagcaggttcagcagcagcggc660
accggcaccgacttcgtgttcaccatcgagaacaccctgagcgaggacgtgggcgactac720
tactgcctgcagagctggaacgtgcccctgaccttcggcgacggcaccaagctggagatc780
aaggccttccccaccaccacccccgcccccaggccccccacccccgcccccaccatcgcc840
agccagcccctgagcctgaggcccgaggcctgcaggcccgccgccggcggcgccgtgcac900
accaggggcctgttcttcgcctgcttcatctacatctgggcccccctggccggcacctgc960
ggcgtgctgctgctgagcctggtgatcaccctgtacaagaggggcaggaagaagctgctg1020
tacatcttcaagcagcccttcatgaggcccgtgcagaccacccaggaggagtacggctgc1080
agctgcaggttccccgaggaggaggagggcggctgcgagctgaggagcaagaggagcagg1140
ctgctgcacagcgactacatgaacatgacccccaggaggcccggccccaccaggaagcac1200
gagcagccctacgccccccccagggacttcgccgcctacaggagcagggtgaagttcagc1260
aggagcgccgacgcccccgcctaccagcagggccagaaccagctgtacaacgagctgaac1320
ctgggcaggagggaggagtacgacgtgctggacaagaggaggggcagggaccccgagatg1380
ggcggcaagcccaggaggaagaacccccaggagggcctgtacaacgagctgcagaagtac1440
aagatggccgaggcctacagcgagatcggcatgaagggcgagaggaggaggggcaagggc1500
cacgacggcctgtaccagggcctgagcaccgccaccaaggacacctacgacgccctgcac1560
atgcaggccctgccccccagg1581
1.一种靶向egfrviii的嵌合抗原受体，其特征在于，所述的嵌合抗原受体包括抗原识别结构域，所述的抗原识别结构域包括单克隆抗体scfv片段，所述的单克隆抗体scfv片段的氨基酸序列如seqidno:3所示。
2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述的抗原识别结构域还包括信号肽，所述的信号肽的氨基酸序列如seqidno:2所示。
3.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述的嵌合抗原受体还包括跨膜结构域和胞内信号转导结构域；
所述的跨膜结构域包括铰链结构和跨膜区，所述的铰链结构的氨基酸序列如seqidno:4所示，所述的跨膜区的氨基酸序列如seqidno:5所示；
所述的胞内信号转导结构域包括协同刺激分子和cd3ζ，所述的协同刺激分子的氨基酸序列如seqidno:6所示，所述的cd3ζ的氨基酸序列如seqidno:7所示。
4.根据权利要求3所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述的抗原识别结构域的氨基酸序列如seqidno:8所示，所述的跨膜结构域的氨基酸序列如seqidno:9所示，所述的胞内信号转导结构域的氨基酸序列如seqidno:10所示。
5.根据权利要求4所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述的嵌合抗原受体的氨基酸序列如seqidno:1所示。
6.一种编码权利要求1所述的嵌合抗原受体的核酸分子，其特征在于，所述的核酸分子的碱基序列如seqidno:11所示。
7.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求6所述的核酸分子。
8.一种表达嵌合抗原受体的脐血有核细胞，其特征在于，所述的脐血有核细胞含有权利要求6所述的核酸分子或权利要求7所述的载体，所述核酸分子或载体通过病毒、脂质体、电转染或转座子系统转染至脐血有核细胞，在靶细胞表达嵌合抗原受体。
9.权利要求1所述的嵌合抗原受体、权利要求6所述的核酸分子、权利要求7所述的载体、权利要求8所述的表达嵌合抗原受体的脐血有核细胞在制备治疗和/或预防肿瘤药物中的应用。
10.一种细胞注射液，其特征在于，所述的细胞注射液含有权利要求1所述的嵌合抗原受体、权利要求6所述的核酸分子、权利要求7所述的载体或权利要求8所述的表达嵌合抗原受体的脐血有核细胞。
技术总结