本发明属于畜牧兽医技术领域，具体涉及一种伪狂犬病病毒gb-gc表位串联体及其应用。
背景技术：
猪伪狂犬病病毒（pseudorabiesvirus，prv）是一种猪神经性疱疹病毒(yeetal.,2018)。尽管猪是prv的天然宿主，但还可以感染多种哺乳动物，包括反刍动物、食肉动物和啮齿动物。它是家畜重要的神经系统致病菌，感染prv的动物可能死于中枢神经系统疾病(tirabassi&enquist,2000)。prv感染对养猪业构成严重威胁，通常使用减毒活疫苗或灭活疫苗来控制疾病(freulingetal.,2017)。自2011年以来，中国bartha-k61接种疫苗的养猪场再次出现由prv基因变异引起的伪狂犬病，并分离获得prv新型毒株fj-2012株(wuetal.,2017)。先前的研究表明，prv-barthak61疫苗未能阻止猪体内针对强毒力prv株的病毒释放(wangetal.,2014;tongetal.,2015)。
prv基因组为线状双链dna，大小为150kb，g c含量高达75%，含有72个阅读框，共编码70-100种蛋白，目前已知的编码糖蛋白11中，其中gb、gc蛋白与宿主的免疫应答密切相关(iglesiasetal.,1992)。gb、gc糖蛋白均为囊膜蛋白，广泛分布于病毒颗粒的囊膜表面，具有高度保守性，能够诱导机体产生高水平的中和抗体，gb或gc蛋白的亚单位疫苗均可保护小鼠或猪免受prv感染，具有良好的免疫原性和反应原性，是构建重组dna疫苗和疫苗免疫检测的首选蛋白。多表位亚单位疫苗是近几年来新兴发展的一种疫苗研制技术。表位疫苗以抗原表位为基础制备的疫苗，相对传统疫苗，表位疫苗是诱发的免疫应答针对性强，无毒、比较稳定，并易于生产、储藏和使用，是今后疫苗发展的方向(dengetal.,2015)。因此可以设计基于gb-gc序列的新基因作为疫苗候选的抗原，或者选择能够刺激机体产生保护性体液免疫反应的gb-gc抗原表位片段作为诊断抗原，用于prv抗体的检测和表位疫苗的研制。
本申请首次将prv上抗原表位基因gb-gc串联，重组至pet-28a（ ）载体上，构建pet-28a（ ）-gb-gc原核重组表达质粒，并转化到bl21(de3)诱导表达，制备兔抗血清，为prv诊断试剂盒的开发和prv多表位疫苗的研究奠定了基础。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种伪狂犬病病毒gb-gc表位串联体及其应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种伪狂犬病病毒gb-gc表位串联体，所述表达串联体其氨基酸序列如seqidno.1所示。编码伪狂犬病病毒gb-gc表位串联体的基因，序列如seqidno.2所示。
所述的伪狂犬病病毒gb-gc表位串联体在制备prv诊断试剂盒及疫苗中的应用。
本发明的优点在于：
本发明为获得体外诱导表达且具有良好免疫原性的伪狂犬病病毒（pseudorabiesvirus，prv）表位串联体，依据新型伪狂犬病病毒fj-2012株gb和gc蛋白抗原表位基因序列，通过密码子优化，组成gb、gc多抗原表位串联体，人工合成其cdna序列，并通过ncoi、ecori酶切位点克隆至原核表达载体pet-28a( )多克隆位点，转化至bl21（de3）感受态细胞，优化iptg诱导表达重组蛋白的时间，并用间接elisa法测定其抗体效价，评价其免疫原性。质粒测序及酶切的结果说明构建了gb-gc抗原表位串联基因重组表达质粒，sds-page及westrenblot结果表明iptg诱导2h后即可成功表达gb-gc重组蛋白，elisa检测其该抗血清效价可达1:6400。表明prv抗原串联表位基因原核表达载体构建成功并获得了prv抗血清，这为prv表位筛选、prv多表位疫苗及诊断试剂的研究奠定了基础。
附图说明
图1prv病毒fj-2012毒株gb、gc表位基因pcr扩增结果，m，2kmarker；1，2，3，以fj-2012毒株核酸为模板进行gb表位基因pcr扩增；4，5，6，以fj-2012毒株核酸为模板进行gc表位基因pcr扩增。
图2prv病毒gb-gc抗原表位基因优化后的核苷酸测序。
图3pcr验证和酶切鉴定结果，其中a：m，2kmarker；1，2，3，4，以质粒为模板进行的pcr；b：m1，2kmarker；m2，8kmarker；1，以质粒为模板进行的pcr；2，双酶切产物。
图4重组质粒测序峰形图。
图5重组质粒测序结果与原始序列的比对结果。
图6重组蛋白的诱导表达及鉴定。a，m：proteinmaker；1，未诱导菌液沉淀；2，3，4依次是用iptg诱导gb-gc-pet-28a( )-bl21(de3)2h，4h，6h时的菌液沉淀；b，m：proteinmaker；1，iptg用iptg诱导gb-gc-pet-28a( )-bl21(de3)的菌液沉淀。
图7gb-gc重组蛋白的纯化及免疫原性分析，a，m：proteinmaker；1，2，纯化的重组蛋白。b，m：proteinmaker；1，prv阴性血清；2，prv阳性血清。
具体实施方式
实施例1
1实验材料和方法
1.1试剂材料
flycut®ecori，flycut®ncoi，easypure®quickgelextractionkit，easypure®plasmidminiprepkit(em101)，agarose，gelstain，bl21(de3)chemicallycompetentcell，proteinruler®ii(12-120kda)，iptg，his标签单抗和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔或羊抗鼠抗体等均购自北京全式金有限公司。由上海甲干生物科技有限公司购买新西兰大白兔(2kg)。
和gc抗原表位基因的扩增
根据genbank中登录的prv参考株becker序列(jf797219.1)设计gb和gc抗原表位基因pcr扩增的引物，以分离的新型伪狂犬病病毒fj-2012株的核酸为模板进行pcr扩增，将扩增产物送生工生物（上海）工程有限公司进行测序，从而获得fj-2012株gb和gc抗原表位基因序列。pcr所用的引物由生工生物（上海）工程有限公司合成，即：
gb-f：5’-gcggccgtgacgcgggcc-3’，
gb-r：5’-gacgtagaagcggtcccgctcg-3’。
gc-f：5’-tactttgacgagcccccgcg-3’，
gc-r：5’-gaaggcggcgtccaccg’。
重组表达载体的构建
根据fj-2012毒株gb和gc抗原表位基因序列，设计gb-gc基因串联编码序列，并进行密码子的优化，由上海生工公司合成gb-gc基因串联片段，并将该片段插入pet-28a 载体上的ncoi、ecori两酶切位点间，构建重组质粒。将该重组质粒转入bl21(de3)感受态细胞中，根据质粒抽提试剂盒的说明书提质粒，用质粒作为模板进行pcr和双酶切（ncoi、ecori）验证，并将重组质粒送生工生物（上海）工程有限公司进行测序。pcr所用的引物由生工生物（上海）工程有限公司合成，即：
f：5’-cccaatccatggccgcagcagttacccgtgcag-3’，
r：5’-cccaatgaattcggaaacgcggcatcaaccgga-3’。
表位串联重组蛋白的诱导表达及纯化
双酶切及pcr验证均正确的单克隆菌落，用含卡那霉素50µg/ml的lb培养基过夜培养（200rpm，37℃）。按1％的比例接种至新鲜的lb培养基（含卡那霉素50µg/ml）中，37℃振荡（200rpm）培养至od600为0.6时，加入iptg至终浓度为0.5mmol/l，37℃诱导表达目的蛋白。在iptg诱导2h、4h和6h时分别取500µl培养基，3000×g离心5min收集菌沉淀，加入适量的1×sdsloadingbuffer重悬菌液，沸水浴中煮10min，12000×g离心10min×取8µl上清，用12%sds-page、抗his标签抗体进行westernblot检测目的蛋白的表达。使用ni-nta纯化柱纯化重组目的蛋白，bca法测定复性后的重组蛋白浓度。
表位串联体蛋白反应原性分析
纯化后的蛋白经12%sds-page分离后，电转移至pvdf膜上，以prv阳性兔多抗血清为一抗（1:1000），hrp标记的羊抗兔igg为二抗（1:2000）进行western-blot鉴定gb-gc重组蛋白的反应原性。
表位串联体蛋白免疫原性分析
500μggb-gc重组蛋白与等量弗氏完全佐剂混合乳化后，将其接种到新西兰家兔体内（皮下多点），免疫前取血作为阴性对照血清。免疫后第2周、第4周，分别用约500μg纯化gb-gc重组蛋白与等体积弗氏不完全佐剂混匀，加强免疫2次。最后一次免疫后7天，心脏采血并分离血清，于-80℃保存备用。
间接elisa法测定多克隆抗体效价：终浓度1µg/ml纯化的gb-gc重组蛋白包被96孔板，4℃过夜；洗板，5%脱脂乳封闭1h；加入兔抗阳性血清（1:100-1:12800)及阴性对照血清（含三重复），37℃孵育1h；洗板，加入hrp标记的羊抗兔igg抗体（1:3000），37℃孵育1h；洗板，加显色液，避光作用10min，加终止液，450nm波长处测吸光度。
结果
2.1fj-2012株表位基因的扩增测序
以伪狂犬病病毒fj-2012株的核酸为模板，针对gb和gc蛋白的抗原位点基因分别进行pcr扩增，其产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图1，可见到明显的目的条带，与预期的条带（204bp和405bp）大小一致。将条带回收送去测序，测序的结果显示序列如seqidno.3-4，对获得的fj-2012株gb和gc蛋白的抗原位点基因序列进行密码子拼接和优化，优化后用于表达的目的基因序列与原基因序列比较如图2所示，优化后序列如seqidno.2所示。
表位串联表达重组载体构建
构建的gb-gc-pet28a重组质粒，转化t1感受态细胞后，挑取克隆，摇菌并抽质粒，用抽取的质粒做模板，进行pcr，其产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图3，可见到明显的目的条带，与预期的条带（609bp）大小一致。将抽取的质粒用ncoi、ecori进行双酶切，酶切后产物跑胶，可见到预期的条带。将抽取的质粒送去测序，测序的结果显示(图4-5)，峰形单一，说明测序的结果较好，与预期的gb-gc片段进行比对，比对率为100%，说明gb-gc-pet28a（ ）重组质粒构建成功。
重组蛋白的诱导表达
将得到的重组质粒gb-gc-pet-28a（ ）转入bl21(de3)中，经iptg诱导2h，4h，6h后，收集细菌沉淀并裂解，sds-page胶显示在约25-27kda处有一条明显的重组蛋白条带（图6a），且wb实验也表明在25-27kda处有特异性条带（图6b）。表明gb-gc重组蛋白在bl21(de3)中有表达。重组蛋白序列如seqidno.1所示。
.4蛋白的纯化及免疫原性分析
经超声破碎菌沉淀后得到重组蛋白的包涵体，用含8mol/l的尿素将其溶解，ni-ntaresin纯化的蛋白如图7a所示。在26-27kda处，prv阳性血清出现一条特异性条带（图7b），说明该重组蛋白能够被prv阳性血清特异性识别。
抗体效价是抗体质量的重要指标，表明有效的抗体浓度。使用浓度为1µg/ml纯化重组蛋白包被elisa板，进行间接elisa，当血清的od450值/阴性od450值＞2.1且od450值＞0.3时，认为该血清是阳性血清。由表1可知，制备的兔多克隆抗体的效价可以达到1:6400。
表1以重组蛋白作为elisa包被抗原检测相应抗血清效价
本申请通过将gb、gc表位串联体插入表达载体pet-28a（ ）克隆位点，构建串联体表达重组载体，并转入bl21（de3）中，iptg对其诱导表达，结果表明有效表达了gb、gc表位串联蛋白。westernblot结果显示，gb、gc表位串联蛋白能与prv阳性血清发生特异性反应，新西兰家兔免疫试验结果表明gb、gc表位串联蛋白刺激兔机体产生prv特异性抗性。这些试验结果表明，gb、gc表位串联体蛋白具有较好的免疫学活性。
本申请构建含prvgb、gc表位的串联表达载体，转化大肠杆菌表达系统进行诱导表达，获得具有良好表达特性和免疫活性的表位串联重组蛋白，为prv新型疫苗的研制奠定一定基础。利用大肠杆菌体外表达prvgb、gc表位串联重组蛋白，生产工艺简单，表达的重组蛋白有良好免疫反应原性和抗原性，表达量较其他方式培养表达量高，具有良好的应用前景。为了阐明prv-gb-gc免疫仔猪减少病毒传播的机制，在今后的研究中需开展细胞免疫相关的研究。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
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<110>福建省农业科学院畜牧兽医研究所
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gcagttgttgttgaaggtggtcgcgccaccgtggcaaatgttagcggtgaagtttctgtg360
cgtgttgcagccgcagatgcagaaaccgaaggtgtttatacctggcgtgttctgtcagca420
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1.一种伪狂犬病病毒gb-gc表位串联体，其特征在于：所述表达串联体其氨基酸序列如seqidno.1所示。
2.一种编码权利要求1所述伪狂犬病病毒gb-gc表位串联体的基因，其特征在于：所述基因序列如seqidno.2所示。
3.如权利要求1所述的伪狂犬病病毒gb-gc表位串联体在制备prv诊断试剂盒及疫苗中的应用。
技术总结