本发明属于生物检测领域。尤其涉及一种高性能红色camp（环磷酸腺苷）荧光探针，及其在活细胞中检测camp浓度的应用。
背景技术：
环磷酸腺苷(camp)，是目前最大药物靶标g蛋白偶联受体(gpcr)家族的下游信使分子，细胞及活体水平的camp荧光成像是gpcr信号通路的基础研究和药物开发的重要方向。活细胞中camp荧光成像，是将camp荧光探针表达在细胞中，然后利用荧光显微镜检测探针荧光的强度变化。荧光探针是camp荧光成像分析的关键。camp荧光探针主要分为基于荧光蛋白的荧光共振能量转移探针及基于单个荧光蛋白的探针，后者动态范围较前者大且使用简单。
近几年，国际上知名实验室利用不同荧光蛋白、不同camp感应模块及不同的融合位点，开发了不同性能和光谱的camp单荧光蛋白探针（见表1），包括tetsuyakitaguchi博士开发的flamindo/flamindo2/pinkflamindo探针、annemariequinn博士开发的caddis/redcaddis探针、kazukihorikawa博士开发的r-flinca探针及justinblau博士开发的campr探针。
表1不同性能和光谱的camp单荧光蛋白探针汇总。
目前，基于单个荧光蛋白的camp探针分为绿色和红色2小类，前者主要有flamindo2、caddis及campr，后者主要有pinkflamindo、redcaddis及r-flinca。对于绿色camp探针，我们已开发更高性能的探针g-flamp1(201911251920.x和202010354936.x)。相较于短波长的绿色探针，长波长的红色探针具有诸多优点：（1）红色探针能够与已有的大量绿色探针或者蓝光敏感的工具蛋白联合使用；（2）红色探针具有更低的荧光背景干扰、更小的光毒性和更深的组织穿透能力。但是，现有的红色探针具有以下不足：（1）在37°c培养哺乳动物细胞中亮度很低(如pinkflamindo/r-flinca)，不利于细胞的定位和神经元树突等微小细胞结构的观察；（2）在37°c培养哺乳动物细胞中动态范围（荧光亮度变化幅度δf/f0）很小(如pinkflamindo/r-flinca)，严重影响检测灵敏度；(3)有些探针表达差，如r-flinca在哺乳动物细胞中较长时间表达会形成斑点。
综上所述，本发明开发高性能红色camp荧光探针，提高其在实际应用中的亮度和动态范围，对于提高探测灵敏度具有重要意义。
技术实现要素：
针对上述技术问题，本发明提供一种高性能红色camp（环磷酸腺苷）荧光探针r-flamp1m，及其在活细胞中检测camp浓度的应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
本发明提供了一种camp荧光探针r-flamp1m具有氨基酸序列seqidno:1。
本发明所述的r-flamp1m具有如式ⅰ所示结构：
his-mapple-n—连接肽1—mepacl—连接肽2—mapple-c（式ⅰ）。
其中，
所述his为his标签(即histag)，其氨基酸序列为seqidno:2。
所述mapple-n的氨基酸序列为seqidno:3。
所述连接肽1（linker1）的氨基酸序列为seqidno:4。
所述mepacl的氨基酸序列为seqidno:5。
所述连接肽2（linker2）的氨基酸序列为seqidno:6。
所述mapple-c的氨基酸序列为seqidno:7。
作为本发明的优选方案，所述的氨基酸序列还包括经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与所述的氨基酸序列功能相同或者相似的氨基酸序列；所述的氨基酸序列为至少具有80%同源性的氨基酸序列。
本发明所述的camp荧光探针r-flamp1m在活细胞和动物活体中的应用，具体为用于成像检测方法，尤其是双光子成像方法。
进一步的，本发明所述的camp荧光探针r-flamp1m可以用于活动物体的camp信号检测。
进一步的，本发明所述的camp荧光探针r-flamp1m可以用于hek293t细胞中camp浓度检测。
进一步的，本发明所述的camp荧光探针r-flamp1m可以用于溶液中camp浓度检测。
本发明的有益效果。
本发明的探针为红色camp探针r-flamp1m，其在pinkflamindo基础上优化。发明人开发的r-flamp1m探针，37℃生理温度培养细胞中，r-flamp1m在560nm单光子激发下，动态范围（δf/f0）约为5，在1000nm双光子激发下，动态范围（δf/f0）约为8；r-flamp1m最适激发波长约560nm，最大发射波长约600nm，从表1可知数据可见，r-flamp1m是目前动态范围最大的红色camp探针。
相较于目前已有的荧光探针，本发明中的r-flamp1m有以下优点：（1）与绿色camp探针相比，r-flamp1m是红色探针，而红色探针能够与已有的大量绿色探针或者蓝光敏感的工具蛋白联合使用，可同时进行双色成像或者进行光学控制/荧光成像联用；（2）在37℃培养细胞中，r-flamp1m的荧光亮度是现有红色camp探针pinkflamindo及r-flinca的10倍以上，且具有更大的动态范围(δf/f0~5)，即具有更高的检测灵敏度。
附图说明
下面结合附图对本发明进一步说明。
图1.r-flamp1m的结构设计示意图。
图2.纯化r-flamp1m探针的荧光光谱和亲和力。
图3.相同转染浓度和相同成像条件下，pink-flamindo、r-flinca和r-flamp1m在hek293t细胞中的亮度比较。
图4.单光子激发下，不同探针在hek293t细胞中的响应。
图5.双光子激发下，r-flamp1m探针在hek293t细胞中的响应。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
以下结合具体实施例对本发明的实现进行详细的描述。
本实施例的附图中相同或相似的标号对应相同或相似的部件；在本发明的描述中，需要理解的是，若有术语“上”、“下”、“左”、“右”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此附图中描述位置关系的用语仅用于示例性说明，不能理解为对本专利的限制，对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语的具体含义。
参照图1-5所示，为本发明提供的较佳实施例。
下面结合具体实施方式对本发明做详细的说明。
本发明公开的camp荧光探针r-flamp1m，及其作为红色荧光探针在活细胞和动物活体中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容范围内对本发明所述的方法和应用进行改动或适当改变与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明所用术语“荧光探针”是指与荧光蛋白相融合的对环境camp敏感的多肽，所述对环境中camp敏感的多肽具体可以是mepac1蛋白，利用mepac1中特异性的camp结合结构域与camp结合后产生的构象变化引起荧光蛋白的构象变化，从而导致产生的荧光发生改变，通过不同camp浓度下测定的荧光蛋白的荧光来绘制标准曲线，进而用于检测并分析细胞内camp的存在水平。
本发明提供了一种camp荧光探针r-flamp1m包括：对camp敏感的蛋白结构域和红色荧光蛋白；r-flamp1m氨基酸序列见seqidno:1，r-flamp1m的结构设计示意图见图1，其中，氨基酸序列中氨基酸序列号1-37为his标签(histag)部分,38-188为荧光蛋白mapple的氨基端部分，189-191为连接肽1，192-340为感应模块部分mepac1(205-353)，341-344为连接肽2，345-428为红色荧光蛋白mapple的羧基端部分。
本发明所述的camp荧光探针的检测方法，包括：
（1）以能够结合camp的mepac1为感应结构域，与mapple荧光蛋白通过图1所示方式连接，经过若干氨基酸突变，即得到r-flamp1m探针。
（2）将r-flamp1m探针表达在细菌中，室温培养3天收集菌体，在ph=7.2的hepes缓冲液(含150mmkcl及50mmhepes)中超声破碎，利用hispurcobaltresin（购自皮尔斯公司）纯化探针，并通过econo-pac10dg脱盐柱（购自美国bio-rad公司）将探针溶解于在ph=7.2的hepes缓冲液中，用bca试剂盒（购自美国thermoscientific公司）测定探针浓度；取2μm探针溶液，利用多功能酶标仪infinitem1000pro检测探针对饱和浓度camp(500μm)的响应，可见其信号增加19倍，具体结果见图2，其中（a）从细菌中纯化的r-flamp1m探针稀释在ph7.2的hepes溶液中(终浓度为2μm)，然后加入饱和浓度camp（500μm）；其荧光激发和发射光谱如图示意，虚线为激发谱，实线为发射谱；（b）2μm纯化探针与不同浓度camp或者cgmp混合，其荧光变化如图所示，由曲线可知，r-flamp1m与camp亲和力约2μm，与cgmp亲和力约35μm。然而pinkflamindo对camp/cgmp亲和力分别为3.2μm/22μm。由此可见，本发明的荧光探针对camp亲和有所提高，更加适合低浓度camp的检测；另一方面，对cgmp亲和力有所降低，可见本发明的荧光探针的特异性更好。
（3）r-flamp1mhek293t细胞需培养在玻璃底的培养皿中，培养基为含10%胎牛血清和1%penicillin-streptomycin的dmem，培养温度为37℃，co2含量为5%。细胞密度为60%左右时，用lipofectamine2000试剂盒转染相同质量的红色探针pink-flamindo、r-flinca及r-flamp1m的质粒。约24小时后，相同成像条件（激发波长、发射波长、激发光强度和成像时间等均相同）下，pink-flamindo、r-flinca及r-flamp1m在hek293t细胞中的亮度，具体结果见图3，其中（a）为r-flamp1m的细胞成像图；（b）为pink-flamindo的细胞成像图；（c）为r-flinca的细胞成像图；（d）为a/b/c图中细胞亮度平均值的归一化柱状图。
（4）r-flamp1mhek293t细胞需培养在玻璃底的培养皿中，培养基为含10%胎牛血清和1%penicillin-streptomycin的dmem，培养温度为37℃，co2含量为5%。细胞密度为60%左右时，用lipofectamine2000试剂盒转染campr、flamindo2、g-flamp1、pink-flamindo、r-flinca及r-flamp1m。过夜培养后，用不含血清和酚红的培养基（购自gibco公司）饥饿细胞2到4小时，将培养基换为无色透明的livecellimagingbuffer，采用本实验室自行搭建的ix83单光子荧光显微镜（r-flamp1m激发波长560nm左右，最大发射波长600nm左右）或商业化双光子（r-flamp1m激发波长1000nm左右，最大发射波长600nm左右）显微镜进行成像分析。成像频率为15s/scan，在第十帧加入forskolin（购自碧云天生物技术公司），forskolin终浓度为60μm（例：培养皿中有500微升livecellimagingbuffer，将4微升12mm的母液溶于300微升livecellimagingbuffer中，第十帧时将稀释好的300微升forskolin溶液滴入正在成像的细胞皿中）。forskolin刺激后，细胞中campr、flamindo2、g-flamp1、pink-flamindo、r-flinca及r-flamp1m荧光强度的变化，见图4，其中，（a）和（b）为利用lipofectamine转染hek293t细胞含campr、flamindo2、pink-flamindo、r-flinca探针的质粒，过夜培养后，用不含酚红及血清的dmem细胞培养液饥饿4小时后，用60μmforskolin刺激后荧光亮度变化；（c）为r-flamp1m和阴性对照探针r-flamp1mr279e的响应；激发波长为560nm±20nm；曲线数据表示：平均值±标准差，标尺：100μm。
利用lipofectamine转染hek细胞含r-flamp1m探针的质粒，过夜培养后，用不含酚红及血清的dmem细胞培养液饥饿4小时后，双光子激发波长为1000nm条件下，用60μmforskolin刺激后荧光亮度变化，结果见图5，曲线数据表示：平均值±标准差，标尺：100μm。
至此，完成了哺乳动物细胞内camp浓度变化的荧光成像步骤。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>中国科学院深圳先进技术研究院
<120>高性能红色camp荧光探针及其应用
<160>7
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>428
<212>prt
<213>camp荧光探针r-flamp1m(428)
<400>1
metglyserhishishishishishisglymetalasermetthrgly
151015
glyglyglymetglyalaalaleuthralaalaalaalaleualapro
202530
glyglyglyglysermetleuvalserleuglyglyglyalaalamet
354045
alaileileleuglyprometalaproleuvalhismetglyglyser
505560
valalaglyhisglyproglyileglyglyglyglyglyglyalapro
65707580
thrglyalaproglythralaleuleuleuvalthrleuglyglypro
859095
leuproproalathralaileleuserproglyprometthrglyser
100105110
leualaproileleuhisproalaalaileproalathrproleugly
115120125
serproproglyglyproalathrglyalavalmetalaproglyala
130135140
glyglyileilehisvalalaglyalaserserleuglyalaglythr
145150155160
proilethrleuvalleuleualaglythralaproproproalagly
165170175
provalmetglyleuleuthrmetglythrglyglythralaalapro
180185190
proleuleuserglyalaglyproalaalaleuleuthrvalalaleu
195200205
alaleuproproglyglyalathralaglyglyleualaleuilepro
210215220
glyglyleuleuhisileleualavalalahisleuseralaserval
225230235240
leualaglyleualaalavalleuleuproglyprohisserleuala
245250255
glythrvalleuproserglyglyalaleuglythrserthrthrile
260265270
ilethrleuglyservalalavalvalthrhisglyleuglyleuval
275280285
thrthrleuhisglyglyalaalaproglyglyleualaleuvalala
290295300
alaalaproalaalaalathrileileleualaglyalaalacyshis
305310315320
proleualavalalaleuglyalaproalaalaileileleualaval
325330335
glyproleuvalglythrvalalaglymetmetthrproglyalagly
340345350
alaleuleuserglyileleuleualaleualaleuleualaglygly
355360365
histhralacysleuvalleuthrthrthrleualaleuleuproval
370375380
glyleuproglyalathrilevalalaileleuleualailevalser
385390395400
hisalaglyalathrthrilevalglyglycysglyalaalaglyala
405410415
alahisserthrglyglymetalaglyleuthrleu
420425
<210>2
<211>37
<212>prt
<213>histag(37)
<400>2
metglyserhishishishishishisglymetalasermetthrgly
151015
glyglyglymetglyalaalaleuthralaalaalaalaleualapro
202530
glyglyglyglyser
35
<210>3
<211>151
<212>prt
<213>mapple-n(151)
<400>3
metleuvalserleuglyglyglyalaalametalaileileleugly
151015
prometalaproleuvalhismetglyglyservalalaglyhisgly
202530
proglyileglyglyglyglyglyglyalaprothrglyalaprogly
354045
thralaleuleuleuvalthrleuglyglyproleuproproalathr
505560
alaileleuserproglyprometthrglyserleualaproileleu
65707580
hisproalaalaileproalathrproleuglyserproproglygly
859095
proalathrglyalavalmetalaproglyalaglyglyileilehis
100105110
valalaglyalaserserleuglyalaglythrproilethrleuval
115120125
leuleualaglythralaproproproalaglyprovalmetglyleu
130135140
leuthrmetglythrglygly
145150
<210>4
<211>3
<212>prt
<213>linker1(3)
<400>4
thralaala
1
<210>5
<211>149
<212>prt
<213>mepacl(149)
<400>5
proproleuleuserglyalaglyproalaalaleuleuthrvalala
151015
leualaleuproproglyglyalathralaglyglyleualaleuile
202530
proglyglyleuleuhisileleualavalalahisleuseralaser
354045
valleualaglyleualaalavalleuleuproglyprohisserleu
505560
alaglythrvalleuproserglyglyalaleuglythrserthrthr
65707580
ileilethrleuglyservalalavalvalthrhisglyleuglyleu
859095
valthrthrleuhisglyglyalaalaproglyglyleualaleuval
100105110
alaalaalaproalaalaalathrileileleualaglyalaalacys
115120125
hisproleualavalalaleuglyalaproalaalaileileleuala
130135140
valglyproleuval
145
<210>6
<211>4
<212>prt
<213>linker2(4)
<400>6
glythrvalala
1
<210>7
<211>84
<212>prt
<213>mapple-c(84)
<400>7
glymetmetthrproglyalaglyalaleuleuserglyileleuleu
151015
alaleualaleuleualaglyglyhisthralacysleuvalleuthr
202530
thrthrleualaleuleuprovalglyleuproglyalathrileval
354045
alaileleuleualailevalserhisalaglyalathrthrileval
505560
glyglycysglyalaalaglyalaalahisserthrglyglymetala
65707580
glyleuthrleu
1.一种camp荧光探针r-flamp1m，其特征在于，所述的荧光探针r-flamp1m具有氨基酸序列seqidno:1；
所述的氨基酸序列还可以是seqidno:1经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与所述的氨基酸序列功能相同或者相似的氨基酸序列；所述的氨基酸序列为至少具有80%同源性的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的camp荧光探针r-flamp1m，其特征在于，所述的荧光探针r-flamp1m包括his、mapple-n、连接肽1、mepacl、连接肽2和mapple-c。
3.根据权利要求2所述的camp荧光探针r-flamp1m，其特征在于，所述的his为his标签(即histag)，其氨基酸序列为seqidno:2；
所述的氨基酸序列还可以是seqidno:2经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与所述的氨基酸序列功能相同或者相似的氨基酸序列；所述的氨基酸序列为至少具有80%同源性的氨基酸序列。
4.根据权利要求2所述的camp荧光探针r-flamp1m，其特征在于，所述的mapple-n氨基酸序列为seqidno:3；
所述的氨基酸序列还可以是seqidno:3经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与所述的氨基酸序列功能相同或者相似的氨基酸序列；所述的氨基酸序列为至少具有80%同源性的氨基酸序列。
5.根据权利要求2所述的camp荧光探针r-flamp1m，其特征在于，所述的连接肽1（linker1）氨基酸序列为seqidno:4；
所述的氨基酸序列还可以是seqidno:4经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与所述的氨基酸序列功能相同或者相似的氨基酸序列；所述的氨基酸序列为至少具有80%同源性的氨基酸序列。
6.根据权利要求2所述的camp荧光探针r-flamp1m，其特征在于，所述的mepacl氨基酸序列为seqidno:5；
所述的氨基酸序列还可以是seqidno:5经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与所述的氨基酸序列功能相同或者相似的氨基酸序列；所述的氨基酸序列为至少具有80%同源性的氨基酸序列。
7.根据权利要求2所述的camp荧光探针r-flamp1m，其特征在于，所述的连接肽2（即linker2）氨基酸序列为seqidno:6；
所述的氨基酸序列还可以是seqidno:6经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与所述的氨基酸序列功能相同或者相似的氨基酸序列；所述的氨基酸序列为至少具有80%同源性的氨基酸序列。
8.根据权利要求2所述的camp荧光探针r-flamp1m，其特征在于，所述的mapple-c氨基酸序列为seqidno:7；
所述的氨基酸序列还可以是seqidno:7经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与所述的氨基酸序列功能相同或者相似的氨基酸序列；所述的氨基酸序列为至少具有80%同源性的氨基酸序列。
9.根据权利要求2所述的camp荧光探针r-flamp1m在活细胞和动物活体中的应用，具体为用于成像检测方法，尤其是双光子成像方法。
10.根据权利要求1所述的camp荧光探针r-flamp1m的应用，其特征在于，用于活动物体的camp信号检测、用于hek293t细胞中camp浓度检测或用于溶液中camp浓度检测。
技术总结