本发明属于生物医药领域，涉及一种新型重组免疫细胞因子的制备。本发明还提供了该新型的重组免疫细胞因子及其应用。
背景技术：
肿瘤发生和发展都伴随着对免疫系统的入侵，免疫功能不全的个体常常有较高的癌症发生率和较差的愈后。因此研究者都投入大量的时间精力提高癌症患者的免疫功能，包括给予免疫刺激性的细胞因子治疗，如ifn-gamma、il-2等；利用树突细胞（dccell）为基础的疫苗来激活免疫系统以提高内源性免疫反应；利用自体癌症特异性细胞毒性t细胞（ctls）激活和扩增的过继细胞转移治疗；或者改造t细胞使其表达嵌合抗原受体用以识别肿瘤细胞特异性抗原等。
细胞表面的pd-1受体与其配体pd-l1和pd-l2结合，可以抑制t细胞增殖和细胞因子的生成。部分肿瘤细胞的pd-1配体上调，通过这个通路信号传导可抑制激活的t细胞对肿瘤的免疫监视。白细胞介素-2(il-2)是免疫系统中一种细胞因子信号分子,蛋白分子量为15.5-16kda。il-2主要来源于活化的cd4 t细胞、活化的cd8 t细胞、nk细胞、树突状细胞和巨噬细胞，可通过与淋巴细胞表面的il-2受体结合来调节其作用。il-2通过对t细胞的直接作用，影响免疫系统的关键功能。t细胞在胸腺发育成熟的过程，il-2可促进某些未成熟的t细胞分化为调节性t细胞来预防自身免疫性疾病；当最初的t细胞受抗原刺激时，il-2还能促进t细胞分化为效应t细胞和记忆细胞，发挥免疫反应。
技术实现要素：
本发明的目的是制备出一种可以靶向pd-l1的单链抗体与il-2分子融合细胞因子，可以促进多种免疫细胞的快速扩增，克服免疫抑制。
本发明的另一个目的是提供上述融合细胞因子的应用。
本发明采用基因工程技术，将靶向pd-l1的单链抗体（scfv）与il-2细胞分子融合表达，构建出了一种新型的重组免疫细胞因子il-2-pd-l1。目的是使重组免疫细胞因子il-2-pd-l1能特异性靶向肿瘤区域，避免非特异性结合导致的血管毒性；同时阻断pd-1/pd-l1结合，使机体的适应性免疫协同特异性免疫，激活t细胞，b细胞等多种淋巴细胞，释放il-2细胞因子，以期达到对抗原表达量低、单用抗体效果不明显肿瘤的更好治疗效果，同时制备的新型的细胞因子可以促进不同类型的免疫细胞的快速扩增，并且克服了免疫抑制。
本发明提供了一种重组免疫细胞因子，该重组免疫细胞因子同时表达il-2和识别pd-l1的抗体。
所述的il-2和识别pd-l1的抗体的序列可以从本领域熟知的数据库或者网站中获知，然后通过人工合成或者基因工程方法制备相应的生物分子。
较好的，所述的识别pd-l1的抗体为pd-l1-scfv，pd-l1-scfv的氨基酸序列如seqidno4所示。
所述的含有il-2的氨基酸序列如seqidno2所示。
在本发明的一个优选实施例中，将该重组细胞因子简称为il-2-pd-l1。含有il-2的核酸编码序列如seqidno1所示，其中除了il-2，还有linker（连接物）和酶切位点的核酸编码序列。pd-l1-scfv的核酸序列如seqidno3所示，其中除了scfv还有酶切位点的序列。
另一方面，本发明提供了所述的重组免疫细胞因子的制备方法，将表达il-2和pd-l1-scfv的核酸编码序列同时装入表达载体，表达获得靶向pd-l1的单链抗体与il-2分子的融合细胞因子。
本发明经过反复优化序列和实验步骤，获得了具有双功能的活性较好的重组免疫细胞因子。
具体的，所述的制备方法包括以下步骤：
（1）制备含有il-2编码序列的核酸分子；
（2）制备含有pd-l1-scfv编码序列的核酸分子；
（3）将步骤（1）获得的含有il-2编码序列的核酸分子和（2）获得的含有scfv编码序列的核酸分子同时装入表达载体；
（4）将步骤（3）获得的表达载体转入宿主细胞，进行表达；
（5）收集蛋白；
（6）分离获得表达产物；
（7）筛选阳性克隆，获得靶向pd-l1的单链抗体与il-2分子的融合细胞因子。
上述步骤不一定按照上述顺序，可以按照实际情况调整。
其中，含有il-2编码序列的核酸分子的序列如seqidno1所示；含有scfv编码序列的核酸分子的序列如seqidno3所示。
再一方面，本发明还提供了重组免疫细胞因子的应用，所述的重组免疫细胞因子在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
本发明的细胞因子也可以与其他治疗肿瘤的药物或者药学上可接受的辅料组合、联用，增强对肿瘤细胞的作用。
重组免疫细胞因子il-2-pd-l1能特异性靶向肿瘤区域，避免非特异性结合导致的细胞毒性；同时阻断pd-1/pd-l1结合，使机体的适应性免疫协同特异性免疫，激活多种淋巴细胞，提高免疫系统对肿瘤细胞的识别敏感性，同时制备的新型的细胞因子可以促进不同类型的免疫细胞的快速扩增，并且获得的免疫细胞克服了免疫抑制。
较好的，所述的重组免疫细胞因子靶向pd-l1的单链抗体与il-2分子融合细胞因子。
在本发明的一个优选实施例中，所述的重组免疫细胞因子促进免疫细胞的体外增殖，包括nk细胞，til细胞，cd4 t，cd8 t细胞。尤其是对于后两种细胞，促进免疫细胞增殖的效果更加明显。
本发明中采用基因工程技术，将靶向pd-l1的scfv与il-2分子融合，构建新型重组免疫细胞因子il-2-pd-l1-scfv。重组细胞因子的表达不仅与细胞因子的编码序列相关，与开放阅读框之外的各种转录因子、连接物以及载体的序列也息息相关，本发明经过反复调整序列，优化制备方法，终于获得了具有较好效果的重组细胞因子。本发明的方法较简便，成本较低，可以解决目前免疫细胞的扩增效率问题，同时克服了免疫抑制的肿瘤微环境，有利于免疫细胞发挥杀伤肿瘤细胞的活性和潜能。
附图说明
图1不同浓度的重组免疫细胞因子il-2-pd-l1-scfv对不同类型的免疫细胞免疫激活和扩增的效果；
图2为il-2核酸分子的结构设计；
图3是pd-l1-scfv的核酸序列结构设计。
具体实施方式
实施例1
il-2和pl-1单链抗体（pd-l1-scfv）表达质粒的合成和构建
从ncbi的数据库中获取il-2和pd-l1-scfv的核酸和氨基酸序列，采用全基因合成的方法分别合成il-2和pd-l1-scfv分子，然后将获得的il-2和pd-l1-scfv分子分别通过双酶切的方法构建入pcdna3.1分子中，将获得转染阳性的菌种扩大培养，采用无内毒素质粒大抽试剂盒提取pcdna3.1-il-2-pd-l1-scfv分子的质粒。不同浓度的重组免疫细胞因子il-2-pd-l1-scfv对不同类型的免疫细胞免疫激活和扩增的效果图1。
其中，每一种细胞从左到右均采用0.1μg/ml、1.0μg/ml和10μg/ml三种浓度的细胞因子处理。
对cd4 t细胞而言，细胞因子10μg/ml组细胞增殖速度显著大于细胞因子1.0μg/ml组。
对cd8 t细胞而言，细胞因子10μg/ml组细胞增殖速度显著大于细胞因子1.0μg/ml组，细胞因子1.0μg/ml组细胞增殖速度显著大于细胞因子0.1μg/ml组。细胞因子0.1μg/ml组与不加细胞因子的差别不显著。
经过优化和筛选，本发明采用的具体il-2-pd-l1-scfv的序列如下：
核酸序列:(酶切位点 il-2 linker)，seqidno1,
gaattcgccgccaccatggagttcggactcagttggctgttcctggtgatggcggcccctgctctgtcctggcgtctgcccctcctcatcctcctcctgcccctggctacctcttgggcatctgcagcggtgaatggcacttcccagttcacatgcttctacaactcgagagccaacatctcctgtgtctggagccaagatggggctctgcaggacacttcctgccaagtccatgcctggccggacagacggcggtggaaccaaacctgtgagctgctccccgtgagtcaagcatcctgggcctgcaacctgatcctcggagccccagattctcagaaactgaccacagttgacatcgtcaccctgagggtgctgtgccgtgagggggtgcgatggagggtgatggccatccaggacttcaagccctttgagaaccttcgcctgatggcccccatctccctccaagttgtccacgtggagacccacagatgcaacataagctgggaaatctcccaagcctcccactactttgaaagacacctggagttcgaggcccggacgctgtccccaggccacacctgggaggaggcccccctgctgactctcaagcagaagcaggaatggatctgcctggagacgctcaccccagacacccagtatgagtttcaggtgcgggtcaagcctctgcaaggcgagttcacgacctggagcccctggagccagcccctggccttcaggacaaagcctgcagcccttgggaaggacaccattccgtggctcggccacctcctcgtgggcctcagcggggcttttggcttcatcatcttagtgtacttgctgatcaactgcaggaacaccgggccatggctgaagaaggtcctgaagtgtaacaccccagacccctcgaagttcttttcccagctgagctcagagcatggaggagacgtccagaagtggctctcttcgcccttcccctcatcgtccttcagccctggcggcctggcacctgagatctcgccactagaagtgctggagagggacaaggtgacgcagctgctcctgcagcaggacaaggtgcctgagcccgcatccttaagcagcaaccactcgctgaccagctgcttcaccaaccagggttacttcttcttccacctcccggatgccttggagatagaggcctgccaggtgtactttacttacgacccctactcagaggaagaccctgatgagggtgtggccggggcacccacagggtcttccccccaacccctgcagcctctgtcaggggaggacgacgcctactgcaccttcccctccagggatgacctgctgctcttctcccccagtctcctcggtggccccagccccccaagcactgcccctgggggcagtggggccggtgaagagaggatgcccccttctttgcaagaaagagtccccagagactgggacccccagcccctggggcctcccaccccaggagtcccagacctggtggattttcagccaccccctgagctggtgctgcgagaggctggggaggaggtccctgacgctggccccagggagggagtcagtttcccctggtccaggcctcctgggcagggggagttcagggcccttaatgctcgcctgcccctgaacactgatgcctacttgtccctccaagaactccagggtcaggacccaactcacttggtgtagggctcctcctcctcctccggctcctcctcctcctgggccctggtggccggcctgctgctgctgctgctgctggccgccgcctgcgccgtgttcctg。
il-2核酸分子的结构设计见图2，单下划线是酶切位点，双下划线且斜体部分是linker，两者之间为il-2。
对应的氨基酸序列,seqidno2,
maapalswrlpllilllplatswasaavngtsqftcfynsraniscvwsqdgalqdtscqvhawpdrrrwnqtcellpvsqaswacnlilgapdsqklttvdivtlrvlcregvrwrvmaiqdfkpfenlrlmapislqvvhvethrcnisweisqashyferhlefeartlspghtweeaplltlkqkqewicletltpdtqyefqvrvkplqgefttwspwsqplafrtkpaalgkdtipwlghllvglsgafgfiilvyllincrntgpwlkkvlkcntpdpskffsqlssehggdvqkwlsspfpsssfspgglapeisplevlerdkvtqlllqqdkvpepaslssnhsltscftnqgyfffhlpdaleieacqvyftydpyseedpdegvagaptgsspqplqplsgeddayctfpsrddlllfspsllggpsppstapggsgageermppslqervprdwdpqplgpptpgvpdlvdfqpppelvlreageevpdagpregvsfpwsrppgqgefralnarlplntdaylslqelqgqdpthlvgsssssgssss。
pd-l1-scfv序列如下：（pd-l1-scfv 酶切位点）
核酸序列,seqidno3,
atggagttcggactcagttggctgttcctggtggccatcctgaagggtgtgcagtgtgaggtgcagctgcagcagtccggccccgagctgaagaagcccggcgagaccgtgaagatctcctgcaaggcctccggctacaccttcaccaactacggcatgaactgggtgaagcaggcccccggcaagggcctgaagtggatgggctggctgaacacctacaccggcgagtccatctaccccgacgacttcaagggccgcttcgccttctcctccgagacctccgcctccaccgcctacctgcagatcaacaacctgaagaacgaggacatggccacctacttctgcgcccgcggcgactacggctacgacgaccccctggactactggggccagggcacctccgtgaccgtgtcctccggcggcggcggctccggcggcggcggctccggcggcggcggctccgacatcgtgatgacccaggccgccccctccgtgcccgtgacccccggcgagtccgtgtccatctcctgccgctcctccaagtccctgctgcacaccaacggcaacacctacctgcactggttcctgcagcgccccggccagtccccccagctgctgatctaccgcatgtccgtgctggcctccggcgtgcccgaccgcttctccggctccggctccggcaccgccttcaccctgtccatctcccgcgtggaggccgaggacgtgggcgtgttctactgcatgcagcacctggagtaccccctgaccttcggcgccggcaccaagctggagctgaagggcggcggctccaagggcccccaccaccaccaccaccacgaggtgtccgccctggagaaggaggtgtccgccctggagaaggaggtgtccgccctggagaaggaggtgtccgccctggagaaggaggtgtccgccctggagaaggcctgagcggccgc。
pd-l1-scfv的核酸序列结构设计见图3，下划线部分为酶切位点。
对应的氨基酸序列,seqidno4,
melglswifllailkgvqcevqlqqsgpelkkpgetvkisckasgytftnygmnwvkqapgkglkwmgwlntytgesiypddfkgrfafssetsastaylqinnlknedmatyfcargdygyddpldywgqgtsvtvssggggsggggsggggsdivmtqaapsvpvtpgesvsiscrssksllhtngntylhwflqrpgqspqlliyrmsvlasgvpdrfsgsgsgtaftlsisrveaedvgvfycmqhleypltfgagtklelkgggskgphhhhhh。
实施例2
pcdna3.1-il-2-pd-l1-scfv的质粒的瞬时转染表达和il-2-pd-l1-scfv蛋白的纯化
1）293细胞的复苏和培养：
复苏293细胞，加入1640培养液 10
