本发明涉及农产品加工领域，具体地，本发明涉及一种亚侧耳降血糖多糖精制加工工艺。
背景技术：
亚侧耳，别名：冬蘑、元蘑(黑龙江)、黄蘑(吉林)，子实体中等至稍大，菌盖直径9-12cm，扁半球形至平展，半圆形或肾形，黄绿色，粘，有短绒毛，边缘光滑，菌肉白色。菌褶稍密，白色带淡黄色，近延生。菌根侧生，很短或近乎没有。秋季生于桦树等阔叶树腐木上，呈覆瓦状丛生。分布在我国河北、黑龙江、吉林、山西、广西、陕西、四川、云南、西藏等地区，是一种多糖含量丰富，可大规模人工栽培的食用菌。亚侧耳多糖具有优异的生物学功能，如抗癌、抗氧化和降血糖等，因此受到人们的广泛关注。
然而，成本低、效率高、安全隐患低的亚侧耳多糖的工业生产方法还需进一步研究。
技术实现要素：
本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：
现有技术中，常采用热水萃取和酒精沉淀相结合的方法进行亚侧耳多糖的少量提取。然而，利用现有技术提取获得的多糖中往往含有大量的糖蛋白或者糖肽，以及其他非功能性的多糖成分，导致亚侧耳多糖的纯度难以保证，仅为35％-80％。进一步地，正是由于利用现有技术提取获得的多糖纯度过低，阻碍了研发人员对亚侧耳多糖生化性质的深入研究，进而限制了亚侧耳多糖提取方法的进一步优化和改进。
另外，如果采用现有技术进行亚侧耳多糖的工业化生产，还会存在如下问题：整个生产过程会消耗大量的酒精，后续处理大量的酒精需要付出高昂的生产成本，同时，大量的酒精也不可避免地会带来严重的消防安全隐患，进而直接限制了现有技术的大规模生产应用。
基于上述问题，发明人经过无数的实验探索，研究开发出了一种新的亚侧耳多糖的工业生产方法，该方法采用d301和d152离子交换层析柱进行离子交换层析，克服了一般用deae-纤维素和cm-纤维素的高成本问题，同时在膜截留分子量为1×105kd的条件下进行膜过滤，除去了大量的小分子及低分子量生物活性低的多糖杂质。该方法使得酒精沉淀后获得的亚侧耳多糖的纯度较高，可达90％以上，进而可以对亚侧耳多糖的生化性质进行深入研究，发明人发现，亚侧耳多糖的荷电性接近电中性，且分子量大于1×105kd，为中性水溶性多糖，进一步验证了本发明生产方法的可行性和科学性；并且该方法将多糖提取液浓缩至接近原体积的10～12％，使得酒精沉淀过程中的酒精用量降低到现有方法的5-10％，大大降低了生产成本，提高了生产效率，同时极大地降低了消防安全隐患；另外，该方法中采用的膜处理原材料和层析材料均可以多次重复利用，且价格低廉，进一步降低了生产成本。
为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种亚侧耳多糖的提取方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：
将亚侧耳进行水提取处理，以便获得提取液；
将所述提取液进行离子交换层析，以便获得未吸附穿透液，所述离子交换层析是通过d301离子交换层析柱和d152离子交换层析柱进行的；
将所述未吸附穿透液进行膜过滤，膜截留分子量为1×105kd，以便获得截留液；
将所述截留液进行酒精沉淀处理，以便获得沉淀物；
将所述沉淀物进行干燥处理，以便获得所述亚侧耳多糖。
根据本发明实施例的提取方法获得的亚侧耳多糖的纯度高达90％以上；同时将多糖提取液浓缩至接近原体积的10～12％，使得酒精沉淀过程中的酒精用量降低到现有方法的5-10％，极大地降低了生产成本，提高了生产效率，大大降低了消防隐患；并且所述采用的膜处理原材料和层析材料均价格低廉且可多次重复利用，进一步大幅度降低了生产成本。
根据本发明的实施例，上述方法还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述水提取处理是通过如下方式进行的：将所述亚侧耳与水混合后进行粉碎匀浆处理；将粉碎匀浆处理产物进行浸提处理；将浸提处理产物进行过滤处理，以便获得滤液；将所述滤液进行第一离心处理，以便获得上清液，所述上清液为所述亚侧耳提取液。需要说明的是，术语“浸提处理”指的是本领域常规使用的浸提法，也称液固萃取法，是用挥发性有机溶剂将原料中的某些成分转移到溶剂相中，然后通过蒸发、蒸馏等手段回收有机溶剂，而得到所需的较为纯净的萃取组分。发明人发现，上述水提取处理可以充分提取目标成分亚侧耳多糖，提取效率高。
根据本发明的实施例，所述亚侧耳与所述水的质量比为1：(0.5～5)，如为1:0.5、1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5或1:5。发明人发现，若水的质量过多，则提取效率降低；若水的质量过少，则无法充分提取亚侧耳多糖。所述亚侧耳与所述水的质量比在该范围时，可以进一步充分提取亚侧耳多糖，提取效率更高。
根据本发明的实施例，所述浸提处理是在温度为85～90℃，如为86、87、88、89或90℃的条件下进行3～4h，如为3.2、3.4、3.6、3.8或4.0h。发明人发现，若浸提处理的温度过高，可能破坏亚侧耳多糖的结构；若浸提处理的时间过长，则提取效率降低；若浸提处理的温度过低或时间过短，则无法充分提取亚侧耳多糖。所述浸提处理在温度为85～90℃的条件下进行3～4h，可以进一步充分提取亚侧耳多糖，提取效率更高。
根据本发明的实施例，所述过滤处理是通过纱布(28×18tex，110×102根/10cm)进行的。根据本发明的实施例，所述纱布为4～8层，如为5、6或7层。由此，可以简便高效地滤除杂质，且提取获得的亚侧耳多糖的纯度更高。
根据本发明的实施例，所述第一离心处理是在温度为4℃，转速为8000～10000rpm的条件下进行20～30min。
根据本发明的实施例，所述酒精沉淀处理是通过如下方式进行的：将所述截留液与酒精混合后静置；将静置产物进行第二离心处理，以便获得所述沉淀物。发明人发现，上述酒精沉淀处理可以充分沉淀目标成分亚侧耳多糖，沉淀效率高。
根据本发明的实施例，所述混合后酒精的浓度为65～75％，如为68、70、72或74％。需要说明的是，“混合后酒精的浓度”指的是将截留液与一定初始浓度的酒精混合后得到的混合物中，酒精的终浓度。发明人发现，若混合后酒精的浓度过高，生产成本提高；若混合后酒精的浓度过低，则无法充分沉淀目标成分亚侧耳多糖。所述混合后酒精的浓度为65～75％时，可以进一步充分沉淀目标成分亚侧耳多糖，沉淀效率更高。
根据本发明的实施例，所述静置的时间为4～6h，如为4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6或5.8h。发明人发现，若静置时间过长，则沉淀效率降低；若静置时间过短，则无法充分沉淀目标成分亚侧耳多糖。所述静置的时间为4～6h时，可以进一步充分沉淀目标成分亚侧耳多糖，沉淀效率更高。
根据本发明的实施例，所述第二离心处理是在温度为4℃，转速为8000～10000rpm的条件下进行20～30min。
根据本发明的实施例，所述干燥处理为冷冻干燥处理。发明人发现，若采用热干燥方法进行干燥处理，会使得亚侧耳多糖被氧化而丧失其抗氧化的生物功能，同时会使亚侧耳多糖的溶解性能发生改变，从而影响到亚侧耳多糖的使用体验。
根据本发明的实施例，所述冷冻干燥处理是通过如下方式进行的：将所述沉淀物进行冷冻处理；将冷冻的所述沉淀物进行冻干处理，以便获得干粉，所述干粉为所述亚侧耳多糖。
根据本发明的实施例，所述冷冻处理是通过如下方式进行的：将所述沉淀物在温度为-80℃的条件下完全冻结彻底。
根据本发明的实施例，所述冻干处理是通过真空冷冻干燥机进行的。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种亚侧耳多糖的提取方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：
将亚侧耳与水按照质量比为1：(0.5-5)的比例混合后粉碎匀浆；
将粉碎匀浆产物在85℃-90℃的温度下浸提3-4h；
将浸提产物通过4-8层纱布过滤，以便获得滤液；
将所述滤液在温度为4℃，转速为8000～10000rpm的条件下离心20-30min，以便获得上清液；
将所述上清液通过d301离子交换层析柱和d152离子交换层析柱进行离子交换层析，以便获得未吸附穿透液；
将所述未吸附穿透液进行膜过滤，膜截留分子量为1×105kd，以便获得截留液；
将所述截留液与酒精混合后静置4-6h，所述混合后酒精的浓度为65～75％；
将静置产物在温度为4℃，转速为8000～10000rpm的条件下离心20-30min，以便获得沉淀物；
将所述沉淀物在温度为-80℃的条件下完全冻结彻底；
将冻结彻底的所述沉淀物放入真空冷冻干燥机中冻干，以便获得干粉，所述干粉为所述亚侧耳多糖。
根据本发明实施例的提取方法获得的亚侧耳多糖的纯度高达90％以上；同时将多糖提取液浓缩至接近原体积的10～12％，使得酒精沉淀过程中的酒精用量降低到现有方法的5-10％，极大地降低了生产成本，提高了生产效率，大大降低了消防隐患；并且所述采用的膜处理原材料和层析材料均价格低廉且可多次重复利用，进一步大幅度降低了生产成本。
具体实施方式
下面详细描述本发明的具体实施方式，下列描述是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
亚侧耳多糖的提取方法如下：
①将新鲜的亚侧耳子实体按亚侧耳：去离子水(1:0.5-5)的比例加入去离子水混合，粉碎匀浆。
②将匀浆液于85℃-90℃下浸提3-4h。
③浸提后匀浆液4-8层纱布过滤，收集滤液。
④滤液在4℃×8000-10000rpm×20-30min条件下离心，收集上清液。
⑤上清液中通过d301和d152进行离子交换层析，收集未吸附穿透液a。
⑥a溶液经膜过滤，膜截留分子量为1×105kd,收集截留的部分b。
⑦b溶液加入酒精，酒精终浓度为65-75％，静置4-6h。
⑧静置后的b溶液在4℃×8000-10000rpm×20-30min条件下离心，收集沉淀c。
⑨c置于-80℃至完全冻结彻底。
⑩冻结的c放入真空冷冻干燥机中冻干，干粉即降血糖亚侧耳多糖。
下面将结合具体实施例，进一步详细描述本发明的提取方法，所述具体实施例的是示例性的，旨在用于进一步解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例1
将新鲜的亚侧耳与去离子水按1:0.5(质量/体积，g/ml)混合，粉碎、匀浆，匀浆液于85℃浸提3h，6层纱布过滤，离心(4℃×8000rpm×20min)，收集上清液。上清液直接经过d301和d152进行离子交换层析，收集未吸附穿透液。未吸附穿透液经过1×105kd截留分子量的膜过滤，收集截留部分。截留部分加入酒精，酒精终浓度为65％(v/v)，静置4h。静置后，置于4℃×8000rpm×20min条件下离心，收集沉淀。沉淀经过真空冷冻干燥机冻干，干粉即降血糖亚侧耳多糖。多糖得率为4.52％，纯度为90.1％。
实施例2
将新鲜的亚侧耳与去离子水按1:1.5(质量/体积，g/ml)混合，粉碎、匀浆，匀浆液于85℃浸提3h，4层纱布过滤，离心(4℃×8000rpm×20min)，收集上清液。上清液直接经过d301和d152进行离子交换层析，收集未吸附穿透液。未吸附穿透液经过1×105kd截留分子量的膜过滤，收集截留部分。截留部分加入酒精，酒精终浓度为65％(v/v)，静置4h。静置后，置于4℃×8000rpm×20min条件下离心，收集沉淀。沉淀经过真空冷冻干燥机冻干，干粉即降血糖亚侧耳多糖。多糖得率为4.63％，纯度为90.1％。
实施例3
将新鲜的亚侧耳与去离子水按1:3(质量/体积，g/ml)混合，粉碎、匀浆，匀浆液于85℃浸提4h，6层纱布过滤，离心(4℃×9000rpm×20min)，收集上清液。上清液直接经过d301和d152进行离子交换层析，收集未吸附穿透液。未吸附穿透液经过1×105kd截留分子量的膜过滤，收集截留部分。截留部分加入酒精，酒精终浓度为65％(v/v)，静置4h。静置后，置于4℃×9000rpm×20min条件下离心，收集沉淀。沉淀经过真空冷冻干燥机冻干，干粉即降血糖亚侧耳多糖。多糖得率为4.82％，纯度为92.1％。
实施例4
将新鲜的亚侧耳与去离子水按1:4(质量/体积，g/ml)混合，粉碎、匀浆，匀浆液于85℃浸提3h，6层纱布过滤，离心(4℃×9000rpm×30min)，收集上清液。上清液直接经过d301和d152进行离子交换层析，收集未吸附穿透液。未吸附穿透液经过1×105kd截留分子量的膜过滤，收集截留部分。截留部分加入酒精，酒精终浓度为75％(v/v)，静置6h。静置后，置于4℃×9000rpm×30min条件下离心，收集沉淀。沉淀经过真空冷冻干燥机冻干，干粉即降血糖亚侧耳多糖。多糖得率为5.13％，纯度为92.4％。
实施例5
将新鲜的亚侧耳与去离子水按1:5(质量/体积，g/ml)混合，粉碎、匀浆，匀浆液于85℃浸提4h，8层纱布过滤，离心(4℃×9000rpm×30min)，收集上清液。上清液直接经过d301和d152进行离子交换层析，收集未吸附穿透液。未吸附穿透液经过1×105kd截留分子量的膜过滤，收集截留部分。截留部分加入酒精，酒精终浓度为75％(v/v)，静置4h。静置后，置于4℃×10000rpm×30min条件下离心，收集沉淀。沉淀经过真空冷冻干燥机冻干，干粉即降血糖亚侧耳多糖。多糖得率为5.52％，纯度为94.3％。
实施例6
将新鲜的亚侧耳与去离子水按1:5(质量/体积，g/ml)混合，粉碎、匀浆，匀浆液于90℃浸提4h，4层纱布过滤，离心(4℃×9000rpm×30min)，收集上清液。上清液直接经过d301和d152进行离子交换层析，收集未吸附穿透液。未吸附穿透液经过1×105kd截留分子量的膜过滤，收集截留部分。截留部分加入酒精，酒精终浓度为75％(v/v)，静置4h。静置后，置于4℃×9000rpm×30min条件下离心，收集沉淀。沉淀经过真空冷冻干燥机冻干，干粉即降血糖亚侧耳多糖。多糖得率为5.53％，纯度为94.1％。
实施例7
将新鲜的亚侧耳与去离子水按1:5(质量/体积，g/ml)混合，粉碎、匀浆，匀浆液于90℃浸提3h，6层纱布过滤，离心(4℃×1000rpm×30min)，收集上清液。上清液直接经过d301和d152进行离子交换层析，收集未吸附穿透液。未吸附穿透液经过1×105kd截留分子量的膜过滤，收集截留部分。截留部分加入酒精，酒精终浓度为75％(v/v)，静置6h。静置后，置于4℃×10000rpm×30min条件下离心，收集沉淀。沉淀经过真空冷冻干燥机冻干，干粉即降血糖亚侧耳多糖。多糖得率为5.582％，纯度为95.0％。
实施例8
将新鲜的亚侧耳与去离子水按1:5(质量/体积，g/ml)混合，粉碎、匀浆，匀浆液于90℃浸提4h，8层纱布过滤，离心(4℃×10000rpm×30min)，收集上清液。上清液直接经过d301和d152进行离子交换层析，收集未吸附穿透液。未吸附穿透液经过1×105kd截留分子量的膜过滤，收集截留部分。截留部分加入酒精，酒精终浓度为75％(v/v)，静置5h。静置后，置于4℃×10000rpm×30min条件下离心，收集沉淀。沉淀经过真空冷冻干燥机冻干，干粉即降血糖亚侧耳多糖。多糖得率为5.52％，纯度为95.1％。
实施例9
将新鲜的亚侧耳与去离子水按1:5(质量/体积，g/ml)混合，粉碎、匀浆，匀浆液于90℃浸提3h，8层纱布过滤，离心(4℃×9000rpm×30min)，收集上清液。上清液直接经过d301和d152进行离子交换层析，收集未吸附穿透液。未吸附穿透液经过1×105kd截留分子量的膜过滤，收集截留部分。截留部分加入酒精，酒精终浓度为75％(v/v)，静置6h。静置后，置于4℃×10000rpm×30min条件下离心，收集沉淀。沉淀经过真空冷冻干燥机冻干，干粉即降血糖亚侧耳多糖。多糖得率为5.62％，纯度为95.1％。
实施例10
将新鲜的亚侧耳与去离子水按1:5(质量/体积，g/ml)混合，粉碎、匀浆，匀浆液于90℃浸提4h，8层纱布过滤，离心(4℃×10000rpm×30min)，收集上清液。上清液直接经过d301和d152进行离子交换层析，收集未吸附穿透液。未吸附穿透液经过1×105kd截留分子量的膜过滤，收集截留部分。截留部分加入酒精，酒精终浓度为70％(v/v)，静置6h。静置后，置于4℃×10000rpm×30min条件下离心，收集沉淀。沉淀经过真空冷冻干燥机冻干，干粉即降血糖亚侧耳多糖。多糖得率为5.48％，纯度为95.4％。
对比例1
提取方法与实施例1基本相同，区别仅在于：采用已报道的deae-纤维素和cm-纤维素进行离子交换层析。
结果：多糖纯度仅为60.2％-78.5％.
结论：采用本发明的提取方法提取获得的亚侧耳多糖纯度显著更高，蛋白质等含量极大降低。
对比例2
提取方法与实施例1基本相同，区别仅在于：未吸附穿透液经过1×102kd截留分子量的膜过滤。
结果：多糖纯度仅为65.2％-78.4％。
结论：采用本发明的提取方法提取获得的亚侧耳多糖纯度更高，生物活性更强。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
1.一种亚侧耳多糖的提取方法，其特征在于，包括：
将亚侧耳进行水提取处理，以便获得提取液；
将所述提取液进行离子交换层析，以便获得未吸附穿透液，所述离子交换层析是通过d301离子交换层析柱和d152离子交换层析柱进行的；
将所述未吸附穿透液进行膜过滤，膜截留分子量为1×105kd，以便获得截留液；
将所述截留液进行酒精沉淀处理，以便获得沉淀物；
将所述沉淀物进行干燥处理，以便获得所述亚侧耳多糖。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水提取处理是通过如下方式进行的：
将所述亚侧耳与水混合后进行粉碎匀浆处理；
将粉碎匀浆处理产物进行浸提处理；
将浸提处理产物进行过滤处理，以便获得滤液；
将所述滤液进行第一离心处理，以便获得上清液，所述上清液为所述亚侧耳提取液。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述亚侧耳与所述水的质量比为1：(0.5～5)；
任选地，所述浸提处理是在温度为85～90℃的条件下进行3～4h；
任选地，所述过滤处理是通过纱布进行的，优选地，所述纱布为4～8层；
任选地，所述第一离心处理是在温度为4℃，转速为8000～10000rpm的条件下进行20～30min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酒精沉淀处理是通过如下方式进行的：
将所述截留液与酒精混合后静置；
将静置产物进行第二离心处理，以便获得所述沉淀物。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述混合后酒精的浓度为65～75％；
任选地，所述静置的时间为4～6h；
任选地，所述第二离心处理是在温度为4℃，转速为8000～10000rpm的条件下进行20～30min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述干燥处理为冷冻干燥处理。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述冷冻干燥处理是通过如下方式进行的：
将所述沉淀物进行冷冻处理；
将冷冻的所述沉淀物进行冻干处理，以便获得干粉，所述干粉为所述亚侧耳多糖。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述冷冻处理是通过如下方式进行的：将所述沉淀物在温度为-80℃的条件下完全冻结彻底；
任选地，所述冻干处理是通过真空冷冻干燥机进行的。
9.一种亚侧耳多糖的提取方法，其特征在于，包括：
将亚侧耳与水按照质量比为1：(0.5-5)的比例混合后粉碎匀浆；
将粉碎匀浆产物在85℃-90℃的温度下浸提3-4h；
将浸提产物通过4-8层纱布过滤，以便获得滤液；
将所述滤液在温度为4℃，转速为8000～10000rpm的条件下离心20-30min，以便获得上清液；
将所述上清液通过d301离子交换层析柱和d152离子交换层析柱进行离子交换层析，以便获得未吸附穿透液；
将所述未吸附穿透液进行膜过滤，膜截留分子量为1×105kd，以便获得截留液；
将所述截留液与酒精混合后静置4-6h，所述混合后酒精的浓度为65～75％；
将静置产物在温度为4℃，转速为8000～10000rpm的条件下离心20-30min，以便获得沉淀物；
将所述沉淀物在温度为-80℃的条件下完全冻结彻底；
将冻结彻底的所述沉淀物放入真空冷冻干燥机中冻干，以便获得干粉，所述干粉为所述亚侧耳多糖。
技术总结