本发明涉及一种青钱柳多糖组分及其制备方法。
背景技术：
青钱柳[cyclocaryapaliurus(batal.)iljinskaja]系胡桃科青钱柳属植物，又名甜茶树、青钱李、摇钱树等，广泛分布于中国江西、贵州、湖南等地。青钱柳是我国特有的一种药用植物，具有清热解毒、生津止渴、解暑，止痛等功效，可用于治疗顽癣。青钱柳中含有多种化学成分，主要有黄酮类、多糖类、三萜类、有机酸类和无机元素类等成分。青钱柳多糖是青钱柳叶中一种具有诸多生理功能的生物活性成分。研究表明，青钱柳多糖类化合物具有降血糖、抗肿瘤、降血压、抗氧化、提高人体免疫力等多种生物活性。
多糖分离常纯化的方法主要包括乙醇沉淀法、离子交换树脂法、凝胶过滤柱色谱法、亲和色谱法、膜分离法。陈木森等人采用不同型号树脂对青钱柳多糖进行分离纯化，初步确定d301r树脂就有较好的纯化效果，xie等人采用膜分离结合凝胶渗透色谱江青钱柳多糖分成了四个组分。
α-葡萄糖苷酶抑制剂能够有效的控制血糖，对i、ii型糖尿病有确切的治疗效果。α-葡萄糖苷酶是人体内参与糖代谢的重要酶，当淀粉，蔗糖等碳水化合物进入胃肠道后，首先被α-葡萄糖苷酶降解为葡萄糖，才能被粘膜吸收进入代谢循环。α-葡萄糖苷酶抑制剂的作用机理是，对α-葡萄糖苷酶产生竞争性抑制作用，降低葡萄糖的生成速率，从而使糖尿患者的血糖平稳并维持在一定水平。国外研究证实，阿卡波糖为α-葡萄糖苷酶抑制剂的代表性药物。目前对青钱柳多糖抑制α-葡萄糖苷酶的研究主要集中在总多糖及不同浓度醇沉产物活性的研究，还没有通过deae-纤维素离子交换柱获得均一多糖组分的药理活性的研究。
技术实现要素：
本发明的目的之一在于提供一种青钱柳多糖组分，其对a-葡萄糖苷酶的抑制率大于青钱柳总多糖，解决了青钱柳总多糖成分复杂、分子量大，降糖部位不明确等问题，且所得组分结构稳定。
所述的青钱柳多糖组分的单糖组成(百分比)及分子量如下：
其平均分子量为700d。
本发明的目的之二在于提供青钱柳多糖组分在制备降血糖药物中的应用。药理结果显示青钱柳多糖组分能显著抑制a-葡萄糖苷酶，其效果强于阿卡波糖和青钱柳总多糖。
本发明的目的之三在于提供青钱柳多糖组分的制备方法，包括以下步骤：
1.水提：取青钱柳茎枝叶适量，加入15～25倍量水，优选25倍量水，100℃回流加热提取,提取时间为1～3h,优选1h，提取次数为1～3次，优选3次，提取完成后将所有水提液合并得青钱柳水提取液；离心条件为4000r/min离心15min；
2.醇沉及干燥：对青钱柳水提取液进行浓缩，得青钱柳浓缩液，加入95％乙醇进行醇沉，醇沉的乙醇浓度为60％～80％，优选70％，置阴凉处静止过夜，将上清液弃去，取沉淀减压干燥，得青钱柳总多糖；
3.透析：将得到的青钱柳总多糖溶解后离心，取上清液经过1kd透析袋透析得到透析袋内青钱柳多糖组分1溶液和袋外青重量钱柳多糖组分2溶液，浓缩冻干后分别得青钱柳多糖组分1和青钱柳多糖组分2；
4.分级分离：取上述青钱柳多糖组分1，溶解后通过deae-纤维素柱层析，依次采用纯水，0.2～0.5mol/lnacl洗脱，优选0.5mol/l，得青钱柳多糖组分3溶液，青钱柳多糖组分4溶液；
5.干燥：将上述所得多糖组分3溶液进行减压浓缩干燥，即得到青钱柳多糖组分。
本发明的青钱柳多糖组分分离纯化方法简单，所得多糖组分单糖含量及分子量范围明确，结构稳定，药理结果显示青钱柳多糖组分能显著抑制a-葡萄糖苷酶，其效果强于阿卡波糖和青钱柳总多糖。
附图说明
图1为青钱柳不同多糖组分分子量范围。
具体实施方式
实施例1青钱柳多糖组分制备。
1、通过以下步骤分离提纯青钱柳多糖组分：取青钱柳茎枝适量，加入15～25倍量水，100℃回流加热提取,提取时间为1～3h,提取次数为1～3次，提取完成后将所有水提液合并；对青钱柳提取液进行浓缩后加入95％乙醇进行醇沉，醇沉的乙醇浓度为60％～80％，置阴凉处静止过夜，将上清液弃去，取沉淀减压干燥，得青钱柳总多糖50.61g。将青钱柳总多糖溶于10倍量的蒸馏水中，过夜搅拌充分溶解，4000r/min，离心15min，得到沉淀(杂质6.9g)和上清(溶解的青钱柳总多糖)。将得到的上清(青钱柳总多糖)经过1kd透析袋透析得到袋内青钱柳多糖组分1及袋外青钱柳多糖组分2溶液。将青钱柳多糖组分1溶液及青钱柳多糖组分2溶液进行减压浓缩干燥，即得到青钱柳多糖组分1(23.4g)和青钱柳多糖组分2(14.8g)。取上述青钱柳多糖组分1(18g)，溶解后通过deae-纤维素柱层析，依次采用纯水，0.2～0.5mol/lnacl洗脱，得青钱柳多糖组分3溶液，青钱柳多糖组分4溶液；将所有多糖组分溶液进行减压浓缩干燥，即得到青钱柳多糖组分3(7.6g)和青钱柳多糖组分4(3.4g)。
2、青钱柳总多糖及青钱柳各多糖组分结构鉴定。
(1)组成含量分析：对步骤1所述制备的青钱柳总多糖及青钱柳多糖组分1、青钱柳多糖组分2、青钱柳多糖组分3，青钱柳多糖组分4进行糖的组分含量分析，具体包括采用苯酚-硫酸法测定糖含量，间羟基联苯法测定糖醛酸含量，考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，具体结果如下：
表1青钱柳总多糖及青钱柳各多糖组分的组成含量
(2)单糖组成测定：对步骤1所述制备的青钱柳总多糖及青钱柳多糖组分1、青钱柳多糖组分2、青钱柳多糖组分3，青钱柳多糖组分4进行单糖组成分析，本发明采用高效液相色谱进行测定。具体步骤如下：采用shimadzuhplc系统(lc-10atvp泵和spd-10avd紫外光检测器)，compassc18色谱柱(4.6×150mm)，流动相为pbs(0.1m,ph7.0-乙腈81:19(v/v)，流速为1.0ml/min，进样量为10μl，检测波长为245nm。
表2青钱柳总多糖及各青钱柳多糖组分中多糖组成及含量
(3)分子量测定：对步骤1所述制备的青钱柳总多糖、青钱柳多糖组分2、青钱柳多糖组分3，和青钱柳多糖组分4进行分子量，本发明采用高效凝胶渗透色谱法进行测定，具体方法如下：采用日本shimadzu公司生产lc-10avp高效液相色谱仪系统，rid-10a视差折射检测器，shimadzuclass-vp工作站，tsk-gelg-3000pwxl不锈钢色谱柱(7.8×300mm)，柱温为40℃。取青钱柳多糖样品溶于0.2mnacl水溶液，浓度为2mg/ml，上样量为20μl。流动相为0.2mnacl水溶液，流速为0.6ml/min。各级分分子量分布结果见图1。
实施例2：青钱柳多糖a-葡萄糖苷酶抑制实验
实验材料及配置①磷酸盐缓冲液(ph＝6.8)：精密量取k2hpo4(0.2mol/l)溶液和kh2po4(0.2mol/l)溶液，均匀混合；②供试品溶液的制备：精密称取供试品0.5g，用磷酸盐缓冲液，将其配置成浓度为5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160.0μg/ml的溶液；③α-葡萄糖苷酶溶液的制备：精密称取α-葡萄糖苷酶粉末，用磷酸盐缓冲溶液，将其配制为0.04u/ml的α-葡萄糖苷酶溶液；④底物溶液的制备：精密称取7.52g的pnpg粉末，用磷酸盐缓冲溶液，将其配制成浓度为0.5mm的溶液；⑤阳性药阿卡波糖溶液的制备：精密称取阿卡波糖，用磷酸盐缓冲液，将其配制成浓度为2mg/ml的溶液；⑥na2co3溶液的制备：精密称取na2co3粉末，加入蒸馏水，将其配制成浓度为0.1mol/l的溶液(ph＝9.8)。
实验步骤：首先精密吸取不同浓度供试品溶液各40μl于96孔板中，加入40μl的α-葡萄糖苷酶溶液，37℃恒温箱中孵育5min，分别加入pnpg溶液20μl，震荡至均匀，作为供试品溶液(平行六次)。三组作为供试组，三组作为供试品背景组。精密吸取阿卡波糖40μl于96孔板中(平行六次)，三组作为实验组，三组作为阳性药背景组。供试组加入α-葡萄糖苷酶溶液40μl，恒温37℃孵育5min，加入pnpg溶液20μl，震荡均匀。精密吸取缓冲液40μl于96孔板中，加入40μl的α-葡萄糖苷酶溶液，37℃恒温孵育5min，加入pnpg溶液20μl，震荡均匀，作为阴性对照(平行六次)，三组作为阴性对照组，三组作为阴性背景组。将样品放于恒温恒湿培养箱，37℃下孵育40min，加入na2co3溶液100μl用以停止反应。将待测样品用酶联免疫检测仪进行检测，检测波长为405nm，并记录od值。
实验对象：分别为青钱柳总多糖；青钱柳多糖组分1；青钱柳多糖组分2；青钱柳多糖组分3；青钱柳多糖组分4
表3青钱柳总多糖及各青钱柳多糖组分a-葡萄糖苷酶抑制活性比较
结论：活性测试显示，青钱柳总多糖及青钱柳组分均具有a-葡萄糖苷酶抑制活性，但青钱柳组分3活性最强，其活性强于对照药阿卡波糖和青钱柳总多糖。
1.一种青钱柳多糖组分，其特征是，所述的青钱柳多糖组分的单糖组成及分子量如下：
其平均分子量为700d。
2.如权利要求1所述的青钱柳多糖组分在制备降血糖药物中的应用。
3.如权利要求1或2所述的青钱柳多糖组分的制备方法，包括如下步骤：
(1)水提：将青钱柳药材茎枝叶用水提取，得到青钱柳水提取液；
(2)醇沉及干燥：将青钱柳水提取液浓缩后进行醇沉，醇沉的乙醇浓度为60％～80％，静止过夜，离心得沉淀进行真空干燥，得青钱柳总多糖；
(3)透析：将得到的青钱柳总多糖溶解后离心，取上清液经过1kd透析袋透析得到透析袋内青钱柳多糖组分1溶液和袋外青钱柳多糖组分2溶液，浓缩冻干后分别得青钱柳多糖组分1和青钱柳多糖组分2；
(4)分级分离：取上述青钱柳多糖组分1，溶解后通过deae-纤维素柱层析，依次采用纯水，0.2～0.5mol/lnacl洗脱，得青钱柳多糖组分3溶液，青钱柳多糖组分4溶液；
(5)干燥：对青钱柳多糖组分3溶液进行减压干燥，即得到青钱柳多糖组分。
4.如权利要求3所述的青钱柳多糖组分的制备方法，其特征在于：所述的步骤(1)中水提的步骤具体如下：取青钱柳茎枝叶适量，粉碎后加入15～25倍量水，100℃回流加热提取,提取时间为1～3h,提取次数为1～3次，提取完成后将所有水提液合并，得青钱柳水提取液；
所述步骤(2)的离心条件为4000r/min离心15min。
5.如权利要求3或4所述的青钱柳多糖组分的制备方法，其特征在于：
(1)水提：取青钱柳茎枝叶适量，粉碎后加入25倍量水，100℃回流加热提取,提取时间为1h,提取次数为3次，提取完成后将所有水提液合并，得青钱柳水提取液；
(2)醇沉及干燥：将青钱柳水提取液浓缩后进行醇沉，醇沉的乙醇浓度为70％，静止过夜，离心得沉淀进行真空干燥，得青钱柳总多糖；
(3)透析：将得到的青钱柳总多糖溶解后离心，取上清液经过1kd透析袋透析得到透析袋内青钱柳多糖组分1溶液和袋外青钱柳多糖组分2溶液，浓缩冻干后分别得青钱柳多糖组分1和青钱柳多糖组分2；
(4)分级分离：取上述青钱柳多糖组分1，溶解后通过deae-纤维素柱层析，依次采用纯水，0.5mol/lnacl洗脱，得青钱柳多糖组分3溶液，青钱柳多糖组分4溶液；
(5)干燥：对青钱柳多糖组分3溶液进行减压干燥，即得到青钱柳多糖组分。
技术总结