本发明属于功能化材料制备技术领域，尤其是一种用于增强抗生素药效的分子印迹材料的制备方法。
背景技术：
分子印迹聚合物(mips)是一种合成受体，具有针对目标分子定制的识别位点。它们的高亲和力和高选择性、优异的稳定性、制备简便和低成本使其在许多重要的分子识别领域有望作为生物受体的替代材料。固相合成法合成的分子印迹易于洗脱模板，具有良好的水溶性和生物相容性，对环境友好。
3’,5’-鸟苷四磷酸(ppgpp)是一种信号分子，细菌在应激反应过程中会迅速产生大量的ppgpp修复受损的dna损伤，从而使细菌储存能量来适应不利的生存环境。在此过程中加入分子印迹捕获细菌受到刺激时释放的ppgpp，致使细菌无法修复受损的dna损伤、不能进行自我保护而死亡。因此及时去除细菌产生的ppgpp不仅可以提高细菌的致死率、减少抗生素用量，还可以降低细菌产生耐药性的风险。
近几十年来，纳米技术在抗菌领域的应用越来越频繁，表明纳米技术在开发新型高效抗生素方面具有广阔的前景。其中，无机纳米结构是特异性粘附和影响细菌的代表性抑菌剂之一，例如，无机银nps被广泛用作抗菌涂料和添加剂材料(如包装)，但由于不确定它们的作用机制和生物毒性，它们没有直接用于药物治疗。本发明利用固相合成法合成的分子印迹材料模板易于洗脱、具有良好水溶性和生物相容性，它们不仅在细菌生长过程中可以特异性捕获细菌释放的信号分子ppgpp来破坏细菌在不利生长环境中的保护机制，从而达到抑制细菌生长的目的，还可以协同抗生素增强抗生素的药效。
通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
技术实现要素：
本发明目的在于现有技术的不足之处，提供一种用于增强抗生素药效的分子印迹材料的制备方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种用于增强抗生素药效的分子印迹材料的制备方法，步骤如下：
⑴在玻璃微球上固定化模板
在玻璃微球表面用硅烷试剂上氨基，然后用二醛类修饰上醛基，最后固定模板；
⑵将步骤⑴反应得到的固定化模板与功能单体、交联剂、引发剂聚合，得到的材料洗脱，干燥，即得用于增强抗生素药效的分子印迹材料；
其中，所述功能单体的质量总浓度为0.2-1.0％(w/w)，功能单体双键总量与引发剂的摩尔比为2/1-10/1。
而且，所述步骤⑴中硅烷试剂为3-氨基丙基三甲氧基硅烷、3-氨基丙基三乙氧基硅烷、n-氨乙基-γ-氨丙基三甲氧基硅烷中的一种。
而且，所述步骤⑴中模板为3’,5’-鸟苷四磷酸、5’-二磷酸鸟苷、5’-三磷酸鸟苷中的一种。
而且，所述步骤⑵中功能单体为丙烯酸、n-异丙基丙烯酰胺、丙烯酰胺、n-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺盐酸盐、n-叔丁基丙烯酰胺中的三种。
而且，所述步骤⑵中交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯、n,n-亚甲基双丙烯酰胺中的一种。
而且，所述步骤⑵中引发剂为偶氮二异丁腈、过硫酸钾和四甲基乙二胺中的一种或两种。
而且，所述步骤⑵中洗脱的具体条件为：2-10℃水洗两次后透析1-2天，25-50℃继续透析1-2天。
而且，所述步骤⑵中干燥条件为-80℃冷冻干燥。
而且，具体步骤如下：
将活化的玻璃微球放在质量浓度为2％的硅烷试剂甲苯溶液中孵育24h上氨基，用甲苯和丙酮冲洗后干燥，继续在二醛类磷酸盐缓冲溶液中孵育12h上醛基，用磷酸盐缓冲溶液冲洗5次后用水再冲洗5次，继续在加入模板的磷酸盐缓冲溶液中孵育12h固定模板，用磷酸盐缓冲溶液冲洗5次后用水再冲洗5次，然后将固定模板的玻璃微球放入含有功能单体、交联剂、引发剂的水溶液中过夜孵育，2-10℃洗脱后收集溶液进行透析，冷冻干燥即得用于增强抗生素药效的分子印迹材料。
而且，所述用甲苯和丙酮冲洗后干燥为使用通风橱自然风干。
本发明取得的优点和积极效果为：
1、本发明方法制得的分子印迹材料具有特异性识别位点，能够吸附在细菌应激反应过程中产生的ppgpp，协同抗生素能够提高细菌的致死率，从而减少抗生素的用量以及对环境的污染，降低细菌产生耐药性的风险，性能稳定，在室温干燥的环境中放置半年后，仍可协同抗生素提高细菌的致死率，极大地节约了使用的生产成本，生物相容性好，在体内应用具有广阔的应用前景。
2、本发明方法合成过程简单，条件易于控制，所制得的材料具有较好的化学稳定性，易于储存和携带，降低抗生素药物生产成本。
3、本发明方法制得的分子印迹材料协同抗生素能够提高细菌的致死率，达到相同的抑菌效果，可以至少减少抗生素一半的用量，减少抗生素的用量不仅节约了成本，而且保护了环境。
4、本发明方法制的分子印迹材料具有优越的生物相容性，即使高浓度的材料对细胞的正常生长也没有影响，具有很好的潜力在体内应用。
5、本发明方法制得的分子印迹材料稳定性高，水相稳定性好，易于携带和储存，协同抗生素对细菌应激反应产生的3’,5’-鸟苷四磷酸(ppgpp)进行吸附来提高抑菌率，从而减少抗生素的用量以及对环境的污染，降低细菌产生耐药性的风险，且生物相容性好在体内应用具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明中分子印迹材料的透射电镜图；从图1中可看出本发明单个颗粒尺寸约为10-30nm，为纳米材料，且内部为空心具有特异性识别位点；
图2为本发明分子印迹材料的zeta电位图；从图中可以看出本发明材料带正电为35.25mv；
图3为本发明分子印迹材料协同抗生素盐酸土霉素的抑菌率图；从图3中可看出本发明材料与盐酸土霉素协同作用和单独作用2倍量的盐酸土霉素相比抑菌率相当；
图4为本发明分子印迹材料协同抗生素硫酸卡那霉素的抑菌率图；从图3中可看出本发明材料与硫酸卡那霉素协同作用和单独作用2倍量的硫酸卡那霉素相比抑菌率相当；
图5为本发明分子印迹材料的细胞毒性评价图；从图中可以看出随着材料浓度的增加，对细胞的存活率影响较小，对细胞的正常生长没有影响，说明该材料具有优越的生物相容性。
具体实施方式
下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
一种用于增强抗生素药效的分子印迹材料的制备方法，步骤如下：
⑴在玻璃微球上固定化模板
在玻璃微球表面用硅烷试剂上氨基，然后用二醛类修饰上醛基，最后固定模板；
⑵将步骤⑴反应得到的固定化模板与功能单体、交联剂、引发剂聚合，得到的材料洗脱，干燥，即得用于增强抗生素药效的分子印迹材料；
其中，所述功能单体的质量总浓度为0.2-1.0％(w/w)，功能单体双键总量与引发剂的摩尔比为2/1-10/1。
较优地，所述步骤⑴中硅烷试剂为3-氨基丙基三甲氧基硅烷、3-氨基丙基三乙氧基硅烷、n-氨乙基-γ-氨丙基三甲氧基硅烷中的一种。
较优地，所述步骤⑴中模板为3’,5’-鸟苷四磷酸、5’-二磷酸鸟苷、5’-三磷酸鸟苷中的一种。
较优地，所述步骤⑵中功能单体为丙烯酸、n-异丙基丙烯酰胺、丙烯酰胺、n-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺盐酸盐、n-叔丁基丙烯酰胺中的三种。
较优地，所述步骤⑵中交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯、n,n-亚甲基双丙烯酰胺中的一种。
较优地，所述步骤⑵中引发剂为偶氮二异丁腈、过硫酸钾和四甲基乙二胺中的一种或两种。
较优地，所述步骤⑵中洗脱的具体条件为：2-10℃水洗两次后透析1-2天，25-50℃继续透析1-2天。
较优地，所述步骤⑵中干燥条件为-80℃冷冻干燥。
较优地，具体步骤如下：
将活化的玻璃微球放在质量浓度为2％的硅烷试剂甲苯溶液中孵育24h上氨基，用甲苯和丙酮冲洗后干燥，继续在二醛类磷酸盐缓冲溶液中孵育12h上醛基，用磷酸盐缓冲溶液冲洗5次后用水再冲洗5次，继续在加入模板的磷酸盐缓冲溶液中孵育12h固定模板，用磷酸盐缓冲溶液冲洗5次后用水再冲洗5次，然后将固定模板的玻璃微球放入含有功能单体、交联剂、引发剂的水溶液中过夜孵育，2-10℃洗脱后收集溶液进行透析，冷冻干燥即得用于增强抗生素药效的分子印迹材料。
较优地，所述用甲苯和丙酮冲洗后干燥为使用通风橱自然风干。
实施例1
一种用于增强抗生素药效的分子印迹材料的制备方法，步骤如下：
⑴在玻璃微球上固定化模板
其中，所述固定化模板的过程包括：在玻璃微球表面用2％硅烷试剂3-氨基丙基三乙氧基硅烷甲苯溶液上氨基，然后用丁二醛修饰上醛基，最后固定模板5’-三磷酸鸟苷；
⑵将步骤⑴反应得到的固定化模板与功能单体、交联剂、引发剂聚合得到的材料洗脱，干燥，即得该分子印迹材料。
其中，步骤⑵中所述功能单体为180.0mgn-异丙基丙烯酰胺、7.0mg丙烯酸、10.0mgn-叔丁基丙烯酰胺，交联剂为15mgn,n-亚甲基丙烯酰胺,引发剂为15mg过硫酸钾；洗脱的条件为4℃水洗两次后收集溶液再透析24h，30℃继续透析24h；干燥条件为-80℃冷冻干燥后即得本发明分子印迹材料。
实施例2
一种用于增强抗生素药效的分子印迹材料的制备方法，步骤如下：
⑴在玻璃微球上固定化模板
其中，所述固定化模板的过程包括：在玻璃微球表面用2％硅烷试剂3-氨基丙基三甲氧基硅甲苯溶液上氨基，然后用戊二醛修饰上醛基，最后固定模板5’-二磷酸鸟苷；
⑵将步骤⑴反应得到的固定化模板与功能单体、交联剂、引发剂聚合得到的材料洗脱，干燥，即得分子印迹材料。
其中，步骤⑵中所述功能单体为180.0mgn-异丙基丙烯酰胺、7.0mg丙烯酸、7mg丙烯酰胺，交联剂为15mgn,n-亚甲基丙烯酰胺，引发剂为2μl四甲基乙二胺；洗脱的条件为6℃水洗两次后收集溶液再透析24h，35℃继续透析24h；干燥条件为-80℃冷冻干燥后即得本发明分子印迹材料。
实施例3
一种用于增强抗生素药效的分子印迹材料的制备方法，步骤如下：
⑴在玻璃微球上固定化模板
其中，所述固定化模板的过程包括：在玻璃微球表面用2％硅烷试剂n-氨乙基-γ-氨丙基三甲氧基硅烷甲苯溶液上氨基，然后用戊二醛修饰上醛基，最后固定模板3’,5’-鸟苷四磷酸；
⑵将步骤⑴反应得到的固定化模板与功能单体、交联剂、引发剂聚合得到的材料洗脱，干燥，即得分子印迹材料。
其中，步骤⑵中所述功能单体为180mgn-异丙基丙烯酰胺、30mgn-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺盐酸盐、7mg丙烯酰胺，交联剂为15mgn,n-亚甲基丙烯酰胺，引发剂为过16mg硫酸钾和1μl四甲基乙二胺；洗脱的条件为10℃水洗两次后收集溶液再透析24h，42℃继续透析24h；干燥条件为-80℃冷冻干燥后即得本发明分子印迹材料。
本发明分子印迹材料的相关检测结果：
1、本发明分子印迹材料的透射电镜检测，结果如图1所示，从图1中可看出本发明颗粒单个尺寸较小，约为10-30nm，为纳米材料，且内部为空心具有特异性识别位点。
2、本发明分子印迹材料的zeta电位检测，结果如图2所示，从图2中可看出本发明材料带正电为35.25mv。
3、本发明分子印迹材料协同抗生素盐酸土霉素的抑菌率检测
检测步骤如下：
取2mg本发明分子印迹材料于10ml离心管中，加入0.9％的生理盐水，取0.5ml的材料与0.5ml浓度0.1mg/ml的盐酸土霉素混合与108cfu/ml的大肠杆菌37℃、200r孵育12h，稀释10000倍后取100μl涂板，37℃孵育16h后计数；1ml浓度0.1mg/ml的盐酸土霉素单独与108cfu/ml的大肠杆菌孵育，分别与空白108cfu/ml的大肠杆菌对比，计算获得两组的抑菌率相当。结果如图3所示，从图3中可看出本发明材料与盐酸土霉素协同作用和单独作用2倍量的盐酸土霉素相比抑菌率相当。
4、本发明分子印迹材料协同抗生素硫酸卡那霉素的抑菌率检测：
检测步骤如下：
取2mg本发明分子印迹材料于10ml离心管中，加入0.9％的生理盐水，取0.5ml的材料与0.5ml浓度0.02mg/ml的硫酸卡那霉素混合与108cfu/ml的大肠杆菌37℃、200r孵育12h，稀释10000倍后取100μl涂板，37℃孵育16h后计数；1ml浓度0.02mg/ml的硫酸卡那霉素单独与108cfu/ml的大肠杆菌孵育，分别与空白108cfu/ml的大肠杆菌对比，计算获得两组的抑菌率相当。结果如图4所示，从图4中可看出本发明材料与硫酸卡那霉素协同作用和单独作用2倍量的硫酸卡那霉素相比抑菌率相当。
5、本发明分子印迹材料对mdck细胞毒性检测：
检测步骤如下：
mdck细胞使用含mips(终浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.3、0.4mg/ml)的培养基孵育48h后使用mtt法分别检测细胞活性，如图5所示，从图中可以看出随着材料浓度的增加，对细胞的存活率影响较小，不同浓度的本发明分子印迹材料对mdck细胞活力没有影响，对细胞的正常生长没有影响，说明该材料具有优越的生物相容性。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容。
1.一种用于增强抗生素药效的分子印迹材料的制备方法，其特征在于：步骤如下：
⑴在玻璃微球上固定化模板
在玻璃微球表面用硅烷试剂上氨基，然后用二醛类修饰上醛基，最后固定模板；
⑵将步骤⑴反应得到的固定化模板与功能单体、交联剂、引发剂聚合，得到的材料洗脱，干燥，即得用于增强抗生素药效的分子印迹材料；
其中，所述功能单体的质量总浓度为0.2-1.0％(w/w)，功能单体双键总量与引发剂的摩尔比为2/1-10/1。
2.根据权利要求1所述的用于增强抗生素药效的分子印迹材料的制备方法，其特征在于：所述步骤⑴中硅烷试剂为3-氨基丙基三甲氧基硅烷、3-氨基丙基三乙氧基硅烷、n-氨乙基-γ-氨丙基三甲氧基硅烷中的一种。
3.根据权利要求1所述的用于增强抗生素药效的分子印迹材料的制备方法，其特征在于：所述步骤⑴中模板为3’,5’-鸟苷四磷酸、5’-二磷酸鸟苷、5’-三磷酸鸟苷中的一种。
4.根据权利要求1所述的用于增强抗生素药效的分子印迹材料的制备方法，其特征在于：所述步骤⑵中功能单体为丙烯酸、n-异丙基丙烯酰胺、丙烯酰胺、n-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺盐酸盐、n-叔丁基丙烯酰胺中的三种。
5.根据权利要求1所述的用于增强抗生素药效的分子印迹材料的制备方法，其特征在于：所述步骤⑵中交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯、n,n-亚甲基双丙烯酰胺中的一种。
6.根据权利要求1所述的用于增强抗生素药效的分子印迹材料的制备方法，其特征在于：所述步骤⑵中引发剂为偶氮二异丁腈、过硫酸钾和四甲基乙二胺中的一种或两种。
7.根据权利要求1所述的用于增强抗生素药效的分子印迹材料的制备方法，其特征在于：所述步骤⑵中洗脱的具体条件为：2-10℃水洗两次后透析1-2天，25-50℃继续透析1-2天。
8.根据权利要求1所述的用于增强抗生素药效的分子印迹材料的制备方法，其特征在于：所述步骤⑵中干燥条件为-80℃冷冻干燥。
9.根据权利要求1至8任一项所述的用于增强抗生素药效的分子印迹材料的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：
将活化的玻璃微球放在质量浓度为2％的硅烷试剂甲苯溶液中孵育24h上氨基，用甲苯和丙酮冲洗后干燥，继续在二醛类磷酸盐缓冲溶液中孵育12h上醛基，用磷酸盐缓冲溶液冲洗5次后用水再冲洗5次，继续在加入模板的磷酸盐缓冲溶液中孵育12h固定模板，用磷酸盐缓冲溶液冲洗5次后用水再冲洗5次，然后将固定模板的玻璃微球放入含有功能单体、交联剂、引发剂的水溶液中过夜孵育，2-10℃洗脱后收集溶液进行透析，冷冻干燥即得用于增强抗生素药效的分子印迹材料。
10.根据权利要求9所述的用于增强抗生素药效的分子印迹材料的制备方法，其特征在于：所述用甲苯和丙酮冲洗后干燥为使用通风橱自然风干。
技术总结