本发明涉及生物医用材料技术领域，特别是涉及一种可稳定存储的磁性纳米微粒及其制备方法。
背景技术：
磁性纳米粒子在成像和诊断领域具有很好的应用前景，特别是fe3o4，是一种磁性强、生物相容性好的纳米粒子，但是其粒径小、比表面积大而易发生团聚，目前市面上销售的磁性纳米粒子在使用前均需要超声处理，以分散团聚的磁珠，但是超声方法无法从根本上提高粒子在水溶液中的分散性，而且超声方法会对人的听觉造成一定的损伤。因此，开发一种可以稳定存储的磁性纳米粒子具有重要意义。
聚2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱中磷酰胆碱(pmpc)同时具有正电荷和负电荷，可形成水合层，因此具有亲水性良好、表面吸附能力差，体内循环时间长等特点。如果能够将pmpc修饰在纳米粒子的表面，在纳米粒子表面形成水合层，以减少纳米粒子的团聚，可实现较好的储存稳定性。
目前用于修饰磁性纳米粒子的pmpc主要是通过活性聚合形成的。孙晓燕(磷酸胆碱基聚合物/fe3o4纳米复合材料的制备及性能研究，2012，学位论文)通过原子转移自由基聚合方法(atrp)，将mpc单体聚合到磁性纳米粒子表面，反应6小时后得到pmpc/fe3o4,磁性纳米粒子可以稳定存放24h。然而活性聚合方法在合成过程中操作过程繁琐、合成条件较为苛刻，限制了其在于工业生产中的应用。因此设计一种操作简单、反应条件温和的方法在磁珠表面原位形成磷酰胆碱基材料，对提高磁性纳米粒子的稳定性及实现其工业化生产具有重要意义。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术中pmpc/fe3o4磁性纳米粒子合成过程繁琐，条件苛刻不利于工业生产的缺陷，而提供一种可稳定存储的磁性纳米微粒及其制备方法。该方法以fe3o4磁性纳米粒子为内核，对其表面进行双键化修饰，然后进行原位自由基聚合形成高分子壳层。合成步骤简单，且不需要严格无氧，反应条件温和便于工业化生产。
为实现本发明的目的所采用的技术方案是：
一种可稳定存储的磁性纳米微粒的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：制备磁性纳米粒子；
步骤2：将所得磁性纳米粒子和3-甲基丙烯酰胺基多巴胺分别分散于dmso，将3-甲基丙烯酰胺基多巴胺的dmso混悬液滴加至磁性纳米粒子的dmso混悬液，超声使均匀分散得表面具有双键的磁性纳米粒子混悬液；
步骤3：分别取n-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐酸盐的水溶液、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱的水溶液、n,n’-亚甲基双丙烯酰胺的dmso溶液、四甲基乙二胺的水溶液和过硫酸铵的水溶液，依次滴加至步骤2所得的表面具有双键的磁性纳米粒子混悬液中，氮气保护反应，处理得磷酰胆碱基的磁性纳米微粒。
在上述制备方法中，步骤1中磁性纳米粒子的制备方法为：惰性气体保护下，将亚硫酸钠水溶液和氨水依次加入至fecl3·6h2o水溶液中，60-70℃反应0.5-1h，冷却至室温后搅拌1-2h，离心取上清液。
在上述制备方法中，fecl3·6h2o、氨水和亚硫酸钠的质量比为(5-8)：(9-12)：1。
在上述制备方法中，fecl3·6h2o水溶液的浓度为30-40mg/ml，亚硫酸钠水溶液的浓度为20-30mg/ml。
在上述制备方法中，步骤2中，3-甲基丙烯酰胺基多巴胺和磁性纳米粒子的质量比为(2-12)：1。
在上述制备方法中，步骤2中，磁性纳米粒子的dmso混悬液的浓度为10mg/ml，3-甲基丙烯酰胺基多巴胺的dmso混悬液的浓度为500mg/ml。
在上述制备方法中，步骤3中，表面具有双键的磁性纳米粒子、n-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐酸盐的水溶液，n,n’-亚甲基双丙烯酰胺(bis)的dmso溶液，四甲基乙二胺的水溶液，过硫酸铵的水溶液浓度为100mg/ml，2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱的水溶液的浓度为400mg/ml，表面具有双键的磁性纳米粒子混悬液浓度为10mg/ml。
在上述制备方法中，步骤3中，n-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐酸盐、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱、n,n’-亚甲基双丙烯酰胺、四甲基乙二胺和过硫酸铵的质量比为(0.3-0.9)：(0.5-0.8)：(8-20)：(0.4-0.8):(1-3)：1。
本发明的另一方面，上述制备方法制备的可稳定存储的磁性纳米微粒，4℃条件下，能够稳定的存在于水中28天而不发生团聚。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.本发明提供的可稳定存储的磁性纳米微粒的制备方法，以fe3o4磁性纳米粒子为内核，对其表面进行双键化修饰，然后进行原位自由基聚合形成高分子壳层。合成步骤简单，且不需要严格无氧，反应条件温和便于工业化生产。
2.本发明制备的磁性纳米微粒具有良好的亲水性，良好的生物相容性，能够提高磁性纳米粒子的稳定性，可广泛应用于磁共振成像、生物磁分离等生物医学领域。
附图说明
图1所示为磁性纳米粒子的粒径图。
图2所示为表面具有双键的磁性纳米粒子和磷酰胆碱基的磁性纳米微粒的粒径图。
其中，分界线左侧a代表表面具有双键的磁性纳米粒子；分界线右侧b代表磷酰胆碱基磁性纳米粒子。
图3所示为磁性纳米粒子的透射电镜图。
图4所示为磷酰胆碱基的磁性纳米微粒的电镜图。
图5所示为磷酰胆碱基的磁性纳米微粒的透射电镜能谱图。
图6所示为磁性纳米粒子的富集(左)和分散(右)。
其中a为有磁铁，b为无磁铁。
图7所示为磁性纳米粒子和磷酰胆碱基磁性纳米微粒储存粒径图。
其中a为雌性纳米粒子，b为磷酰胆碱基的磁性纳米微粒，a为第一天，b为第28天。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
1.制备磁性纳米粒子
将13gfecl3·6h2o溶于200ml去离子水中，搅拌均匀并通氮气保护；然后将100ml亚硫酸钠溶液(浓度20mg/ml)加入到上述溶液中，混合均匀；随后将20ml氨水(密度：0.91)加入到上述溶液中，搅拌并加热到65±2℃，反应0.5h；反应结束后将反应体系冷却至室温，继续搅拌1.5h；将上述液体离心(8000rpm，10min)后取上清，冷藏保存。
2.制备表面具有双键的磁性纳米粒子
取100mg的磁性纳米粒子溶于10mldmso中，取1g3-甲基丙烯酰胺基多巴胺溶于2mldmso中，超声3min；将上述3-甲基丙烯酰胺基多巴胺溶液在超声中滴入磁性纳米粒子溶液，继续超声4次，每次3min；将上述溶液置于振荡器中震荡20h，然后用dmso洗涤3-5次，冷藏保存。
3.制备磷酰胆碱基的磁性纳米微粒
分别将n-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐酸盐(apm)，四甲基乙二胺(temed)，过硫酸铵(aps)溶于去离子水中制备100mg/ml的溶液，2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱(mpc)溶于去离子水中制备400mg/ml的溶液，n,n’-亚甲基双丙烯酰胺溶于dmso制备100mg/ml的溶液；取134μlapm，557μlmpc，116μln,n’-亚甲基双丙烯酰胺，412μltemed，206μlaps溶液依次加到85mg表面具有双键的磁性纳米粒子溶液(10mg/ml)中，搅拌，通氮气保护，反应2h；反应结束后收集产物，并用磷酸盐缓冲液(ph7.4)冲洗4-8次。
利用动态光散射仪测定实施例1制备的磷酰胆碱基磁性纳米微粒进行表征，存放一天的纳米微粒粒径是116.4±10nm，存放四周后纳米微粒粒径是129±24.6nm。
从图1和图2中可以看出，磷酰胆碱基的磁性纳米微粒的粒径比磁性纳米粒子粒径和表面具有双键的磁性纳米粒子粒径都要大，这说明磷酰胆碱基的磁性纳米微粒表面接有高分子材料，使得磷酰胆碱基的磁性纳米微粒的粒径有所增大。从图3和图4中可以看到，与磁性纳米粒子相比，磷酰胆碱基的磁性纳米微粒表面有一层物质，从图5中可以看到这层物质有p元素存在，而磷酰胆碱基的磁性纳米粒子表面的高分子材料中存在p元素，因此综合图4和图5，说明在磁珠表面的物质是pmpc。图6中可以看出，在有磁铁的情况下，磁珠可以富集在磁铁的表面，而在撤去磁铁后，磁性纳米粒子又可以很好的分散在水中，说明纳米粒子具有磁性且水中分散性好。综合以上结果，可以说明磷酰胆碱基的磁性纳米微粒的成功制备。图7中可以看出，磁性纳米粒子的粒径在第一天的粒径大约是35nm，而存放四周后，纳米粒子发生团聚现象，粒径明显增大，而是磷酰胆碱基的磁性纳米粒子在4℃条件下存放四周后粒径并没有发生太大的变化，这是由于表面具有亲水性良好的磷酰胆碱基高分子材料，因此磷酰胆碱基的磁性纳米粒子能够稳定的存在于水中而不发生团聚，说明磷酰胆碱基的磁性纳米粒子具有存储稳定性。
实施例2
1.制备磁性纳米粒子
将36gfecl3·6h2o溶于1200ml去离子水中，搅拌均匀并通氮气保护；将360ml亚硫酸钠溶液(浓度20mg/ml)加入到上述溶液中，混合均匀；将71ml氨水加入到上述溶液中，搅拌并加热到68±2℃，反应0.5h；反应结束后将反应体系冷却至室温，继续搅拌2h；将上述液体离心(7000rpm，12min)后取上清，冷藏保存。
2.制备表面具有双键的磁性纳米粒子
取150mg的磁性纳米粒子溶于15mldmso中，取300mg3-甲基丙烯酰胺基多巴胺溶于0.6mldmso中，超声3min；将上述3-甲基丙烯酰胺基多巴胺溶液在超声中滴入磁性纳米粒子溶液，继续超声4次，每次3min；将上述溶液置于振荡器中震荡21h，然后用dmso洗涤5次，冷藏保存。
3.制备磷酰胆碱基的磁性纳米微粒
分别将n-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐酸盐(apm)，四甲基乙二胺(temed)，过硫酸铵(aps)溶于去离子水中制备100mg/ml的溶液，2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱(mpc)溶于去离子水中制备400mg/ml的溶液，n,n’-亚甲基双丙烯酰胺溶于dmso制备100mg/ml的溶液；取50μlapm，200μlmpc，40μln,n’-亚甲基双丙烯酰胺，100μltemed，100μlaps溶液依次加到300μl表面具有双键的磁性纳米粒子表面具有双键的磁性纳米粒子溶液(10mg/ml)中，搅拌，通氮气保护，反应2h；反应结束后收集产物，并用磷酸盐缓冲液(ph7.4)冲洗5次。
利用动态光散射仪测定实施例2制备的磷酰胆碱基磁性纳米微粒进行表征，存放一天的纳米微粒粒径是90±25nm，存放四周后纳米微粒粒径是112±36nm。
实施例3
1.制备磁性纳米粒子
将28.8gfecl3·6h2o溶于400ml去离子水中，搅拌均匀并通氮气保护；将120ml亚硫酸钠溶液(浓度30mg/ml)加入到上述溶液中，混合均匀；将47ml氨水加入到上述溶液中，搅拌并加热到62±2℃，反应0.5h；反应结束后将反应体系冷却至室温，继续搅拌2h；将上述液体离心(6000rpm，15min)后取上清，冷藏保存。
2.制备表面具有双键的磁性纳米粒子
取200mg的磁性纳米粒子溶于20mldmso中，取2.4g3-甲基丙烯酰胺基多巴胺溶于4.8mldmso中，超声3min；将上述3-甲基丙烯酰胺基多巴胺溶液在超声中滴入磁性纳米粒子溶液，继续超声4次，每次3min；将上述溶液置于振荡器中震荡24h，然后用dmso洗涤5次，冷藏保存。
3.制备磷酰胆碱基的磁性纳米微粒
分别将n-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐酸盐(apm)，四甲基乙二胺(temed)，过硫酸铵(aps)溶于去离子水中制备100mg/ml的溶液，2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱(mpc)溶于去离子水中制备400mg/ml的溶液，n,n’-亚甲基双丙烯酰胺溶于dmso制备100mg/ml的溶液；取80μlapm，5000μlmpc，80μln,n’-亚甲基双丙烯酰胺，300μltemed，100μlaps溶液依次加到900μl表面具有双键的磁性纳米粒子溶液(10mg/ml)中，搅拌，通氮气保护，反应2h；反应结束后收集产物，并用磷酸盐缓冲液(ph7.4)冲洗5次。
利用动态光散射仪测定实施例3制备的磷酰胆碱基磁性纳米微粒进行表征，存放一天的纳米微粒粒径是92±26nm，存放四周后纳米微粒粒径是115±31nm。
依照本发明内容进行工艺参数调整，均可制备本发明的磷酰胆碱基磁性纳米微粒，并表现出与实施例1基本一致的性能。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
1.一种可稳定存储的磁性纳米微粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：制备磁性纳米粒子；
步骤2：将所得磁性纳米粒子和3-甲基丙烯酰胺基多巴胺分别分散于dmso，将3-甲基丙烯酰胺基多巴胺的dmso混悬液滴加至磁性纳米粒子的dmso混悬液，超声使均匀分散得表面具有双键的磁性纳米粒子混悬液；
步骤3：分别取n-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐酸盐的水溶液、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱的水溶液、n,n’-亚甲基双丙烯酰胺的dmso溶液、四甲基乙二胺的水溶液和过硫酸铵的水溶液，依次滴加至步骤2所得的表面具有双键的磁性纳米粒子混悬液中，氮气保护反应，处理得磷酰胆碱基的磁性纳米微粒。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中磁性纳米粒子的制备方法为：惰性气体保护下，将亚硫酸钠水溶液和氨水依次加入至fecl3·6h2o水溶液中，60-70℃反应0.5-1h，冷却至室温后搅拌1-2h，离心取上清液。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，fecl3·6h2o、氨水和亚硫酸钠的质量比为(5-8)：(9-12)：1。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，fecl3·6h2o水溶液的浓度为30-65mg/ml，亚硫酸钠水溶液的浓度为20-30mg/ml。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2中，3-甲基丙烯酰胺基多巴胺和磁性纳米粒子的质量比为(2-12)：1。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤2中，磁性纳米粒子的dmso混悬液的浓度为10mg/ml，3-甲基丙烯酰胺基多巴胺的dmso混悬液的浓度为500mg/ml。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3中，n-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐酸盐的水溶液，n,n’-亚甲基双丙烯酰胺的dmso溶液，四甲基乙二胺的水溶液，过硫酸铵的水溶液浓度为100mg/ml，2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱的水溶液的浓度为400mg/ml，表面具有双键的磁性纳米粒子混悬液浓度为10mg/ml。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3中，表面具有双键的磁性纳米粒子、n-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐酸盐、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱、n,n’-亚甲基双丙烯酰胺、四甲基乙二胺和过硫酸铵的质量比为(0.3-0.9)：(0.5-0.8)：(8-20)：(0.4-0.8):(1-3)：1。
9.如权利要求1-8所述的制备方法制备的可稳定存储的磁性纳米微粒，其特征在于，4℃条件下，能够稳定的存在于水中28天而不发生团聚。
技术总结