本发明属于有机合成和固定化酶技术领域，具体涉及一种ucst型非离子水溶性聚合物及其制备方法和应用。
背景技术：
热响应性聚合物可以表现出较低的临界溶液温度(lcst)和/或较高的临界溶液温度(ucst)，但是迄今为止，只有少数聚合物在相关温度范围(0-100℃)的水中表现出ucst，即在冷却时与溶液相分离。并且基于离子相互作用的ucst型聚合物，如甜菜碱类聚合物，很难在生理条件下使用(即存在盐等)，这极大地限制了它们的潜在应用。
非离子型ucst聚合物，如聚丙烯酰基甘氨酰胺(pnaga)，其相变依赖于聚合物侧基之间的氢键，随着温度的升高，聚合物侧基之间的氢键在吸热过程中断裂，在放热过程中被与水分子的氢键取代，其在生理条件下具有尖锐而强劲的相变，能够扩大ucst型聚合物的应用范围。然而，非离子型ucst聚合物在聚合过程中出现的痕量离子基团会显著影响其相变，甚至抑制其ucst行为。此外，pnaga及其衍生物表现出明显的迟滞现象，并表现出缓慢的相变，阻止了它们在许多需要急剧和快速相变的应用中使用。
β-葡萄糖苷酶，又称β-d-吡喃葡萄糖苷水解酶，是一种能够水解结合于末端非还原性的β-d-葡萄糖苷键，同时释放出β-d-葡萄糖和相应的配基的水解酶。β-葡萄糖苷酶广泛存在于自然界许多植物、昆虫、酵母、曲霉、木霉及细菌体内。它参与生物体的糖代谢，对于维持生物体正常生理功能起着重要的作用。此外，β-葡萄糖苷酶能将茶、果、蔬中的风味前体物质水解为具有浓郁天然风味的香气物质，并且还能协助纤维素酶降解纤维素。然而，游离β-葡萄糖苷酶存在温度稳定性差以及难以重复利用等缺点限制其在多数情况下的应用，因此对β-葡萄糖苷酶固定化的研究具有重要的理论和实用价值。
技术实现要素：
针对现有技术中存在不足，本发明提供了一种ucst型非离子水溶性聚合物及其制备方法和应用。本发明中，将丙烯酰胺和丙烯腈可逆加成-断裂链转移聚合，合成了具有高临界溶解温度的ucst型非离子水溶性聚合物；所述ucst型非离子水溶性聚合物在生理条件下存在ucst，且低迟滞，具有高临界溶解温度，能够很好的应用于固定化lyta标签β-葡萄糖苷酶领域中。
本发明中首先提供了一种ucst型非离子水溶性聚合物，所述聚合物通过将丙烯酰胺和丙烯腈可逆加成-断裂链转移聚合得到；所述聚合物的化学式为mpegx-b-p(aamy-co-anz)，其中b表示mpeg和两个单体之间以嵌段聚合的方式结合，其中x表示聚乙二醇单甲醚的聚合度，y、z分别为丙烯酰胺和丙烯腈在聚合物中的占比（%），y、z值为不包括0和100的任意值，所述聚合物结构式为：
进一步的，所述mpegx-b-p(aamy-co-anz)中，通过改变丙烯酰胺和丙烯腈的投入量在0℃-100℃范围内调节聚合物ucst。
本发明中还提供了上述ucst型非离子水溶性聚合物的制备方法，具体包括如下步骤：
（1）苄基三硫代碳酸酯(btpa)的制备：
将3-巯基丙酸(mpa)和二硫化碳(cs2)分别缓慢滴入koh溶液中，使其在室温下油浴反应，然后滴加溴化苄，升温至85℃回流反应；反应结束后冷却，接着向反应液中加入氯仿和浓盐酸，搅拌，去离子水清洗至上相澄清；去除上相，并将下相浓缩，然后加入二氯甲烷，低温结晶，过滤，洗涤，得到黄色粉末样品。
其中，koh溶液的浓度为0.1g/ml-0.12g/ml，mpa和cs2的用量比为5ml：9ml；溴化苄、氯仿和浓盐酸的用量为12g:140ml:18ml；所述二氯甲烷的加入量为4~6ml；所述油浴反应的时间为5h；所述回流反应的时间为12h。
（2）mpegx大分子链转移剂的制备：
将4-二甲氨基吡啶和n，n'-二环己基碳酰亚胺(dcc)溶于二氯甲烷中，冷却至0℃；
将聚乙二醇单甲醚(mpegx)、btpa和二氯甲烷混合，搅拌均匀得混合液，然后加入溶有4-二甲氨基吡啶和n，n'-二环己基碳酰亚胺的二氯甲烷，室温下反应，过滤，滤液浓缩，接着加入过量冷乙醚沉淀、过滤，得到粗产物；
重复将粗产物溶于二氯甲烷中，加入过量冷乙醚沉淀、过滤，最后干燥，得到浅黄色粉末，即为mpegx大分子链转移剂。
其中，4-二甲氨基吡啶、n，n'-二环己基碳酰亚胺、二氯甲烷的用量为0.1g:1g:20ml；mpegx用量为0.05mmol-0.06mmol、btpa用量为1.6g-2.0g、二氯甲烷用量为100.00ml-110.00ml，所述反应时间为48h-50h。
（3）mpegx-b-p(aamy-co-anz)的制备：
将丙烯酰胺（aam）、丙烯腈（an）、mpegx大分子链转移剂、偶氮二异丁腈和n，n二甲基甲酰胺在搅拌条件下通入氮气，油浴反应，反应结束后冷却，接着加入过量甲醇，过滤，沉淀用去离子水透析，冷冻干燥，得到成品，即mpegx-b-p(aamy-co-anz)，其中x表示聚乙二醇单甲醚的聚合度，y、z分别为丙烯酰胺和丙烯腈在聚合物中的占比（%）。
进一步的，所述丙烯酰胺、丙烯腈、mpegx大分子链转移剂的摩尔比为26-30：1.89-25.09：0.04-0.06。
进一步的，所述丙烯酰胺、偶氮二异丁腈和n，n二甲基甲酰胺的用量比为26-30mmol：0.1-0.2mmol：20-25ml。
进一步的，所述油浴反应的条件为：70℃，250rpm，反应时间为24h。
进一步的，所述透析的时间为30h-48h。
本发明中还提供了上述ucst型非离子水溶性聚合物在固定化lyta标签β-葡萄糖苷酶中的应用。
进一步的，所述应用包括如下步骤：
将mpegx-b-p(aamy-co-anz)溶解于水中，加入戊二醛，搅拌反应、低温离心、去离子水洗涤，然后将沉淀和lyta标签β-葡萄糖苷酶溶于磷酸盐缓冲液，搅拌反应、低温离心、磷酸盐缓冲液洗涤，得到固定化lyta标签β-葡萄糖苷酶。
其中，所述戊二醛用量为0.01g-0.05g；所述lyta标签β-葡萄糖苷酶蛋白含量为0-0.3mg/ml；所述两次搅拌反应的条件均为：反应温度45℃-70℃，反应时间1-24小时。
本发明的有益效果如下：
本发明利用酯化反应将聚乙二醇单甲醚嵌段与btpa结合，然后通过可逆加成-断裂链转移聚合技术合成非离子型聚合物，与现有技术相比，本发明制备的聚合物具有高临界相转变温度范围广、迟滞性小等优点，其浊点可在0-100℃范围内调节，相变温度迟滞性在1℃以内。本发明可通过控制丙烯腈投入量、mpeg的分子量、聚合物浓度和在聚合物水溶液中加入盐的种类以及浓度来调控得到特定的相变温度。
本发明制备的固定化lyta标签β-葡萄糖苷酶比游离酶具有更好的温度稳定性，且固定化lyta标签β-葡萄糖苷酶酶在循环催化十次后依旧保持百分之五十以上的活性。
附图说明
图1是mpegx-b-p(aamy-co-anz)的合成原理图，其中a是btpa的合成过程，b是mpegx大分子链转移剂的合成过程，c是mpegx-b-p(aamy-co-anz)的合成过程。
图2是btpa(a)、mpeg45大分子链转移剂(b)、mpeg113大分子链转移剂(c)的1hnmr图。
图3是实施例1-4所制备的不同mpegx-b-p(aamy-co-anz)的1hnmr图，其中a为mpeg45-b-p(aam74-co-an23)，b为mpeg113-b-p(aam73-co-an22)，c为mpeg113-b-p(aam71-co-an24)，d为mpeg113-b-p(aam70-co-an26)。
图4是实施例1-4所制备的不同mpegx-b-p(aamy-co-anz)的红外图，其中a为mpeg45-b-p(aam74-co-an23)，b为mpeg113-b-p(aam73-co-an22)，c为mpeg113-b-p(aam71-co-an24)，d为mpeg113-b-p(aam70-co-an26)。
图5是实施例1-4所制备的mpegx-b-p(aamy-co-anz)的不同浓度浊点曲线，其中a为mpeg45-b-p(aam74-co-an23)，b为mpeg113-b-p(aam73-co-an22)，c为mpeg113-b-p(aam71-co-an24)，d为mpeg113-b-p(aam70-co-an26)。
图6是实施例2-4所制备的温敏聚合物mpeg113-b-p(aam73-co-an22)(a)、mpeg113-b-p(aam71-co-an24)(b)和mpeg113-b-p(aam70-co-an26)(c)在10℃、20℃、30℃、40℃和50℃的状态。
图7是氯化钠、硫酸钠和硫氰酸钠对实施例1-4所制备的温敏聚合物mpeg45-b-p(aam74-co-an23)(a)、mpeg113-b-p(aam73-co-an22)(b)、mpeg113-b-p(aam71-co-an24)(c)和mpeg113-b-p(aam70-co-an26)(d)的浊点影响曲线。
图8是在不同固定条件下固定化lyta标签β-葡萄糖苷酶的酶固载量，其中a为戊二醛用量，b为不同酶浓度，c为不同ph，d为不同固定化时间。
图9是固定化lyta标签β-葡萄糖苷酶和游离酶在70℃下保存1-5小时的相对活性图。
图10是固定化lyta标签β-葡萄糖苷酶循环利用十次的相对活性图。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
实施例1：mpeg45-b-p(aam74-co-an23)的制备
mpeg45-b-p(aam74-co-an23)的合成流程图如图1，图中a是btpa的合成过程，b是mpegx大分子链转移剂的合成过程，c是mpegx-b-p(aamy-co-anz)的制备过程。具体步骤如下：
(1)苄基三硫代碳酸酯(btpa)的制备：
称取6.5g氢氧化钾溶解在62.5ml水中搅拌，然后滴入5ml3-巯基丙酸和9ml二硫化碳，室温下油浴反应5小时，然后，滴入1h内滴完12g溴化苄，并将油浴升温至85.0℃，回流反应12小时。反应结束后使溶液自然冷却至室温，向反应液加入140ml氯仿和18ml，边加边搅拌，得混合液；接着用去离子水清洗混合溶液，直至上相澄清，去除上相，将下相浓缩成橙色油状液体，加入4ml二氯甲烷，放冰箱中冷冻以降低温度，使产物结晶，之后用布氏漏斗进行过滤并用清水洗涤固体除去溶剂，最终得到黄色粉末样品。
(2)mpeg45大分子链转移剂的制备：
将0.1g4-二甲氨基吡啶和1gn，n'-二环己基碳酰亚胺溶于20ml二氯甲烷中，冷却至0℃；
将4gmpeg45、1.6gbtpa和100ml二氯甲烷混合，搅拌均匀得混合液，然后加入溶有4-二甲氨基吡啶和n，n'-二环己基碳酰亚胺的二氯甲烷溶液，室温下反应48h，过滤，滤液浓缩，接着加入过量冷乙醚沉淀、过滤，得到粗产物；
重复将粗产物溶于二氯甲烷中，加入过量冷乙醚沉淀、过滤，最后干燥，得到浅黄色粉末，即为mpeg45大分子链转移剂。
(3)mpeg45-b-p(aam74-co-an23)的制备：
将2.00g28.14mmol丙烯酰胺、0.50g9.43mmol丙烯腈、0.12g0.05mmolmpeg45大分子链转移剂、0.02g0.12mmol偶氮二异丁腈和25mln，n二甲基甲酰胺装入配有磁力搅拌的单口烧瓶中；通氮气半小时除去烧瓶中的空气，溶液在氮气保护下油浴反应24小时；反应完成后将溶液置于冰水中冷却，用过量甲醇沉淀，得到白色固体，用去离子水透析两天，冷冻干燥，得到白色固体即mpeg45-b-p(aam74-co-an23)。
图2（a）、图2（b）分别为btpa、mpeg45大分子链转移剂的1hnmr图，图2（a）中，1hnmr(400mhz，cdcl3)δ(ppm)：7.33(5h，arh)，4.64(2h，arch2-)，3.65(2h，-ch2cooh)，2.87(2h，-c(＝s)sch2)。图中可见，7.33处的峰是苯环上氢原子的峰，苯环与硫之间的氢原子出峰位置在4.64，靠近氧的氢原子出峰位置为3.65，靠近硫的氢原子出峰位置为2.87。图2（b）中，1hnmr(400mhz，cdcl3)δ(ppm)：7.29(5h，arh)，4.62(2h，arch2-)，4.27(2h，-ch2ococh2-)，3.65(452h，-ch2ch2o-)，3.39(3h，ch3o-)，2.82(2h，-ch2ococh2ch2sc-(＝s)-)。与btpa相比主要多了mpeg45中氢原子的峰，出峰位置是3.65，峰面积为180。由此表明btpa以及mpeg45大分子链转移剂合成成功。
图3（a）为mpeg45-b-p(aam74-co-an23)的1hnmr图，图中，mpeg45-b-p(aam74-co-an23)：1hnmr(400mhz，dmso-d6)δ(ppm)：1.0-1.9(polymerbackbone，-ch2-)，1.9-2.45(polymerbackbone，−ch−conh2，−ch−cn−)，3.51(−o−ch2−ch2−)，6.88(ph，nh2)，2.49为dmso的溶剂峰，3.33为水峰。表明温敏聚合物mpeg45-b-p(aam74-co-an23)成功合成，并且通过核磁计算得到丙烯酰胺和丙烯腈的聚合度分别为1901和569。
实施例2：mpeg113-b-p(aam73-co-an22)的制备
（1）参照实施例1中步骤（1）制备苄基三硫代碳酸酯(btpa)。
（2）mpeg113大分子链转移剂的制备：
将0.1g4-二甲氨基吡啶和1gn，n'-二环己基碳酰亚胺溶于20ml二氯甲烷中，冷却至0℃；
将10gmpeg113、1.6gbtpa和100ml二氯甲烷混合，搅拌均匀得混合液，然后加入溶有4-二甲氨基吡啶和n，n'-二环己基碳酰亚胺的二氯甲烷溶液，室温下反应48h，过滤，滤液浓缩，接着加入过量冷乙醚沉淀、过滤，得到粗产物；
重复将粗产物溶于二氯甲烷中，加入过量冷乙醚沉淀、过滤，最后干燥，得到浅黄色粉末，即为mpeg45大分子链转移剂。
（3）mpeg113-b-p(aam73-co-an22)的制备：
将2.00g28.14mmol丙烯酰胺、0.50g9.43mmol丙烯腈、0.28g0.05mmolmpeg113大分子链转移剂、0.02g0.12mmol偶氮二异丁腈和25mln，n二甲基甲酰胺装入配有磁力搅拌的单口烧瓶中；通氮气半小时除去烧瓶中的空气，溶液在氮气保护下油浴反应24小时；反应完成后将溶液置于冰水中冷却，用过量甲醇沉淀，得到白色固体，用去离子水透析两天，冷冻干燥，得到白色固体即mpeg113-b-p(aam74-co-an23)。
图2（c）为mpeg113大分子链转移剂的1hnmr图，图中，1hnmr(400mhz，cdcl3)δ(ppm)：7.29(5h，arh)，4.62(2h，arch2-)，4.27(2h，-ch2ococh2-)，3.65(452h，-ch2ch2o-)，3.39(3h，ch3o-)，2.82(2h，-ch2ococh2ch2sc-(＝s)-)。与btpa相比主要多了mpeg113中氢原子的峰，出峰位置是3.65，峰面积为452。由此表明btpa以及mpeg113大分子链转移剂合成成功。
图3（b）为mpeg113-b-p(aam73-co-an22)的1hnmr图，图中，mpeg113-b-p(aam73-co-an22)：1hnmr(400mhz，dmso-d6)δ(ppm)：1.0-1.9(polymerbackbone，-ch2-)，1.9-2.45(polymerbackbone，−ch−conh2，−ch−cn−)，3.51(−o−ch2−ch2−)，6.88(ph，nh2)。由此表明温敏聚合物mpeg113-b-p(aam73-co-an22)成功合成，并且通过核磁计算得到丙烯酰胺和丙烯腈的聚合度分别为2147和655。
实施例3：mpeg113-b-p(aam71-co-an24)的制备
与实施例2基本相同，只有如下区别：步骤（3）中丙烯腈的用量为0.60g，11.32mmol。
图3（c）为mpeg113-b-p(aam71-co-an24)的1hnmr图，图中，1hnmr(400mhz，dmso-d6)δ(ppm)：1.0-1.9(polymerbackbone，-ch2-)，1.9-2.45(polymerbackbone，−ch−conh2，−ch−cn−)，3.51(−o−ch2−ch2−)，6.88(ph，nh2)。由此表明温敏聚合物mpeg113-b-p(aam71-co-an24)成功合成，并且通过核磁计算得到丙烯酰胺和丙烯腈的聚合度分别为1530和516。
实施例4：mpeg113-b-p(aam70-co-an26)的制备
与实施例2基本相同，只有如下区别：步骤（3）中丙烯腈的用量为0.70g，13.21mmol。
图3（d）为mpeg113-b-p(aam71-co-an24)的1hnmr图，图中，mpeg113-b-p(aam70-co-an26)：1hnmr(400mhz，dmso-d6)δ(ppm)：1.0-1.9(polymerbackbone，-ch2-)，1.9-2.45(polymerbackbone，−ch−conh2，−ch−cn−)，3.51(−o−ch2−ch2−)，6.88(ph，nh2)。由此表明温敏聚合物mpeg113-b-p(aam71-co-an24)成功合成，并且通过核磁计算得到丙烯酰胺和丙烯腈的聚合度分别为1727和642。
分别将实施例1~4中得到的聚合物和光谱级溴化钾粉末一起研磨，然后压成1mm薄片，在4000-500cm-1内进行ft-ir光谱测量。图4为不同mpegx-b-p(aamy-co-anz)的红外图，其中a为mpeg45-b-p(aam74-co-an23)，b为mpeg113-b-p(aam73-co-an22)，c为mpeg113-b-p(aam71-co-an24)，d为mpeg113-b-p(aam70-co-an26)。从图中可以看出，3346cm-1处的峰是由于n-h伸缩振动。在约2933cm-1、1445cm-1、1339cm-1和1119cm-1的区域中的弱吸收带是由主链中亚甲基引起的。2242cm-1处的峰是丙烯腈中腈基的特征峰。1653cm-1处的峰是羰基引起的。由此表明温敏聚合物合成成功。
实施例5：
本实施例中通过在0.02g/ml、0.04g/ml、0.06g/ml、0.08g/ml、0.1g/ml五个浓度下测试了聚合物水溶液，获得了波长为500nm时的透光率来考察了实施例1~4中制备得到的聚合物的热响应性。
图5显示了mpeg45-b-p(aam74-co-an23)(a)、mpeg113-b-p(aam73-co-an22)(b)、mpeg113-b-p(aam71-co-an24)(c)和mpeg113-b-p(aam70-co-an26)(d)的热响应数据。从图中可以看出，mpeg45-b-p(aam74-co-an23)、mpeg113-b-p(aam73-co-an22)、mpeg113-b-p(aam71-co-an24)和mpeg113-b-p(aam70-co-an26)在0.1g/ml浓度下的浊点（升温）分别为18.8℃、24.9℃、33.6℃、40.9℃。mpeg45-b-p(aam74-co-an23)和mpeg113-b-p(aam74-co-an23)聚合物中，由于聚乙二醇单甲醚嵌段分子量的不同，其浊点也不同。聚乙二醇单甲醚分子量越低，亲水性越高，所以导致ucst型聚合物亲水性增加，且分子量越低，分子链长度越短，因此聚合物浊点会下降。mpeg113-b-p(aam73-co-an22)、mpeg113-b-p(aam71-co-an24)和mpeg113-b-p(aam70-co-an26)中，因为增加共聚物链上的氢中性丙烯腈基团的比例会降低聚合物的溶剂相互作用，即增加聚合物与聚合物的相互作用，从而导致相变温度向更高的温度转移，因此聚合物浊点显著上升。
mpeg113-b-p(aam73-co-an22)不同浓度下浊点（升温）为：0.02g/ml浊点为20.7℃、0.04g/ml浊点为22.9℃、0.06g/ml浊点为23.2℃、0.08g/ml浊点为24℃、0.1g/ml浊点为24.9℃。mpeg113-b-p(aam71-co-an24)不同浓度下浊点（升温）为：0.02g/ml浊点为28.5℃、0.04g/ml浊点为29.2℃、0.06g/ml浊点为30.1℃、0.08g/ml浊点为32.1℃、0.1g/ml浊点为33.6℃。mpeg113-b-p(aam70-co-an26)不同浓度下浊点（升温）为：0.02g/ml浊点为34.2℃、0.04g/ml浊点为36.1℃、0.06g/ml浊点为37.2℃、0.08g/ml浊点为38.5℃、0.1g/ml浊点为40.9℃。由此可见，浓度的增加增强了共聚物链间纠缠的形成，导致更大的团聚体的形成。浓度越高，聚合物链与水分子之间的氢键越弱，聚合物链内/链间的疏水相互作用越强，聚合物会形成聚集物。这是因为，浓度的增加增强了共聚物链间纠缠的形成，导致较大团聚体的形成；并且，浓度越高，聚合物链与水分子之间的氢键越弱，聚合物链内/链间的疏水相互作用越强，聚合物会形成聚集物。
在不同聚乙二醇单甲醚分子量和不同丙烯腈含量的聚合物中，其浊点在加热和冷却之间的迟滞效果非常小，在1℃以内，可以在需要快速相变的应用中使用。
图6为实施例2-4所制备的温敏聚合物mpeg113-b-p(aam73-co-an22)(a)、mpeg113-b-p(aam71-co-an24)(b)和mpeg113-b-p(aam70-co-an26)(c)在10℃、20℃、30℃、40℃和50℃的状态，从图中也可以看出，随着温度的持续降低，ucst型聚合物的水溶液越来越浑浊。这些聚合物的浊点越高，聚合物的混浊效果越明显。并且，这种可见的相变是可逆的，能通过重复的加热和冷却循环来观察。
根据图7所示，氯化钠、硫酸钠和硫氰酸钠对mpeg45-b-p(aam74-co-an23)、mpeg113-b-p(aam73-co-an22)、mpeg113-b-p(aam71-co-an24)和mpeg113-b-p(aam70-co-an26)的浊点（升温）产生不同影响。从图中可以看出，氯化钠对共聚物溶液的浊点影响最小，这是由于氯化钠是中性盐，对水分子影响小，而硫酸钠中硫酸根属于离液序列低的阴离子，促进了水-水相互作用的稳定性和结构，从而使浊点上升，同样硫氰酸根则属于离液序列高的的阴离子，增加了水溶液中的疏水作用，从而使共聚物浊点降低。由于极化效应、表面张力和直接离子结合等原因，加入硫氰酸钠和氯化钠可以降低浊点。硫酸钠对聚合物浊点的影响最为显著。在200mm时，mpeg113-b-p(aam71-co-an24)浊点从33.6℃上升到52℃，当溶液中有更多的离子时，它们会干扰水分子和共聚物链之间的氢键，扰乱了温敏聚合物链周围的正常水化壳。
实施例6：固定化lyta标签β-葡萄糖苷酶的制备
将0.1gmpeg113-b-p(aam71-co-an24)溶解于1ml水中，加入戊二醛，45℃下搅拌6小时。然后，在4℃下低温离心十分钟，取沉淀并用1ml去离子水清洗，重复操作两次，以去除剩余的戊二醛，其次，将沉淀和lyta标签β-葡萄糖苷酶酶溶于1mlph5的磷酸盐缓冲液，50℃搅拌反应4小时，之后，在4℃下低温离心十分钟，取沉淀并用1mlph5的磷酸盐缓冲液清洗，重复操作两次，得到固定化lyta标签β-葡萄糖苷酶，且固定化后的浊点为48℃。
本实施例中通过改变戊二醛用量、蛋白含量、ph以及固定化时间的条件，来测定lyta标签β-葡萄糖苷酶的固载量，进而得到最佳条件。由于lyta标签β-葡萄糖苷酶的最佳反应温度约为50℃，因此选择在50℃下固定化酶。
图8是在不同固定条件下固定化lyta标签β-葡萄糖苷酶的酶固载量，其中a为戊二醛用量，b为不同酶浓度，c为不同ph，d为不同固定化时间。从图中可以看出，0.03g戊二醛，蛋白含量为0.18mg/ml，ph5.0，固定化4h时，固定化lyta标签β-葡萄糖苷酶的酶固载量最高。
图9是固定化lyta标签β-葡萄糖苷酶和游离酶在70℃下保存1-5小时的相对活性图从图中可以看出，将游离和固定化酶在70℃下保持5h。高温保持1h后，固定化酶未有较大的失活，依然保留约88%的相对酶活力，而游离酶失活约20%。随着时间的推移，游离酶失活状况愈加严重，3h后仅剩下30%相对酶活力，5h后保留的相对酶活力不足10%。而固定化酶失活较为缓慢，5h后仍剩有近35%的酶活力。这是由于固定化纤维素酶的构象完整性随着多点共价键的形成而增强，从而有效地提高了热稳定性。
图10是固定化lyta标签β-葡萄糖苷酶循环利用十次的相对活性图，从图中可以看出，固定化酶在催化分解对硝基苯基-β-d-吡喃半乳糖苷重复10次以后，依然有50.6%的相对酶活力。其中一部分酶活力的损失时由于分离过程中不可避免地出现损耗，而且随着循环次数的增加，氢键作用也会变弱，固定化酶难以完全分离。因此本实验中多次循环利用的固定化纤维素酶可降低工业化应用成本。
所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。
1.一种ucst型非离子水溶性聚合物，其特征在于，所述聚合物通过将丙烯酰胺和丙烯腈可逆加成-断裂链转移聚合，再与mpeg嵌段聚合得到；所述聚合物的化学式为mpegx-b-p(aamy-co-anz)，其中b表示嵌段聚合方式，x表示聚乙二醇单甲醚的聚合度且x的范围为45~113，y、z分别为丙烯酰胺和丙烯腈在聚合物中的百分比。
2.根据权利要求1所述的ucst型非离子水溶性聚合物，其特征在于，所述ucst型非离子水溶性聚合物的结构式为：
3.根据权利要求1所述的ucst型非离子水溶性聚合物，其特征在于，所述ucst型非离子水溶性聚合物通过改变丙烯酰胺和丙烯腈的投入量在0℃-100℃范围内调节聚合物ucst。
4.一种ucst型非离子水溶性聚合物的制备方法，其特征在于，包括：
（1）苄基三硫代碳酸酯btpa的制备；
（2）mpegx大分子链转移剂的制备；
（3）mpegx-b-p(aamy-co-anz)的制备：
将丙烯酰胺aam、丙烯腈an、mpegx大分子链转移剂、偶氮二异丁腈和n，n二甲基甲酰胺在搅拌条件下通入氮气，油浴反应，反应结束后冷却，接着加入过量甲醇，过滤，沉淀用去离子水透析，冷冻干燥，得到成品，即mpegx-b-p(aamy-co-anz)。
5.根据权利要求4所述的ucst型非离子水溶性聚合物的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述丙烯酰胺、丙烯腈、mpegx大分子链转移剂的摩尔比为26-30：1.89-25.09：0.04-0.06。
6.根据权利要求4所述的ucst型非离子水溶性聚合物的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述丙烯酰胺、偶氮二异丁腈和n，n二甲基甲酰胺的用量比为26-30mmol：0.1-0.2mmol：20-25ml。
7.根据权利要求4所述的ucst型非离子水溶性聚合物的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述油浴反应的条件为：在70℃，250rpm下反应24h。
8.根据权利要求4所述的ucst型非离子水溶性聚合物的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述透析的时间为30h-48h。
9.权利要求1所述ucst型非离子水溶性聚合物在固定化lyta标签β-葡萄糖苷酶中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，包括：
将mpegx-b-p(aamy-co-anz)溶解于水中，加入戊二醛，搅拌反应、低温离心、去离子水洗涤，然后将沉淀和lyta标签β-葡萄糖苷酶溶于磷酸盐缓冲液，搅拌反应、低温离心、磷酸盐缓冲液洗涤，得到固定化lyta标签β-葡萄糖苷酶。
技术总结