本发明涉及一种低氧响应性可注射水凝胶及其制备方法，更具体地说，是利用超支化聚合物上未反应的双键和巯基化透明质酸上的巯基发生迈克尔加成反应的方法来构建凝胶体系，以硝基咪唑作为封端基团使得水凝胶具备低氧响应性。
背景技术：
水凝胶是指一种主链或支链含有大量亲水性基团，并被水溶胀具有三维网状结构的交联聚合物，它在水中溶胀而不溶解，既含有大量水分又能保持一定的形状。在外界物理和化学因素如温度、光、电、磁、声、力、ph值和化学物质等的刺激下，某些聚合物水凝胶的自身性质如相、体积、形状、光学、电场、力学、表面积、反应速率以及识别性能等将随之发生变化，同时对外做功，这种对外界环境变化具有刺激响应性的水凝胶称为智能水凝胶。智能水凝胶是集感知、驱动和信息处理于一体，形成类似于生物体、具有智能属性的一类功能材料。这些具有环境刺激响应行为特性的水凝胶材料在微环境传感领域具有广泛的应用前景。
硝基咪唑基团具有低氧响应性，在低氧条件下能够被还原剂还原成氨基咪唑基团，可利用亲疏水变化进行药物释放的调控。
超支化聚合物的合成较难控制，需控制比例、温度和反应时间以达到期望的超支化结构，且聚氨酯的结构可降解，有良好的生物相容性。
透明质酸作为一种天然大分子，具有良好的生物相容性，常作为生物医用材料。巯基化的透明质酸可在室温下和与酯键链接的双键反应，构成凝胶网络体系。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的不足，旨在利用巯基化透明质酸的巯基和超支化聚合物中未反应的活性双键的迈克尔加成反应，构建凝胶体系，以硝基咪唑作为封端基团使得水凝胶具备低氧响应性。
本发明的目的通过下述技术方案予以实现。
本发明的一种低氧响应性可注射水凝胶及其制备方法，按照下述步骤进行：
(1)将聚乙二醇二丙烯酸酯(pegda)的二甲基亚砜(dmso)溶液和乙二胺(eda)的二甲基亚砜(dmso)溶液混合均匀，聚乙二醇二丙烯酸酯的双键与乙二胺的活泼氢的摩尔比为1:(1.1-1.4)，在油浴中进行反应以使聚乙二醇二丙烯酸酯(pegda)上的双键与乙二胺(eda)上的氨基发生迈克尔加成反应得到超支化聚氨基酯(hb-pbae)；
(2)将2-(2-甲基-5-硝基-1h-咪唑-1-基)乙基丙烯酸酯的二甲基亚砜(dmso)溶液加入到步骤(1)的反应液中，2-(2-甲基-5-硝基-1h-咪唑-1-基)乙基丙烯酸酯的双键与步骤(1)中乙二胺的活泼氢的摩尔比为(0.2-0.8)：(1.1-1.4)，继续在油浴中反应以使2-(2-甲基-5-硝基-1h-咪唑-1-基)乙基丙烯酸酯上的双键与步骤(1)反应溶液中未反应的氨基进行反应得到硝基咪唑基团封端的超支化聚氨基酯(hb-pbae-mnz)；
步骤(1)反应结束后不进行提纯，直接添加2-(2-甲基-5-硝基-1h-咪唑-1-基)乙基丙烯酸酯进行反应，目的是使聚乙二醇二丙烯酸酯(pegda)和2-(2-甲基-5-硝基-1h-咪唑-1-基)乙基丙烯酸酯上的双键的总和与乙二胺上的活泼氢的摩尔比大于1，优选为1.5:1.25；
(3)将步骤(2)制得的硝基咪唑基团封端的超支化聚氨基酯(hb-pbae-mnz)的水溶液与巯基化透明质酸(ha-sh)的水溶液混合均匀，硝基咪唑基团封端的超支化聚氨基酯与巯基化透明质酸的质量比为(10-20)：1，充分反应以使硝基咪唑基团封端的超支化聚氨基酯,(hb-pbae-mnz)上未反应的双键与巯基化透明质酸(ha-sh)上的巯基发生迈克尔加成反应，生成三维网状立体聚合物。
步骤(1)中聚乙二醇二丙烯酸酯(pegda)与乙二胺(eda)在70-90℃油浴中反应5-7h。
步骤(2)中，2-(2-甲基-5-硝基-1h-咪唑-1-基)乙基丙烯酸酯与超支化聚氨基酯(hb-pbae)在70-90℃油浴中继续反应3-5h；2-(2-甲基-5-硝基-1h-咪唑-1-基)乙基丙烯酸酯的双键与步骤(1)中乙二胺的活泼氢的摩尔比为(0.2-0.5)：(1.1-1.4)。
步骤(2)中反应结束后用5倍量以上的乙醚对反应液进行提纯。
步骤(3)中硝基咪唑基团封端的超支化聚氨基酯(hb-pbae-mnz)水溶液的质量百分浓度为20wt％，巯基化透明质酸(ha-sh)水溶液的质量百分浓度为1wt％，二者按体积比1:1共混；通过涡旋搅拌使反应充分进行；成胶温度为室温，成胶时间为3-4min。
本发明的有益效果是：本发明的水凝胶制备方法简单，反应条件温和，制备得到的水凝胶生物相容性好，且具有低氧响应性，可以将本发明制备得到的低氧响应性可注射水凝胶应用于药物缓释等医学领域。
附图说明
图1为本发明实施例制得的hb-pbae-mnz的1h-nmr谱图；
图2为20wt％的hb-pbae-mnz和1wt％的ha-sh成胶图片；
图3为质量分数0.2％的hb-pbae-mnz的水溶液被等体积的0.1mg/ml的亚硫酸氢钠水溶液在常氧和低氧条件下还原4h之后的紫外吸收光谱图；
图4为20wt％的hb-pbae-mnz和1wt％的ha-sh所成水凝胶的可注射示意图；
图5为本发明实施例制得的2-(2-甲基-5-硝基-1h-咪唑-1-基)乙基丙烯酸酯的1h-nmr谱图。
具体实施方式
下面是对本发明的进一步说明，而不是限制本发明的范围。
取4g甲硝唑置于圆底烧瓶中并放入磁子，再加入70ml二氯甲烷，而后再向溶液中加入3ml三乙胺，并混合均匀。将10ml氯仿加入到恒压滴液漏斗中，再向恒压滴液漏斗中加入4ml丙烯酰氯，混合均匀，配好后逐滴加入到上述溶液中，用滴管轻轻搅拌后开始滴加。
提前准备好碎冰块放入铝盆中，加入适量水，用作冰水浴反应。将上述反应体系放入冰水浴中反应12h后再室温反应12h。
反应结束后，戴上布手套取出圆底烧瓶，用洁净的卫生纸将其擦干，打开每个瓶口用磁铁吸出小磁子。将反应用的冰水倒掉，将反应液抽滤后将滤液旋蒸进行浓缩，浓缩到约15ml后加入50ml氯仿进行稀释，之后用超纯水水洗三次，分液后在有机相中加入无水氯化钙颗粒进行过夜干燥，过滤后将滤液旋蒸，得到淡黄色固体产物，即制备得到2-(2-甲基-5-硝基-1h-咪唑-1-基)乙基丙烯酸酯。
利用1hnmr对本发明实施例制得的2-(2-甲基-5-硝基-1h-咪唑-1-基)乙基丙烯酸酯的化学结构进行表征，从图5中可以很明显地观察到咪唑基团上的氢原子在8.2ppm处的吸收峰、咪唑基团上的甲基在2.3ppm处的吸收峰、双键在5.9-6.6ppm处的吸收峰和亚甲基在3.8-4.3ppm处的吸收峰，很好地表征了2-(2-甲基-5-硝基-1h-咪唑-1-基)乙基丙烯酸酯的结构，由此可证明2-(2-甲基-5-硝基-1h-咪唑-1-基)乙基丙烯酸酯成功合成。
以乙二胺上的活泼氢:pegda-700上的双键＝1.25:1为例，说明低氧响应性可注射水凝胶及其制备方法。
取1.56ml聚乙二醇二丙烯酸酯(pegda，数均分子量700)加入到3.7mldmso中，搅拌至分散均匀。取0.067ml乙二胺加入到1mldmso中。将上述两种溶液混合在圆底烧瓶中，80℃油浴下反应6h。将0.8g2-(2-甲基-5-硝基-1h-咪唑-1-基)乙基丙烯酸酯(乙二胺上的活泼氢:2-(2-甲基-5-硝基-1h-咪唑-1-基)乙基丙烯酸酯的双键为1.25:0.5)溶解在2mldmso中，并加入到上述反应液中，继续反应4h，得到硝基咪唑基团封端的超支化聚氨基酯(hb-pbae-mnz)。冷却后使用五倍量以上的乙醚进行三次提纯。收集产物，放置于-20℃条件下储存。
将hb-pbae-mnz配制成20wt％的水溶液，将巯基化透明质酸配制成1wt％的水溶液，按照体积比1:1共混，涡旋搅拌使反应充分进行，然后在室温下静置3min，即得到水凝胶。
利用1hnmr对本发明实施例制得的硝基咪唑基团封端的超支化聚氨基酯(hb-pbae-mnz)的化学结构进行表征，由图1可见，化学位移约为8.0ppm存在的峰为咪唑上的氢对应的峰，证明了hb-pbae-mnz中多硝基咪唑基团的存在；另外，双键上的氢在化学位移约为6.2ppm、6.3ppm及6.0ppm处对应有三个峰，证明了仍有未反应的双键，由此证明hb-pbae-mnz成功合成。
由图2可见，将20wt％hb-pbae-mnz水溶液和1wt％巯基化透明质酸水溶液按照体积比1:1共混并静置3min后，将试管翻转后其中的混合溶液不再流动，由此证明hb-pbae-mnz与巯基化透明质酸的混合水溶液以形成水凝胶。
依据参考文献(hypoxia-responsiveblockcopolymerradiosensitizersasanticancerdrugnanocarriersforenhancedchemoradiotherapyofbulkysolidtumors,biomaterials,181(2018):360-371)，对本发明实施例制备得到的硝基咪唑基团封端的超支化聚氨基酯(hb-pbae-mnz)的低氧响应性进行了测试。在图3中，曲线(1)和(2)分别为质量分数0.2％的hb-pbae-mnz的水溶液被等体积的0.1mg/ml的亚硫酸氢钠水溶液在常氧和低氧条件下还原4h之后的紫外曲线。由图3可见，在常氧条件下，310nm处代表硝基咪唑基团的吸收峰仍然很高；而低氧条件下，硝基咪唑的峰明显降低，由此说明低氧条件下硝基咪唑被还原剂还原，即本发明实施例制得的硝基咪唑基团封端的超支化聚氨基酯(hb-pbae-mnz)具有低氧响应性。利用相同的方法对后续得到的水凝胶进行了低氧响应性测试，得到相似的结果，即本发明实施例制得水凝胶具有低氧响应性。
由图4可见，本发明实施例制得的水凝胶具有可注射性。
根据本发明内容进行工艺参数的调整，均可实现天然高分子基可注射水凝胶的制备，且表现出与本发明实施例基本一致的性能。
以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。
1.一种低氧响应性可注射水凝胶，其特征在于：由以下步骤制备得到：
(1)将聚乙二醇二丙烯酸酯的二甲基亚砜溶液和乙二胺的二甲基亚砜溶液混合均匀，聚乙二醇二丙烯酸酯的双键与乙二胺的活泼氢的摩尔比为1:(1.1-1.4)，在油浴中进行反应以使聚乙二醇二丙烯酸酯上的双键与乙二胺上的氨基发生迈克尔加成反应得到超支化聚氨基酯；
(2)将2-(2-甲基-5-硝基-1h-咪唑-1-基)乙基丙烯酸酯的二甲基亚砜溶液加入到步骤(1)的反应液中，2-(2-甲基-5-硝基-1h-咪唑-1-基)乙基丙烯酸酯的双键与步骤(1)中乙二胺的活泼氢的摩尔比为(0.2-0.8)：(1.1-1.4)，继续在油浴中反应以使2-(2-甲基-5-硝基-1h-咪唑-1-基)乙基丙烯酸酯上的双键与步骤(1)反应溶液中未反应的氨基进行反应得到硝基咪唑基团封端的超支化聚氨基酯；
(3)将步骤(2)制得的硝基咪唑基团封端的超支化聚氨基酯的水溶液与巯基化透明质酸的水溶液混合均匀，硝基咪唑基团封端的超支化聚氨基酯与巯基化透明质酸的质量比为(10-20)：1，充分反应以使硝基咪唑基团封端的超支化聚氨基酯,上未反应的双键与巯基化透明质酸上的巯基发生迈克尔加成反应，生成三维网状立体聚合物。
2.根据权利要求1所述的低氧响应性可注射水凝胶，其特征在于：步骤(1)中聚乙二醇二丙烯酸酯与乙二胺在70-90℃油浴中反应5-7h。
3.根据权利要求1所述的低氧响应性可注射水凝胶，其特征在于：步骤(2)中，2-(2-甲基-5-硝基-1h-咪唑-1-基)乙基丙烯酸酯与超支化聚氨基酯在70-90℃油浴中继续反应3-5h；2-(2-甲基-5-硝基-1h-咪唑-1-基)乙基丙烯酸酯的双键与步骤(1)中乙二胺的活泼氢的摩尔比为(0.2-0.5)：(1.1-1.4)。
4.根据权利要求1所述的低氧响应性可注射水凝胶，其特征在于：步骤(2)中反应结束后用5倍量以上的乙醚对反应液进行提纯。
5.根据权利要求1所述的低氧响应性可注射水凝胶，其特征在于：步骤(3)中硝基咪唑基团封端的超支化聚氨基酯水溶液的质量百分浓度为20wt％，巯基化透明质酸水溶液的质量百分浓度为1wt％，二者按体积比1:1共混；通过涡旋搅拌使反应充分进行；成胶温度为室温，成胶时间为3-4min。
6.一种低氧响应性可注射水凝胶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)将聚乙二醇二丙烯酸酯6的二甲基亚砜6溶液和乙二胺6的二甲基亚砜溶液混合均匀，聚乙二醇二丙烯酸酯的双键与乙二胺的活泼氢的摩尔比为1:(1.1-1.4)，在油浴中进行反应以使聚乙二醇二丙烯酸酯上的双键与乙二胺上的氨基发生迈克尔加成反应得到超支化聚氨基酯；
(2)将2-(2-甲基-5-硝基-1h-咪唑-1-基)乙基丙烯酸酯的二甲基亚砜溶液加入到步骤(1)的反应液中，2-(2-甲基-5-硝基-1h-咪唑-1-基)乙基丙烯酸酯的双键与步骤(1)中乙二胺的活泼氢的摩尔比为(0.2-0.8)：(1.1-1.4)，继续在油浴中反应以使2-(2-甲基-5-硝基-1h-咪唑-1-基)乙基丙烯酸酯上的双键与步骤(1)反应溶液中未反应的氨基进行反应得到硝基咪唑基团封端的超支化聚氨基酯；
(3)将步骤(2)制得的硝基咪唑基团封端的超支化聚氨基酯的水溶液与巯基化透明质酸的水溶液混合均匀，硝基咪唑基团封端的超支化聚氨基酯与巯基化透明质酸的质量比为(10-20)：1，充分反应以使硝基咪唑基团封端的超支化聚氨基酯上未反应的双键与巯基化透明质酸上的巯基发生迈克尔加成反应，生成三维网状立体聚合物。
7.根据权利要求6所述的低氧响应性可注射水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤(1)中聚乙二醇二丙烯酸酯与乙二胺在70-90℃油浴中反应5-7h。
8.根据权利要求6所述的低氧响应性可注射水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，2-(2-甲基-5-硝基-1h-咪唑-1-基)乙基丙烯酸酯与超支化聚氨基酯在70-90℃油浴中继续反应3-5h；2-(2-甲基-5-硝基-1h-咪唑-1-基)乙基丙烯酸酯的双键与步骤(1)中乙二胺的活泼氢的摩尔比为(0.2-0.5)：(1.1-1.4)。
9.根据权利要求6所述的低氧响应性可注射水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤(2)中反应结束后用5倍量以上的乙醚对反应液进行提纯。
10.根据权利要求6所述的低氧响应性可注射水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤(3)中硝基咪唑基团封端的超支化聚氨基酯水溶液的质量百分浓度为20wt％，巯基化透明质酸水溶液的质量百分浓度为1wt％，二者按体积比1:1共混；通过涡旋搅拌使反应充分进行；成胶温度为室温，成胶时间为3-4min。
技术总结