本发明涉及高分子药物载体技术领域，特别涉及一种具有mmp-2响应的顺铂载体及其制备方法、顺铂配合物及其制备方法。
背景技术：
肿瘤已经成为威胁人类健康的最严重疾病之一。临床上常用的癌症治疗手段包括化学治疗、放射治疗和手术治疗等。其中，化学治疗是其中最常用和重要的治疗途径。但临床上所用的抗肿瘤药物在应用中有诸多的缺陷，如：水溶性及稳定性差，药物毒副作用大。为了解决这些问题，可将药物与药物载体结合，以改善药物的水溶性和稳定性，并达到对药物的控制释放，从而减小药物对正常组织的毒副作用，充分发挥药物的功效。
顺铂(顺式-二氯二胺合铂，cis-diamminedichloroplatinum，简称cddp)是目前应用广泛的一类抗肿瘤药物，其由b.rosenborg等人于1965年首次发现。顺铂具有抗癌谱广、作用强、与多种抗肿瘤药有协同作用、且无交叉耐药等特点，因此顺铂也是联合化疗中最常用的药物之一。但是，顺铂同样存在着毒副作用大，血液中半衰期短等问题，尤其是肾脏毒性，使顺铂的剂量限制，大大制约了其运用的有效性。
针对这一问题，日本东京大学的kataoka研究组和中科院长春应化所的陈学思研究组利用聚谷氨酸高分子作为载体对顺铂进行了络合担载，所制备的高分子-顺铂纳米胶束显著降低了顺铂的毒性，并能够实现在肿瘤部位的被动聚积(n.nishiyama,etal.cancerresearch,63(2003)9877-8983；中国专利201210382696.x)。
尽管各种顺铂的类似物被开发出来以降低毒副作用和提高治疗效果，但是其仍然存在小分子铂类药物所共有的血液半衰期短、非特异性作用明显等问题，并带来造血系统、消化系统及神经系统的毒性。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种具有mmp-2响应的顺铂载体及其制备方法、顺铂配合物及其制备方法。本发明提供的顺铂载体和顺铂配合物能够有效避免静脉注射后在血液循环系统中的突然释放和非特异性相互作用，从而降低毒性。
本发明提供了一种具有mmp-2响应的顺铂载体，具有式i所示结构：
其中：
40≤n≤120；
120≤x≤160，b＝0，5≤y≤15，1≤a≤y，
或
120≤x≤160，1≤b≤x，y＝a＝0。
优选的，
140≤x≤155，b＝0，8≤y≤12，1≤a≤y，
或
140≤x≤155，1≤b≤x，y＝a＝0。
本发明还提供了一种上述技术方案中所述的具有mmp-2响应的顺铂载体的制备方法，包括以下步骤：
a)将正己胺、n-苄氧羰基-l-赖氨酸-n-环内羧酸酐、γ苄基谷氨酸-n-环内羧酸酐混合反应，得到聚氨基酸纳米粒子；
b)将所述聚氨基酸纳米粒子溶解于卤代乙酸中，在溴化氢和乙酸存在的条件下进行酸解脱除苄氧羰基，得到式iv化合物；
c)在催化剂的作用下，将功能化纳米外壳化合物与式iv化合物混合反应，得到式i所示的具有mmp-2响应的顺铂载体；
所述功能化纳米外壳化合物为式ii化合物和/或式iii化合物；
其中：
40≤n≤120；
120≤x≤160，5≤y≤15，1≤a≤y，
或
120≤x≤160，y＝a＝0。
优选的，所述步骤a)中，所述反应的温度为15～50℃，时间为2～7天。
优选的，所述步骤c)中，所述反应的温度为10～30℃，时间为1～3h；
所述催化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和4-二甲氨基吡啶。
本发明还提供了一种顺铂配合物，由顺式-二氯二氨合铂与载体配合形成；
所述载体为上述技术方案中所述的具有mmp-2响应的顺铂载体或上述技术方案中所述的制备方法制得的具有mmp-2响应的顺铂载体。
本发明还提供了一种上述技术方案中所述的顺铂配合物的制备方法，包括：
将载体与顺式-二氯二氨合铂混合反应，形成顺铂配合物；
所述载体为为上述技术方案中所述的具有mmp-2响应的顺铂载体或上述技术方案中所述的制备方法制得的具有mmp-2响应的顺铂载体。
优选的，所述反应在ph为8～10的条件下进行；
所述反应的温度为30～45℃，时间为2～5天。
优选的，所述载体中的谷氨酸单元与顺式-二氯二氨合铂的摩尔比为(1～10)∶1。
优选的，所述反应在溶剂水中进行。
本发明提供的上述式i结构的载体，在聚氨基酸的侧链接枝特定的支链--巯基化聚乙二醇-马来酰亚胺基多肽，能够作为顺铂的外壳，具有一定的遮蔽能力和mmp-2响应性，通过增强渗透滞留(epr)效应在肿瘤组织部位富集，在人体其它正常环境下，能够阻止顺铂的毒性，而在肿瘤阻止部位过表达的活性氧条件刺激下，能够快速响应，自行脱除，将顺铂释放，在肿瘤部分发挥作用。因此，其能够有效避免静脉注射后在血液循环系统中的突然释放和非特异性相互作用，从而降低毒性。
实验结果表明，本发明中的顺式-二氯二氨合铂配合物具有缓释能力和在mmp-2响应下加快释放的特性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为实施例4制备的n(ε)-苄氧羰基-l-赖氨酸-n-环内酸酐的核磁谱图；
图2为实施例5制备的γ-苄基谷氨酸-n-环内酸酐的核磁谱图；
图3为实施例13制备的式iv所示聚(l-赖氨酸-共聚-γ-谷氨酸)的核磁谱图；
图4为实施例25制备的式i所示顺铂载体纳米粒子的核磁谱图；
图5为本发明制备的顺铂配合物在不同条件下的释放曲线图；
图6为实施例79中mtt抗肿瘤实验效果图。
具体实施方式
本发明提供了一种具有mmp-2响应的顺铂载体，其特征在于，具有式i所示结构：
其中：
40≤n≤120；
120≤x≤160，b＝0，5≤y≤15，1≤a≤y，
或
120≤x≤160，1≤b≤x，y＝a＝0。
本发明中，所述式i结构中，40≤n≤120；对应的聚乙二醇单元的数均分子量优选为2000～5000。
本发明中，根据y≠0或y＝0时，式i结构分为两种情况：
120≤x≤160，b＝0，5≤y≤15，1≤a≤y，即式i化合物为式i-1结构：
其中，优选的，140≤x≤155，8≤y≤12，1≤a≤y。
或者
120≤x≤160，1≤b≤x，y＝a＝0，即式i化合物为式i-2结构：
其中，优选的，140≤x≤155，1≤b≤x。
本发明提供的上述式i结构的载体，在聚氨基酸的侧链接枝特定的支链--巯基化聚乙二醇-马来酰亚胺基多肽，能够作为顺铂的外壳，具有一定的遮蔽能力和mmp-2响应性，通过增强渗透滞留(epr)效应在肿瘤组织部位富集，在人体其它正常环境下，能够阻止顺铂的毒性，而在肿瘤阻止部位过表达的活性氧条件刺激下，能够快速响应，自行脱除，将顺铂释放，在肿瘤部分发挥作用。因此，其能够有效避免静脉注射后在血液循环系统中的突然释放和非特异性相互作用，从而降低毒性。
本发明还提供一种上述技术方案中所述的具有mmp-2响应的顺铂载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)将正己胺、n-苄氧羰基-l-赖氨酸-n-环内羧酸酐、γ苄基谷氨酸-n-环内羧酸酐混合反应，得到聚氨基酸纳米粒子；
b)将所述聚氨基酸纳米粒子溶解于卤代乙酸中，在氢溴酸和乙酸存在的条件下进行酸解脱除苄氧羰基，得到式iv化合物；
c)在催化剂的作用下，将功能化纳米外壳化合物与式iv化合物混合反应，得到式i所示的具有mmp-2响应的顺铂载体；
所述功能化纳米外壳化合物为式ii化合物和/或式iii化合物；
其中：
40≤n≤120；
120≤x≤160，5≤y≤15，1≤a≤y，
或
120≤x≤160，y＝a＝0。
关于步骤a)：将正己胺、n-苄氧羰基-l-赖氨酸-n-环内羧酸酐、γ苄基谷氨酸-n-环内羧酸酐混合反应，得到聚氨基酸纳米粒子。
本发明中，所述正己胺结构如下式a所示，其来源没有特殊限制，为一般市售品即可。
本发明中，所述n-苄氧羰基-l-赖氨酸-n-环内羧酸酐(又名“n(ε)-苄氧羰基-l-赖氨酸-n-环内酸酐”或“n6-苄氧羰基-l-赖氨酸环内酸酐”)，结构如下式b所示，其来源没有特殊限制，为一般市售品或按照本领域技术人员熟知的常规制备方法制得即可。
所述n-苄氧羰基-l-赖氨酸-n-环内羧酸酐可通过以下制备方法制得：将n(ε)-苄氧羰基-l-赖氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯进行缩合反应，得到n(ε)-苄氧羰基-l-赖氨酸-n-环内酸酐。
其中，具体过程优选为：将n(ε)-苄氧羰基-l-赖氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯在有机溶剂中混合，再进行加热，在无水条件下进行缩合反应。本发明中，所述n(ε)-苄氧羰基-l-赖氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯的摩尔比优选为1∶(0.1～1.2)，更优选为1∶(0.3～1)，最优选为1∶(0.5～0.8)。所述有机溶剂优选为四氢呋喃。所述有机溶剂的体积和n(ε)-苄氧羰基-l-赖氨酸的质量比优选为(8～12)ml∶1g，更优选为10ml∶1g。本发明中，所述混合的温度优选为10～40℃，更优选为15～35℃，最优选为20～30℃。所述缩合反应温度优选为30～80℃，更优选为35～70℃，最优选为40～60℃，所述缩合反应时间优选为0.1～5h，更优选为0.15～3h，最优选为0.2～2h。
在上述缩合反应后，优选将所得反应产物用石油醚沉降，将得到的沉降物分离，然后将得到的分离产物洗涤、重结晶和干燥，得到n(ε)-苄氧羰基-l-赖氨酸-n-环内酸酐。本发明对洗涤、重结晶、干燥的方法没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的洗涤、重结晶、干燥手段即可。
本发明中，所述γ苄基谷氨酸-n-环内羧酸酐(又名“谷氨酸5-苄酯n-羧基环内酸酐”)结构如下式c所示，其来源没有特殊限制，为一般市售品或按照本领域技术人员熟知的制备方法制得即可。
所述γ苄基谷氨酸-n-环内羧酸酐可通过以下制备方法制得：将γ-苄基谷氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯进行缩合反应，得到γ-苄基谷氨酸-n-环内酸酐。
其中，具体过程优选为：先将所述γ-苄基谷氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯在有机溶剂中混合，然后再升温，在无水条件下进行缩合反应。本发明中，所述γ-苄基谷氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯的摩尔比优选为1∶(0.1～1.2)，更优选为1∶(0.3～1)，最优选为1∶(0.5～0.8)。所述有机溶剂优选为四氢呋喃。所述有机溶剂的体积和γ-苄基谷氨酸的质量比优选为(8～12)ml∶1g，更优选为10ml∶1g。本发明中，所述混合的温度优选为10～40℃，更优选为15～35℃，最优选为20～30℃。所述缩合反应温度优选为30～80℃，更优选为35～70℃，最优选为40～60℃，所述缩合反应时间优选为0.1～5h，更优选为0.15～3h，最优选为0.2～2h。
在上述缩合反应后，优选将所得反应产物用石油醚沉降，将得到的沉降物分离，然后将得到的分离产物洗涤、重结晶和干燥，得到γ苄基谷氨酸-n-环内羧酸酐。本发明对洗涤、重结晶、干燥的方法没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的洗涤、重结晶、干燥手段即可。
按照本发明，在获取三种原料--正己胺、n-苄氧羰基-l-赖氨酸-n-环内羧酸酐、γ苄基谷氨酸-n-环内羧酸酐后，优选先将上述三种原料溶于有机溶剂中，然后在保护性气体条件下进行反应，得到聚氨基酸纳米粒子。
本发明中，所述正己胺、n-苄氧羰基-l-赖氨酸-n-环内羧酸酐和γ苄基谷氨酸-n-环内羧酸酐的用量比分为两种情况：(1)终产物对应上述式i-1：所述摩尔比优选为1∶(5～15)∶(120～160)，更优选为1∶(8～12)∶(140～155)，进一步优选为1∶(9～11)∶(150～155)，最优选为1∶10∶150。(2)终产物对应上述式i-2：所述摩尔比优选为1∶0∶(120～160)，更优选为1∶0∶(140～155)，进一步优选为1∶0∶(150～155)，最优选为1∶0∶150。
本发明中，所述有机溶剂优选为n,n-二甲基甲酰胺(dmf)。所述有机溶剂与正己胺的用量比优选为(1～2)ml∶1.0mg。
本发明中，所述保护性气体的种类没有特殊限制，为本领域技术人员熟知的常规惰性的气体即可，如氮气、氦气或氩气等。本发明对所述气体的气压没有特殊限制，常压即可。
本发明中，所述反应的温度优选为15～50℃，更优选为20～40℃，最优选为25～35℃。所述反应的时间优选为2～7天，更优选为3～5天，最优选为3天。
本发明中，在上述反应后，优选还包括：将所得反应液倒入无水乙醚中，抽滤取固体，然后将固体进行真空干燥，得到聚氨基酸纳米粒子。其中，所述真空干燥的温度优选为20～40℃，更优选为25～35℃；所述真空干燥的时间优选为12～24h，更优选为18～24h。经上述后处理后，得到聚氨基酸纳米粒子。
关于步骤b)：将所述聚氨基酸纳米粒子溶解于卤代乙酸中，在溴化氢和乙酸存在的条件下进行酸解脱除苄氧羰基，得到式iv化合物。
本发明中，所述卤代乙酸优选为三氟乙酸和/或二氯乙酸，更优选为三氟乙酸。所述卤代乙酸的体积与聚氨基酸纳米粒子的质量比优选为(8～12)ml∶1g，更优选为10ml∶1g。
本发明中，所述溴化氢的乙酸溶液的来源没有特殊限制，为一般市售品即可。本发明中，所述溴化氢的乙酸溶液中，乙酸与溴化氢的体积比优选为1∶(0.5～5)，更优选为1∶2。
本发明中，所述酸解的温度优选为20～50℃，更优选为30～35℃；所述酸解的时间优选为0.5～4h，更优选为1～2h，最优选为1h。经上述酸解反应，所述聚氨基酸纳米粒子脱除苄氧羰基。
本发明中，在上述酸解反应脱除苄氧羰基后，优选还包括：将所得反应液置于乙醚中进行抽滤，将抽滤得到的固体产物用去离子水溶解，然后透析、冻干，得到式iv所示结构的聚(l-赖氨酸-共聚-γ-谷氨酸)。其中，所述透析优选采用截留分子量为3500的透析袋进行透析；所述透析的时间为4天，每4h换一次透析液。本发明对冻干的方法没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的冻干手段即可；所述冻干的温度优选为-20℃，冻干的时间优选为72h。
其中；
120≤x≤160，5≤y≤15，1≤a≤y，
或
120≤x≤160，y＝a＝0。
关于步骤c)：在催化剂的作用下，将功能化纳米外壳化合物与式iv化合物混合反应，得到式i所示的具有mmp-2响应的顺铂载体。
本发明中，所述功能化纳米外壳化合物为式ii化合物和/或式iii化合物：
其中，当制备y≠0的终产物(即前文所述式ⅰ-1)时，采用式ii化合物与式iv化合物反应。当制备y＝0的终产物(即前文所述式ⅰ-2)时，采用式iii化合物与式iv化合物反应。
按照本发明，所述式ii化合物优选通过以下方法制得：将巯基化聚乙二醇与马来酰亚胺基多肽(mi-plglag-cooh)反应，生成式ii化合物。
本发明中，所述巯基化聚乙二醇的结构如下式d所示，其中，聚合度n优选为40～120，对应的聚乙二醇数均分子量优选为2000～5000。本发明对所述巯基化聚乙二醇的来源没有特殊限制，为一般市售品即可。
本发明中，所述马来酰亚胺基多肽(mi-plglag-cooh)的结构如下式e所示：
其中，plglag为多肽段，具体为pro-leu-gly-leu-ala-gly。本发明对式e所示马来酰亚胺基多肽的来源没有特殊限制，为一般市售品或按照本领域技术人员熟知的常规方法(如固态合成法)制得即可。
本发明中，所述反应优选在有机溶剂介质中进行。所述有机溶剂优选为n,n-二甲基甲酰胺(即dmf)和二氯甲烷中的一种或几种。
本发明中，所述马来酰亚胺基多肽(mi-plglag-cooh)与巯基化聚乙二醇的摩尔比优选为(1.1～2.0)∶1，更优选为(1.3～1.6)∶1，最优选为1.5∶1。所述马来酰亚胺基多肽(mi-plglag-cooh)与有机溶剂的用量比优选为1g∶(5～10)ml。
本发明中，所述反应的温度优选为15～40℃；所述反应的时间优选为5～7h。所述反应过程中优选伴随搅拌。经上述反应后，形成含式ii化合物的溶液，优选还进行：冰乙醚沉降和干燥，从而得到式ii化合物。
按照本发明，所述式iii化合物优选通过以下方法制得：将巯基化聚乙二醇与马来酰亚胺基多肽(mi-plglag-nh2)反应，生成式iii化合物。
本发明中，所述马来酰亚胺基多肽(mi-plglag-nh2)的结构如下式f所示：
本发明对式f所示马来酰亚胺基多肽的来源没有特殊限制，为一般市售品或按照本领域技术人员熟知的常规方法(如固态合成法)制得即可。
除上述马来酰亚胺基多肽原料不同外，其它内容如巯基化聚乙二醇的种类、其与马来酰亚胺基多肽的用量、上述操作过程、反应条件等均匀制备式ii化合物时一致，在此不再赘述。
本发明在获得功能化纳米外壳化合物(即式ii化合物和/或式iii化合物)后，将其与式iv化合物反应。本发明中，所述反应优选在有机溶剂介质中进行。本发明中，所述有机溶剂优选为n,n-二甲基甲酰胺。
本发明中，所述功能化纳米外壳化合物(即式ii化合物和/或式iii化合物)与所述式iv化合物内核的摩尔比优选为(1～20)∶1，更优选为(5～15)∶1，最优选为10∶1。所述功能化纳米外壳化合物与式iv化合物的总质量与所述有机溶剂的体积比为1g∶(8～12)ml，更优选为1g∶10ml。
本发明中，所述反应在催化剂作用下进行。所述催化剂优选为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和4-二甲氨基吡啶。所述催化剂与式iv化合物的质量比优选为(0.3～0.5)∶1。所述催化剂中，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与4-二甲氨基吡啶的质量比优选为1∶(1～2)。本发明优选的，先将功能化纳米外壳化合物(即式ii化合物和/或式iii化合物)溶于溶剂中，并加入催化剂，混合均匀，经溶剂透析；再加入式iv化合物进行反应，形成i所示化合物。
本发明中，所述混合的温度优选为10～30℃，混合的时间优选为1～3h。所述反应的温度优选为10～30℃；所述反应的时间优选为1～3h。经上述反应后，优选还包括：将所得反应液进行水相透析和冻干。经上述后处理，得到i所示的具有mmp-2响应的顺铂载体：
本发明还提供了一种顺铂配合物，由顺式-二氯二氨合铂与载体配合形成；其中，所述载体为上述技术方案中所述的具有mmp-2响应的式i顺铂载体或上述技术方案中所述的制备方法制得的具有mmp-2响应的式i顺铂载体。
所述顺式-二氯二氨合铂(即顺铂)的结构如下式g所示：
上述式g所示顺铂与式i所示顺铂载体之间配合，具体的，式g所示顺铂与式i所示顺铂载体上的羧基反应，顺铂的cl脱除，式i化合物的coo-连接上去，由于顺铂上含有两个cl，因此，式i所示顺铂载体包载顺铂后形成交联结构，式i所示顺铂纳米粒子作为外壳，顺铂包载进上述纳米粒子内部。
本发明还提供了一种上述技术方案中所述的顺铂配合物的制备方法，包括：将载体与顺式-二氯二氨合铂混合反应，形成顺铂配合物；其中，所述载体为上述技术方案中所述的式i所示化合物。
本发明中，所述反应优选在水介质中进行，具体的，先将式i所示载体化合物溶于水中，再加入顺式-二氯二氨合铂进行反应。本发明中，所述式i载体中的谷氨酸单元(即聚合度x-b对应的单元)与顺式-二氯二氨合铂的质量比优选为(1～10)∶1，更优选为(4～8)∶1，最优选为6∶1。
本发明中，在加料后、反应前，优选还进行调节ph；本发明中，优选调节ph值为8～10，更优选为8.5～9.5，最优选为9。本发明对调节ph值所用的ph值调节剂种类没有特殊限制，为本领域技术人员熟知的常规碱性调节剂即可。在调节ph值后，进行反应。
本发明中，所述反应的温度优选为30～45℃；所述反应的时间优选为2～5天。本发明中，在上述反应后，优选还进行：对所得反应液进行透析和冻干。本发明对所述透析和冻干的方法没有特殊限制，为本领域技术人员熟知的常规方式即可。其中，所述冻干的温度优选为-20℃，冻干的时间优选为72h。经上述后处理后，得到具有mmp-2响应的顺铂配合物。
本发明提供的具有mmp-2响应的顺铂配合物，由顺式-二氯二氨合铂与具有式i所示结构的化合物配合形成；具体以式i所示化合物为载体，其在聚氨基酸侧链接枝聚乙二醇，具有良好的生物相容性、可降解性和溶解性，而且，上述载体在聚氨基酸的侧链接枝特定的支链--巯基化聚乙二醇-马来酰亚胺基多肽，能够作为顺铂的外壳，具有一定的遮蔽能力和mmp-2响应性，通过增强渗透滞留(epr)效应在肿瘤组织部位富集，在人体其它正常环境下，能够阻止顺铂的毒性，而在肿瘤阻止部位过表达的活性氧条件刺激下，能够快速响应，自行脱除，将顺铂释放，在肿瘤部分发挥作用。因此，其能够有效避免静脉注射后在血液循环系统中的突然释放和非特异性相互作用，从而降低毒副作用和提高治疗效果的目的。实验结果表明，本发明中的顺式-二氯二氨合铂配合物具有缓释能力和在mmp-2响应下加快释放的特性。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
实施例1～3：不同分子量的聚乙二醇-plglag(即式ii化合物)的制备
实施例1
将2.0g巯基聚乙二醇(分子量为5000)和0.3g马来酰亚胺基多肽(mi-plglag-cooh)溶解于30ml二氯甲烷中，25℃下搅拌反应36h后，用并乙醚沉降两次，干燥，得到式ii化合物。
实施例2
将1.6g巯基聚乙二醇(分子量为4000)和0.3g马来酰亚胺基多肽(mi-plglag-cooh)溶解于30ml二氯甲烷中，25℃下搅拌反应36h后，用并乙醚沉降两次，干燥，得到式ii化合物。
实施例3
将0.8g巯基聚乙二醇(分子量为2000)和0.3g马来酰亚胺基多肽(mi-plglag-cooh)溶解于30ml二氯甲烷中，25℃下搅拌反应36h后，用并乙醚沉降两次，干燥，得到式ii化合物。
实施例4：n(ε)-苄氧羰基-l-赖氨酸-n-环内酸酐的制备
将1gn-苄氧羰基-l-赖氨酸与0.6g双(三氯甲基)碳酸酯在25℃下混合，加入四氢呋喃，加热至50℃反应2h，反应结束后，将反应混合物在过量石油醚中沉降，再经分离、洗涤、重结晶、干燥后，得到n(ε)-苄氧羰基-l-赖氨酸-n-环内酸酐，核磁图谱参见图1，图1为实施例4制备的n(ε)-苄氧羰基-l-赖氨酸-n-环内酸酐的核磁谱图。
实施例5：γ-苄基谷氨酸-n-环内酸酐的制备
将1gγ-苄基谷氨酸与0.6g双(三氯甲基)碳酸酯在25℃下混合，加入四氢呋喃，加热至50℃反应2h，反应结束后，将反应混合物在过量石油醚中沉降，再经分离、洗涤、重结晶、干燥后，得到γ-苄基谷氨酸-n-环内酸酐，核磁图谱参见图2，图2为实施例5制备的γ-苄基谷氨酸-n-环内酸酐的核磁谱图。
实施例6～14：不同含量的聚氨基酸纳米粒子的制备
实施例6
将27.22g实施例5制备的γ-苄基谷氨酸-n-环内酸酐与2.64g实施例4制备的n(ε)-苄氧羰基-l-赖氨酸-n-环内酸酐混合均匀，加入到含有0.087g正己胺的n,n-二甲基甲酰胺溶液中，氮气气氛下于25℃搅拌反应3天，将反应后溶液倾倒入100ml无水乙醚中，抽滤取固体，真空干燥，得到聚氨基酸纳米粒子，平均每个正己胺聚合上120个γ-苄基谷氨酸和10个n(ε)-苄氧羰基-l-赖氨酸(即x＝120，y＝10)。
实施例7
将27.22g实施例5制备的γ-苄基谷氨酸-n-环内酸酐与1.32g实施例4制备的n(ε)-苄氧羰基-l-赖氨酸-n-环内酸酐混合均匀，加入到含有0.087g正己胺的n,n-二甲基甲酰胺溶液中，氮气气氛下于25℃搅拌反应3天，将反应后溶液倾倒入100ml无水乙醚中，抽滤取固体，真空干燥，得到聚氨基酸纳米粒子，平均每个正己胺聚合上120个γ-苄基谷氨酸和5个n(ε)-苄氧羰基-l-赖氨酸(即x＝120，y＝5)。
实施例8
将27.22g实施例5制备的γ-苄基谷氨酸-n-环内酸酐与3.96g实施例4制备的n(ε)-苄氧羰基-l-赖氨酸-n-环内酸酐混合均匀，加入到含有0.087g正己胺的n,n-二甲基甲酰胺溶液中，氮气气氛下于25℃搅拌反应3天，将反应后溶液倾倒入100ml无水乙醚中，抽滤取固体，真空干燥，得到聚氨基酸纳米粒子，平均每个正己胺聚合上120个γ-苄基谷氨酸和15个n(ε)-苄氧羰基-l-赖氨酸(即x＝120，y＝15)。
实施例9
将34.03g实施例5制备的γ-苄基谷氨酸-n-环内酸酐与2.64g实施例4制备的n(ε)-苄氧羰基-l-赖氨酸-n-环内酸酐混合均匀，加入到含有0.087g正己胺的n,n-二甲基甲酰胺溶液中，氮气气氛下于25℃搅拌反应3天，将反应后溶液倾倒入100ml无水乙醚中，抽滤取固体，真空干燥，得到聚氨基酸纳米粒子，平均每个正己胺聚合上150个γ-苄基谷氨酸和10个n(ε)-苄氧羰基-l-赖氨酸(即x＝150，y＝10)。
实施例10
将34.03g实施例5制备的γ-苄基谷氨酸-n-环内酸酐与1.32g实施例4制备的n(ε)-苄氧羰基-l-赖氨酸-n-环内酸酐混合均匀，加入到含有0.087g正己胺的n,n-二甲基甲酰胺溶液中，氮气气氛下于25℃搅拌反应3天，将反应后溶液倾倒入100ml无水乙醚中，抽滤取固体，真空干燥，得到聚氨基酸纳米粒子，平均每个正己胺聚合上150个γ-苄基谷氨酸和5个n(ε)-苄氧羰基-l-赖氨酸(即x＝150，y＝5)。
实施例11
将34.03g实施例5制备的γ-苄基谷氨酸-n-环内酸酐与3.96g实施例4制备的n(ε)-苄氧羰基-l-赖氨酸-n-环内酸酐混合均匀，加入到含有0.087g正己胺的n,n-二甲基甲酰胺溶液中，氮气气氛下于25℃搅拌反应3天，将反应后溶液倾倒入100ml无水乙醚中，抽滤取固体，真空干燥，得到聚氨基酸纳米粒子，平均每个正己胺聚合上150个γ-苄基谷氨酸和15个n(ε)-苄氧羰基-l-赖氨酸(即x＝150，y＝15)。
实施例12
将36.30g实施例5制备的γ-苄基谷氨酸-n-环内酸酐与2.64g实施例4制备的n(ε)-苄氧羰基-l-赖氨酸-n-环内酸酐混合均匀，加入到含有0.087g正己胺的n,n-二甲基甲酰胺溶液中，氮气气氛下于25℃搅拌反应3天，将反应后溶液倾倒入100ml无水乙醚中，抽滤取固体，真空干燥，得到聚氨基酸纳米粒子，平均每个正己胺聚合上160个γ-苄基谷氨酸和10个n(ε)-苄氧羰基-l-赖氨酸(即x＝160，y＝10)。
实施例13
将36.30g实施例5制备的γ-苄基谷氨酸-n-环内酸酐与1.32g实施例4制备的n(ε)-苄氧羰基-l-赖氨酸-n-环内酸酐混合均匀，加入到含有0.087g正己胺的n,n-二甲基甲酰胺溶液中，氮气气氛下于25℃搅拌反应3天，将反应后溶液倾倒入100ml无水乙醚中，抽滤取固体，真空干燥，得到聚氨基酸纳米粒子，平均每个正己胺聚合上160个γ-苄基谷氨酸和5个n(ε)-苄氧羰基-l-赖氨酸(即x＝160，y＝5)。
实施例14
将36.30g实施例5制备的γ-苄基谷氨酸-n-环内酸酐与3.96g实施例4制备的n(ε)-苄氧羰基-l-赖氨酸-n-环内酸酐混合均匀，加入到含有0.087g正己胺的n,n-二甲基甲酰胺溶液中，氮气气氛下于25℃搅拌反应3天，将反应后溶液倾倒入100ml无水乙醚中，抽滤取固体，真空干燥，得到聚氨基酸纳米粒子，平均每个正己胺聚合上160个γ-苄基谷氨酸和15个n(ε)-苄氧羰基-l-赖氨酸(即x＝160，y＝15)。
实施例15～23：将实施例6～14制备的聚氨基酸纳米粒子脱去n-苄氧羰基和苄基来制备式iv化合物
分别称取1g实施例6～14中制备的聚氨基酸纳米粒子[即聚(n(ε)-苄氧羰基-l-赖氨酸-共聚-γ-苄基谷氨酸)]溶解于10ml三氟乙酸中，加入3ml溴化氢的乙酸溶液(浓度为33wt％)，室温搅拌反应1h；将反应液倒入100ml乙醚中，抽滤，得到的固体用水溶解，用截留分子量为3500的透析袋在去离子水中透析3d，每4h换一次透析液，所得溶液冻干后得到式iv所示聚(l-赖氨酸-共聚-γ-谷氨酸)，核磁图谱参见图3，图3为实施例13制备的式iv所示聚(l-赖氨酸-共聚-γ-谷氨酸)的核磁谱图，通过核磁计算实施例13制备的聚(l-赖氨酸-共聚-γ-谷氨酸)的数均分子量为23000。
实施例24～50：制备具有mmp-2响应的式i所示顺铂载体
实施例24～32
称取一定量的实施例1制备的式ii化合物(与实施例15～23制备的式iv化合物中赖氨酸的摩尔量相等，即与y对应的结构单元的摩尔量相等)，式ii化合物溶解于5mldmf中，并加入0.4g催化剂(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和4-二甲氨基吡啶，二者质量比为1∶1.5)，于25℃搅拌反应2h后，经dmf相透析，再分别加入1g实施例15～23制备的式iv化合物，于25℃搅拌反应2h后，经水相透析和冻干，得到具有mmp-2响应的式i所示顺铂载体纳米粒子。
其中，实施例24所得产物的核磁图谱参见图4，图4为实施例25制备的式i所示顺铂载体纳米粒子的核磁谱图，其中，x＝150、y＝10、a＝7。
实施例33～41
称取一定量的实施例2制备的式ii化合物(与实施例15～23制备的式iv化合物中赖氨酸的摩尔量相等，即与y对应的结构单元的摩尔量相等)，式ii化合物溶解于5mldmf中，并加入0.4g催化剂(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和4-二甲氨基吡啶，二者质量比为1∶1.5)，于25℃搅拌反应2h后，经dmf相透析，再分别加入1g实施例15～23制备的式iv化合物，于25℃搅拌反应2h后，经水相透析和冻干，得到具有mmp-2响应的式i所示顺铂载体纳米粒子。
实施例42～50
称取一定量的实施例3制备的式ii化合物(与实施例15～23制备的式iv化合物中赖氨酸的摩尔量相等，即与y对应的结构单元的摩尔量相等)，式ii化合物溶解于5mldmf中，并加入0.4g催化剂(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和4-二甲氨基吡啶，二者质量比为1∶1.5)，于25℃搅拌反应2h后，经dmf相透析，再分别加入1g实施例15～23制备的式iv化合物，于25℃搅拌反应2h后，经水相透析和冻干，得到具有mmp-2响应的式i所示顺铂载体纳米粒子。
实施例51～77：制备具有mmp-2响应的顺铂配合物
分别称取100mg实施例24～50制备的式i所示顺铂载体纳米粒子，按照载体中谷氨酸单元与顺铂的质量比为4∶1加入顺铂，调节体系ph值为9，37℃恒温震荡反应3d后，透析、冻干，得到具有mmp-2响应的载有二氯二胺合铂的聚氨基酸材料(即顺铂配合物)。
实施例78：具有mmp-2响应的顺铂配合物在不同条件下的释放
在37℃条件下，称取5mg实施例51制备的顺铂配合物，溶解在5ml含mmp-2的hepes缓冲溶液(mmp-2的含量为0.2μg/ml)中预处理1h，然后转移至透析袋(透析袋的截留分子量为3500)，取两份样品，分别用ph＝7.4、ph＝5.5的缓冲液(38ml)进行透析，在6h、12h、24h、48h、72h和96h分别取样2ml，并加入等量的缓冲液，形成不同时间节点的待测样。并分别以不含mmp-2的体系作为对照样。
利用电感耦合等离子体质谱对上述待测样和对照样进行定量分析，得到顺铂累计释放百分比随着时间增加的变化关系，释放结果如图5所示，图5为本发明制备的顺铂配合物在不同条件下的释放曲线图，由图5可知，本发明制备的顺铂配合物具有缓释能力和mmp-2响应下加快释放的特性。对其它实施例制备的顺铂配合物进行上述实验，结果同样显示，本发明制得的顺铂配合物具有缓释能力和mmp-2响应下加快释放的特性。
实施例79：mtt实验验证抗肿瘤作用
以人源卵巢癌细胞系skov3为例，将细胞均匀的种植到96孔板中，每孔约7000细胞，加入实施例51制备的顺铂配合物，使终浓度形成梯度(0.313μg/ml、0.625μg/ml、1.25μg/ml、2.5μg/ml、5.0μg/ml、10.0μg/ml、20.0μg/ml)，孵育两天后测试细胞活性。结果见图6，图6为实施例79中mtt抗肿瘤实验效果图。由图6可知，随着本发明顺铂配合物浓度的增加，细胞活性呈现降低趋势，说明本发明的顺铂配合物具有良好的mmp-2响应性，并具有良好的抗肿瘤作用。对其它实施例制备的顺铂配合物进行上述实验，结果同样显示，本发明制得的顺铂配合物具有良好的mmp-2响应性和抗肿瘤作用。
由以上实验效果可知，本发明制得的式i所示顺铂载体具有良好的缓释能力和mmp-2响应下加快释放的特性，表现出良好的mmp-2响应性和抗肿瘤作用。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
1.一种具有mmp-2响应的顺铂载体，其特征在于，具有式i所示结构：
其中：
40≤n≤120；
120≤x≤160，b＝0，5≤y≤15，1≤a≤y，
或
120≤x≤160，1≤b≤x，y＝a＝0。
2.根据权利要求1所述的顺铂载体，其特征在于，
140≤x≤155，b＝0，8≤y≤12，1≤a≤y，
或
140≤x≤155，1≤b≤x，y＝a＝0。
3.一种权利要求1～2中任一项所述的具有mmp-2响应的顺铂载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)将正己胺、n-苄氧羰基-l-赖氨酸-n-环内羧酸酐、γ苄基谷氨酸-n-环内羧酸酐混合反应，得到聚氨基酸纳米粒子；
b)将所述聚氨基酸纳米粒子溶解于卤代乙酸中，在溴化氢和乙酸存在的条件下进行酸解脱除苄氧羰基，得到式iv化合物；
c)在催化剂的作用下，将功能化纳米外壳化合物与式iv化合物混合反应，得到式i所示的具有mmp-2响应的顺铂载体；
所述功能化纳米外壳化合物为式ii化合物和/或式iii化合物；
其中：
40≤n≤120；
120≤x≤160，5≤y≤15，1≤a≤y，
或
120≤x≤160，y＝a＝0。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤a)中，所述反应的温度为15～50℃，时间为2～7天。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤c)中，所述反应的温度为10～30℃，时间为1～3h；
所述催化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和4-二甲氨基吡啶。
6.一种顺铂配合物，其特征在于，由顺式-二氯二氨合铂与载体配合形成；
所述载体为权利要求1～2中任一项所述的具有mmp-2响应的顺铂载体或权利要求3～5中任一项所述的制备方法制得的具有mmp-2响应的顺铂载体。
7.一种权利要求6所述的顺铂配合物的制备方法，其特征在于，包括：
将载体与顺式-二氯二氨合铂混合反应，形成顺铂配合物；
所述载体为权利要求1～2中任一项所述的具有mmp-2响应的顺铂载体或权利要求3～5中任一项所述的制备方法制得的具有mmp-2响应的顺铂载体。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述反应在ph为8～10的条件下进行；
所述反应的温度为30～45℃，时间为2～5天。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述载体中的谷氨酸单元与顺式-二氯二氨合铂的摩尔比为(1～10)∶1。
10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述反应在溶剂水中进行。
技术总结