本发明涉及生物医学工程技术领域，具体涉及一种各向异性刚度梯度的水凝胶的制备方法及应用。
背景技术：
细菌在宿主体内定植和感染受到多重因素调控，其生物学特性的研究领域已经得到广泛开发，然而机械物理特性的研究仍需进一步探索。宿主细胞外基质(extracellularmatrix，ecm)是保障宿主组织完整性和机械稳态的重要因素，其基质刚度(matrixstiffness)是ecm的主要力学机械特性。用于模拟不同的ecm基质刚度的聚丙烯酰胺水凝胶技术已经大力发展，该技术通过杨氏模量法测定和制备了各水凝胶表面形成的基质刚度。聚丙烯酰胺水凝胶形成的刚度基质多用于肿瘤组织病程的研究，以及癌细胞浸润的物理特性研究，通过水凝胶表面的形变，微粒子的位移，计算在水凝胶表面生长的癌细胞的牵引力的大小，从而评价癌细胞的软性特性和浸润能力。此外，对于不同刚度表面细菌粘附和生长的水凝胶的制备也应用于细菌生长和感染特性的研究。然而，各组织表面刚度的均一性并不一致，例如肠道组织各部分刚度截然不同，肠道隐窝处比其他肠道细胞部分要硬。在病理条件下，炎症组织表面比非炎症组织表面更硬。所以均一的ecm刚度的水凝胶的制备对于研究细菌感染是局限的。因为细菌侵染的各宿主组织不是处于简单的单一刚度的物理特性下的。因此各向异性刚度梯度的水凝胶的制备更接近于宿主体内的感染环境，该发明的研究也更为迫切。
技术实现要素：
(一)要解决的技术问题
针对上述问题，本发明提供了一种各向异性刚度梯度(连续刚度值的梯度变化)的水凝胶的制备方法及应用，用于至少部分解决传统方法采用均一的ecm刚度水凝胶对细菌感染进行研究存在局限性等技术问题。
(二)技术方案
本发明一方面提供了一种各向异性刚度梯度的水凝胶的制备方法，包括：s1，制备透镜凹槽状的聚二甲基硅氧烷模具；s2，在聚二甲基硅氧烷模具的透镜凹槽内和活化的第一盖玻片之间加入第一制备原料，聚合并去除模具，得到透镜凹槽状的第一层水凝胶；s3，在第一层水凝胶和疏水的第二盖玻片之间加入第二制备原料，聚合得到第二层水凝胶；s4，去除第二盖玻片，得到各向异性刚度梯度的水凝胶。
进一步地，s2中第一制备原料包括4％～5％的丙烯酰胺，0.3％～0.5％的双丙烯酰胺以及反应催化剂和加速剂。
进一步地，s3中第二制备原料包括4％～10％的丙烯酰胺，0.3％～0.5％的双丙烯酰胺以及反应催化剂和加速剂。
进一步地，s1具体包括：制备聚酯-树脂透镜基板，将聚二甲基硅氧烷单体和引发剂的预聚物转移至盖玻片和基板之间，聚合后去除基板，得到透镜凹槽状的聚二甲基硅氧烷模具。
进一步地，s2中第一盖玻片为甲基丙烯酸酯-盖玻片，以结合第一层水凝胶。
进一步地，s3中第二盖玻片为二氯二甲基硅烷处理的疏水盖玻片，以使第二层水凝胶易剥离。
进一步地，各向异性刚度梯度的水凝胶的界面刚度的范围为0～150kpa。
进一步地，各向异性刚度梯度的水凝胶的界面梯度强度的范围为40～200pa/μm。
本发明另一方面提供了一种根据前述各向异性刚度梯度的水凝胶的制备方法得到的各向异性刚度梯度的水凝胶在驱动细菌自组装式排列方法的应用。
本发明还有一方面提供了一种根据前述各向异性刚度梯度的水凝胶的制备方法得到的各向异性刚度梯度的水凝胶在基质刚度诱导细菌混合感染的自组装排列方法的应用。
(三)有益效果
本发明实施例提供的一种各向异性刚度梯度的水凝胶的制备方法及应用，基于具有表面拓扑结构的微结构水凝胶的多层聚合方法，可以可控性的调控基质刚度的梯度跨度，更有益于研究基质刚度调控细菌自组装式排列的机制。
附图说明
图1示意性示出了根据本发明实施例各向异性刚度梯度的水凝胶制备方法的流程图；
图2示意性示出了根据本发明实施例各向异性刚度梯度水凝胶的制备方法示意图；
图3示意性示出了根据本发明实施例用于研究细菌自组装排列的梯度刚度聚丙烯酰胺水凝胶示意图；
图4示意性示出了根据本发明实施例排除营养成分分布的位置导致细菌分布的结果示意图；
图5示意性示出了根据本发明实施例金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分别在刚度梯度水凝胶自组装时生长的形态和菌落高度。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。
本发明的第一实施例提供了一种各向异性刚度梯度的水凝胶的制备方法，请参见图1、图2，包括：s1，制备透镜凹槽状的聚二甲基硅氧烷模具；s2，在聚二甲基硅氧烷模具的透镜凹槽内和活化的第一盖玻片之间加入第一制备原料，聚合并去除模具，得到透镜凹槽状的第一层水凝胶；s3，在第一层水凝胶和疏水的第二盖玻片之间加入第二制备原料，聚合得到第二层水凝胶；s4，去除第二盖玻片，得到各向异性刚度梯度的水凝胶。
为了获得负刻聚二甲基硅氧烷模具，需要将聚二甲基硅氧烷(pdms)键合到等离子体(plasma)处理的盖玻片上。其方法为将含有聚二甲基硅氧烷单体和引发剂比例为10∶1(w/w)的预聚物pdms滴在等离子处理的盖玻片和模板之间，然后覆以约200g的重物，65℃烘箱过夜。聚合后将模板轻轻剥去，即可获得相应的透镜状模具。然后用该模具制作第一层聚丙烯酰胺凝胶，水凝胶的配置时，按照表1的配比用细菌lb肉汤培养基(包括胰蛋白胨，tryptone，10g/l；酵母提取物，yeastextract，5g/l；氯化钠，nacl，10g/l)中进行稀释配制不同比例的丙烯酰胺(acryl，％)和双丙烯酰胺(bis-acryl，％)的凝胶制备以及相应的杨氏模量和梯度强度值，按照表1中的配比，配制上下两层水凝胶。待第一层胶凝固后，制作第二层凝胶。待第二层凝胶凝固后，各向异性聚丙烯酰胺水凝胶即制作完毕。
表1
图3为用于研究细菌自组装排列的梯度刚度聚丙烯酰胺水凝胶示意图。图3a为不同刚度梯度的聚丙烯酰胺水凝胶上层胶和下层胶制备示意图和其不同位置的软硬刚度示意，如图3a右上角给出了梯度刚度基底不同水凝胶位置上的杨氏弹性模量(young′smodulusofelasticity，e，kpa)梯度变化，由于两层胶软硬度的差别和厚度的区别，导致了在水凝胶界面处刚度发生变化，通过纳米压痕仪检测可以检测水凝胶界面随位置变化的刚度范围。图3a体现了水凝胶界面刚度梯度的波动范围。第一层胶越突出的地方，也就是第二层胶相对厚度较小的地方的刚度越大，反之第一层胶凹下去的地方，也就是第二层胶相对厚度较大的地方刚度越小。与此同时图3a也展示了细菌在刚度梯度水凝胶界面如何作用的示意图。图3b则显示了该水凝胶可以调控细菌自主装粘附在特定位置。
本发明的优势在于，首次发现了基底刚度可以驱使细菌自组装式排列。此外本发明用于验证水凝胶区别于其他模拟单一基质刚度的水凝胶，可以实现刚度梯度的水凝胶的制备，不仅可以正向加强基质刚度梯度的跨度范围，例如通过减小第二层胶的厚度，可以正向加强刚度梯度范围。也可以消除刚度梯度的差异，达到可控性地调控基质刚度的梯度。
本发明采用水凝胶多层聚合的方法，逐步聚合，得到了类组织界面刚度梯度的水凝胶界面。在此界面上能够进一步研究细菌粘附和感染的机械规律，多种细菌竞争生长及两种以上细菌混合感染的机制，也可扩展为研究益生菌对致病菌调控作用研究，更可以研究抗菌药物的抗菌作用方式，该水凝胶的制备能够更加有针对性的研究病原菌致病的机械机制。
在上述实施例的基础上，s2中第一制备原料包括4％～5％的丙烯酰胺，0.3％～0.5％的双丙烯酰胺以及反应催化剂和加速剂。
在上述实施例的基础上，s3中第二制备原料包括4％～10％的丙烯酰胺，0.3％～0.5％的双丙烯酰胺以及反应催化剂和加速剂。
按照表1，采用分步聚合的方法，从晶状体模板中获得聚丙烯酰胺水凝胶。将4％、4.6％、4.5％或5％(w/v)丙烯酰胺单体与0.3％(w/v)n、n′-亚甲基双丙烯酰胺交联剂在lb培养基中制备。1ml混合物在真空下脱气后10分钟，添加10μl的10％(w/v)过硫酸铵(aps)和10μl的10％(v/v)四甲基乙二胺(n，n，n′，n′-tetramethylethylenediamine，temed)混匀。然后20μl凝胶混合物快速用移液器移至pdms模具上，并用甲醇活化的玻片迅速从液滴的一侧盖上，防止气泡的生成，混合物聚合30分钟。然后用剃刀轻轻将水凝胶层从模具中去除。同时，聚合物包含10％、8％、4.5％或4％(w/v)(w/v)丙烯酰胺单体0.3％(w/v)n，n′-methylene-bis-acrylamide准备在lb培养基中制备。等体积的过硫酸铵(aps)和四甲基乙二胺(temed)进行凝胶，快速将液体吸取到pa底部层并在18-mm盖玻片预孵育，聚合30分钟，用剃刀轻轻从经过二氯二甲基硅烷(dcdms)处理的银唇上分离出来。凝胶混合后，冲洗和浸泡在lb培养基中(ph7.4)中，供进一步使用。
从图2b的示意图中可见，通过调控第二层水凝胶的厚度，以及第一层水凝胶的硬度，都可以控制界面的刚度梯度的范围。例如第一层水凝胶硬度提高，则增大整体水凝胶界面的刚度梯度，反之减小。通过聚丙烯酰胺预聚物的体积增加第二层水凝胶的厚度可以减小整体水凝胶界面的刚度梯度，反之增大。
在上述实施例的基础上，s1具体包括：制备聚酯-树脂透镜基板，将聚二甲基硅氧烷单体和引发剂的预聚物转移至盖玻片和基板之间，聚合后去除基板，得到透镜凹槽状的聚二甲基硅氧烷模具。
用软光刻技术从透镜模板创建一个负刻聚二甲基硅氧烷模具，透镜模板由聚酯-树脂透镜基板(lenstarplus-thin，pacur)制成一层薄薄的35μm厚度在su-8光刻胶上形成的图案。用旋转涂布机将硅晶片沉积到底部。软烤的衬底后，光致抗蚀剂膜使光掩模图案条纹宽度为85μm，并有选择地在365nm紫外线透明区域曝光。在su-8光刻胶上未聚合的部分在显影剂中洗涤。该种聚酯-树脂透镜基底其表面粗糙度低并且刚度高，透镜状结构排列整齐并且间距精读高。
为进一步获得负刻聚二甲基硅氧烷模具，需要将聚二甲基硅氧烷键合到等离子体处理的盖玻片上。其方法为将含有聚二甲基硅氧烷单体和引发剂比例为10∶1(w/w)的预聚物pdms滴在等离子处理的盖玻片和模板之间，然后覆以约200g的重物，65℃的烘箱过夜，聚合后将模板轻轻剥去，即可获得相应的透镜状凹槽模板。
在上述实施例的基础上，s2中第一盖玻片为甲基丙烯酸酯-盖玻片，以结合第一层水凝胶。
为了结合聚丙烯酰胺凝胶，制备了甲基丙烯酸酯-盖玻片。首先，将清洗过的盖玻片在100w下等离子体处理3分钟，然后用1％(v/v)乙酸和2％(v/v)3-(三甲氧基甲硅基)甲基丙烯酸丙酯的乙醇溶液孵育5分钟，用98％乙醇溶液冲洗后，将盖玻片在120℃下烘干1小时。
在上述实施例的基础上，s3中第二盖玻片为二氯二甲基硅烷处理的疏水盖玻片，以使第二层水凝胶易剥离。
为了方便玻片从聚丙烯酰胺凝胶上剥离下来，制备了二氯二甲基硅烷处理的疏水盖玻片，将清洗后的玻璃盖玻片置于5％(v/v)二氯二甲基硅烷的甲苯溶液中浸泡1分钟，然后依次用乙醇和水清洗。
在上述实施例的基础上，各向异性刚度梯度的水凝胶的界面刚度的范围为0～150kpa。
细菌感染是一项涉及细胞与细菌相互作用的复杂力学生物学过程。细胞外基质不仅具有生物学调控特性更兼具力学调控能力。细菌细胞互作过程中，基质刚度对宿主细胞屏障功能的调节是调控细菌感染的关键。然而，以往的对于细胞细菌互作的体外研究中缺失了基质刚度因素这一重要物理条件。本发明结合宿主细胞在体内各组织脏器的刚度大小，例如脑组织中的细胞弹性模量为0.3～1kpa，皮肤组织为3～7kpa，心肝脾肺肾脏器组织均小于20kpa，肠组织为10～20kpa，牙龈组织为100kpa左右，设定了聚丙烯酰胺凝胶基质刚度的范围为0～150kpa，以更贴近于细菌感染宿主细胞时所处的力学微环境。
在上述实施例的基础上，各向异性刚度梯度的水凝胶的界面梯度强度的范围为40～200pa/μm。
界面梯度强度的变化可以很好的模拟复杂的机体细胞所处的刚度环境，比如肠道中，小肠弯曲的隐窝处的刚度就比小肠粘膜部分的要高很多，宿主体内各脏器界面的刚度都是非均匀的。因此利用本发明的刚度梯度水凝胶界面可以有效的模拟宿主体内复杂的刚度梯度的机械环境，这样更有助于研究致病菌的感染机制，也可以作为筛选抗致病菌药物的体外类组织界面的筛药平台。
本发明的第二实施例提供了使用各向异性刚度梯度的水凝胶在驱动细菌自组装式排列方法的应用。
请参见图3a，利用前述方法制备得到的刚度梯度聚丙烯酰胺水凝胶，在该水凝胶界面上孵育一定菌落单元(cfus/ml)的细菌悬液，经过一段时间培养后，观测该种细菌的生长模式。如图3b所示，经过一段时间的培养后，发现大肠杆菌(e.coli，带gfp绿色荧光)在两侧刚度梯度最大的位置处呈现规律性的自组装式生长。为确定刚度梯度是唯一因素，如图4，排除了因为营养成分分布不同位置而导致细菌分布不同，分别设定了只有下层胶加细菌培养基lb组，上下层都加入collagen组(胶原蛋白，为细胞外基质的一类重要蛋白)，上层加collagen下层加lb组，我们发现无论哪组，大肠杆菌依然是在原来的基底刚度的位置上自组装式排列生长，这些结果表明细菌自组装排列只与基质刚度相关，总之基质刚度成功的驱动了细菌的自组装式生长排列。
病原菌以群集的方式感染，聚集式定植生长来调控细菌的感染力度。然而细菌生长及其感染模式均受到机械力的高度调控，而细菌侵染的组织表面，其生理病理条件是有高度基质刚度差别的，本发明基于具有表面拓扑结构的微结构水凝胶的多层聚合方法得到的各向异性刚度梯度的水凝胶，用以驱动细菌自组装式排列。该水凝胶的制备有助于刚度驱动的细菌自组装式排列的形成有助于研究细菌在不同组织刚度条件下粘附和感染的机械规律。
本发明的第三实施例提供了使用各向异性刚度梯度的水凝胶在基质刚度诱导细菌混合感染的自组装排列方法的应用。
此类发明还可以用作除大肠杆菌以外的其他细菌，我们展示了另外一种细菌在刚度梯度水凝胶上自组装式生长。图5为金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分别在刚度梯度水凝胶自组装时生长的形态和菌落高度，颜色越红(即图5中虚线圈起来的部分)代表高度越高。除了大肠杆菌，我们也成功的在金黄色葡萄球菌中证明了基质刚度驱动其在特定的位置自组装式生长。此外，该发明还可以扩展用于多种细菌的混合培养。一方面是基质刚度对于多种菌混合感染的研究，例如金黄色葡萄球菌和大肠杆菌两种致病菌混合感染，可以通过本发明检测两种菌的生长定植位置变化，也就是基质刚度诱导的细菌混合感染的自组装排列模式，另一方面还可以用于益生菌抗菌效用的研究。如可以在水凝胶表面预孵育益生菌，通过占位，将有利的的刚度位置占领，进一步检测益生菌如何抵抗病原菌侵染或者病原菌如何突破益生菌的防护作用。
本研究公开发明的技术方法不仅可以研究单一致病菌感染的机械规律，还可以研究多种细菌竞争生长及细菌混合感染的机制，也可扩展为研究益生菌对致病菌调控作用，更可以用于抗菌药物的抗菌作用方式，该发明亦能作为研究病原菌致病机械机制的有效试验载体。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
1.一种各向异性刚度梯度的水凝胶的制备方法，包括：
s1，制备透镜凹槽状的聚二甲基硅氧烷模具；
s2，在所述聚二甲基硅氧烷模具的透镜凹槽内和活化的第一盖玻片之间加入第一制备原料，聚合并去除所述模具，得到透镜凹槽状的第一层水凝胶；
s3，在所述第一层水凝胶和疏水的第二盖玻片之间加入第二制备原料，聚合得到第二层水凝胶；
s4，去除所述第二盖玻片，得到各向异性刚度梯度的水凝胶。
2.根据权利要求1所述的各向异性刚度梯度的水凝胶的制备方法，其特征在于，所述s2中第一制备原料包括4％～5％的丙烯酰胺，0.3％～0.5％的双丙烯酰胺以及反应催化剂和加速剂。
3.根据权利要求2所述的各向异性刚度梯度的水凝胶的制备方法，其特征在于，所述s3中第二制备原料包括4％～10％的丙烯酰胺，0.3％～0.5％的双丙烯酰胺以及反应催化剂和加速剂。
4.根据权利要求1所述的各向异性刚度梯度的水凝胶的制备方法，其特征在于，所述s1具体包括：制备聚酯-树脂透镜基板，将聚二甲基硅氧烷单体和引发剂的预聚物转移至盖玻片和所述基板之间，聚合后去除所述基板，得到所述透镜凹槽状的聚二甲基硅氧烷模具。
5.根据权利要求1所述的各向异性刚度梯度的水凝胶的制备方法，其特征在于，所述s2中第一盖玻片为甲基丙烯酸酯-盖玻片，以结合所述第一层水凝胶。
6.根据权利要求1所述的各向异性刚度梯度的水凝胶的制备方法，其特征在于，所述s3中第二盖玻片为二氯二甲基硅烷处理的疏水盖玻片，以使所述第二层水凝胶易剥离。
7.根据权利要求1所述的各向异性刚度梯度的水凝胶的制备方法，其特征在于，所述各向异性刚度梯度的水凝胶的界面刚度的范围为0～150kpa。
8.根据权利要求7所述的各向异性刚度梯度的水凝胶的制备方法，其特征在于，所述各向异性刚度梯度的水凝胶的界面梯度强度的范围为40～200pa/μm。
9.一种根据权利要求1～8任一所述的各向异性刚度梯度的水凝胶的制备方法得到的各向异性刚度梯度的水凝胶在驱动细菌自组装式排列方法的应用。
10.一种根据权利要求1～8任一所述的各向异性刚度梯度的水凝胶的制备方法得到的各向异性刚度梯度的水凝胶在基质刚度诱导细菌混合感染的自组装排列方法的应用。
技术总结