本发明属于医用生物材料技术领域，具体设计一种抗菌水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术：
细菌具有极强的适应性，在自然环境中无处不在，伤口细菌感染在日常生活中十分常见。例如，机械损伤、不适宜的温度和化学药品造成的皮肤损伤。如果不能及时清除潜在的传染性微生物和坏死组织，很容易被细菌感染。选择合适的伤口敷料对感染的治疗是十分重要的，其中止血效果的良好与否、透气性的优劣、保湿、舒适性和柔顺性的优异与否等等因素是考量伤口敷料的重要因素。
目前，抗菌策略有以下几种，包括光动力抗菌疗法、亲水防污涂层、金属纳米材料等。光动力抗菌疗法，是利用光和光敏剂产生的光动力效应进行疾病诊断和治疗的一种技术。其缺点在于使用不同光敏剂产生的光动力效应对不同种类的细菌感染疗效不同，其抗菌效果还与光敏剂的作用机理、细菌的类型、细菌生长状态等多种因素相关。亲水防污涂层在自清洁、防雾、防污、油水分离等领域中获得了广泛应用，但是制备亲水防污涂层的过程大多涉及到昂贵的仪器设备或复杂的工艺流程。另外现有技术所制备出的超亲水表面易受外界因素如力、光、温度等的破坏，不能满足长期使用的要求。金属纳米材料在开发早期得到了较为广泛的应用，但由于有机抗菌剂的耐热性较差，因此其适用范围受到了限制。
上述几种策略均存在一定的局限性，如操作复杂、有害离子释放等。由于水凝胶具有三维聚合物网络结构，类似于细胞外基质(ecm)，具有良好生物相容性和降解性，适用于伤口抗菌敷料材料中。
技术实现要素：
针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种可原位凝胶化、抗菌性能良好、生物相容性良好的抗菌创面敷料及其制备方法。同时，本发明公开的抗菌水凝胶制备方法简单易行。
本发明提供了一种抗菌水凝胶创面敷料的制备方法，包括：
步骤一：首先将壳聚糖粉末溶解在稀的冰醋酸水溶液中，再加入高碘酸钠(naio4)避光搅拌24h。随后，用去离子水透析，以去除未反应的小分子naio4。获得的氧化壳聚糖样品冷冻干燥后存储在-20ºc冰箱里。
步骤二：首先将透明质酸粉末溶解在缓冲溶液中。再加入edc和hobt，搅拌1h后加入己二酸二酰肼，反应24小时。随后，用去离子水透析，获得的ha-adh样品冷冻干燥后存储在-20ºc冰箱里。
步骤三：将所得的氧化壳聚糖溶解在水杨酸溶液中得到溶液1，ha-adh溶解在次氯酸钙溶液中得到溶液2，将溶液1和溶液2按一定比例进行物理混合后得到可注射的抗菌水凝胶新材料。
上述方案中，步骤一所述冰醋酸溶液浓度为0.5wt%。
上述方案中，步骤一所述壳聚糖的分子质量为30000da，壳聚糖浓度为1g/100ml，加入的壳聚糖与高碘酸钠的质量比为1:0.66。
上述方案中，步骤一所述透析为用去离子水透析5天，每天换4次去离子水。
上述方案中，步骤二所述缓冲溶液为吗啉乙磺酸缓冲溶液，其ph值为6.5。
上述方案中，步骤二所述透明质酸的分子量为920000da，透明质酸浓度为1g/100ml，加入的透明质酸与edc的质量比为1:1.25，加入的透明质酸与hobt的质量比为1:0.9，加入的透明质酸与己二酸二酰肼的质量比为1:4.5。
上述方案中，步骤三中每100ul水杨酸溶液中分别溶解8mg、10mg、12mg、14mg的氧化壳聚糖，每100ul次氯酸钙溶液中溶解12mg的ha-adh；步骤三所述溶液1和溶液2按1:1的体积比进行物理混合。
本发明提供了一种抗菌水凝胶伤口敷料，按照上文所述制备方法制得。
本发明的有益效果：本发明公开的抗菌水凝胶伤口敷料制备方法中，含有改性天然高分子氧化壳聚糖和接枝酰肼的透明质酸，两者可在温和的条件下发生化学交联，形成具有三维网状的水凝胶结构，亲水性好，溶胀性能合适，同时具有良好的生物相容性、自愈合和组织粘附性能。此外，水凝胶形成过程中常见的杀菌剂的缓慢释放可达到瞬间消毒；而氧化壳聚糖在该水凝胶中带有的正电荷可以实现可持续抗菌。这些特性使得这种水凝胶在临床治疗中具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明水凝胶的制备和抗菌机理示意图；
图2为本发明的ocs和ha-adh的制备及其红外谱图；
图3为ocs/ha水凝胶溶胀行为图；
图4为ocs/ha水凝胶降解行为图；
图5a为ocs/ha水凝胶的时间扫描流变行为图；
图5b为ocs/ha-hclo水凝胶的时间扫描流变行为图；
图5c为ocs/ha-hclo水凝胶的频率扫描流变行为图；
图5d为ocs/ha-hclo水凝胶的应变扫描流变行为图；
图6a为水凝胶自愈合过程图；
图6b为水凝胶可注射性表征图；
图6c为水凝胶黏附于猪皮上的电子照片；
图7a为水凝胶体外抗菌性能测试；
图7b为水凝胶生物相容性测试。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等效形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
ocs=氧化壳聚糖；ha-adh=酰肼改性透明质酸；sa=水杨酸；ca(clo)2=次氯酸钠
图1为本发明水凝胶的制备和抗菌机理示意图。
实施例
本发明提供了一种可注射抗菌水凝胶的制备方法，包括：
(a)ocs的合成：
首先将2g分子量为30000da的壳聚糖溶解在200ml0.5wt%稀冰乙酸水溶液中，再加入1.325克高碘酸钠(naio4)。在室温下避光搅拌24h。随后，用去离子水透析4天，以去除未反应的小分子naio4。将其冷冻干燥后获得氧化壳聚糖（ocs），存储在-20ºc冰箱里。
利用傅里叶变换红外光谱(ft-ir)对样品进行分析。采用kbr压片法，于25℃在500到4000cm−1的范围内测量。所得红外谱图结果如图２所示，对比可以发现改性后的氧化壳聚糖在2900-3010cm-1处出现醛基的特征峰，说明成功制备了氧化壳聚糖。
(b)ha-adh的合成：
首先将2g分子量为920000daha溶解在200ml的吗啉乙磺酸缓冲溶液(ph=6.5)中。再加入2.5gedc和1.78ghobt，室温持续搅拌1h。再加入9g己二酸二酰肼(adh)，在室温下连续搅拌24h，得到粗产物ha-adh。用去离子水透析4天，冷冻干燥后储存在-20ºc冰箱里。
利用傅里叶变换红外光谱(ft-ir)对样品进行分析。采用kbr压片法，于25℃在500到4000cm−1的范围内测量。所得红外谱图结果如图２所示，对比可以发现改性后的ha-adh在1130cm-1处出现酰肼的特征峰，说明成功制备了ha-adh。
(c)抗菌水凝胶的配置方法：
第一步，以pbs为溶剂分别制备不同浓度的ha-adh溶液和ocs溶液。然后用双筒注射器将两种溶液按体积比1:1混合。将不同组分浓度的水凝胶标记为ocsx/ha水凝胶，即ha-adh浓度恒为3%，ocs浓度标记为y%(4%、5%、6%、7%)。
第二步，在制备ocs/ha水凝胶的基础上，进一步制备了ocs/ha-hclo水凝胶。ha-adh溶解在125mg/lca(clo)2溶液中，ocs分别溶解在2.5mmsa溶液中。然后将这两种前驱体溶液加入双筒注射器的两个独立腔中。将制备的两种溶液以1:1的体积比混合注射到模型或皮肤表面，采用原位凝胶法制备了一系列ocs/ha-hclo水凝胶。
水凝胶的成胶时间测试：
凝胶化时间用小瓶倾倒法测定。将ha-adh和ocs分别溶解在pbs溶液中。将两种溶液用双筒注射器混合注射得到ha/ocs水凝胶，当水凝胶无流动能力时即为成胶时间。用类似的方法测定ocs/ha-hclo水凝胶的凝胶时间，见表1。我们发现，凝胶时间与ocs浓度呈负相关。ocs/ha水凝胶和ocs/ha-hclo水凝胶相比，二者的凝胶时间几乎相同，说明ca(clo)2溶液和sa溶液的加入对水凝胶的制备没有影响。
表1为小瓶倾倒法测试水凝胶成胶时间
水凝胶的溶胀性能测试：
所有样品(100ul,n=5)分别在聚四氟乙烯模具(直径10mm，高度1mm)中制备。所有样品在500ul的pbs缓冲液中室温下浸泡24小时。然后将水凝胶从pbs缓冲液中取出，在特定时间点0.5h、1h、3h、7h、12h、24h进行称重。此重量标记为ws。水凝胶随后被冻干以获得干重(wd)。计算公式如下：溶胀率(%)=
如图3所示，我们发现，ocs浓度大于6%时，溶胀率是水凝胶原重量的1.5倍。各组ocs/ha水凝胶在pbs浸泡10h后均达到溶胀平衡，说明ocs/ha水凝胶具有良好的吸水性能。
水凝胶的降解性能测试：
将ocs4/ha-hclo、ocs5/ha-hclo、ocs6/ha-hclo、ocs7/ha-hclo(100ul,n=5)浸泡于37℃1mlpbs缓冲液中。在特定的时间间隔(1h,4h,10h,1d,2d,4d和7d)下收集100ul溶液，再补充同样体积的pbs溶液。用酶标仪测试收集到扣除pbs背景后的溶液浓度。如图4所示，随着ocs浓度的增加，水凝胶的降解速率降低，当ocs浓度超过6%时降解速率最小。
水凝胶的流变性质：
水凝胶的流变性质通过马尔文kinexus流变仪测试获得，所有样品均采用8mm平板对平板、8mm的板间距的条件进行测试。取80ul配置好的水凝胶样品，放置于流变仪上，时间扫描采用1%的应变和1hz的频率进行120s的测试，以得到水凝胶材料的储能模量和损耗模量。频率扫描采用1%的应变和0.1-1000hz的频率进行扫描，以得到水凝胶材料的储能模量和损耗模量随频率变化的规律。剪切变稀实验中，水凝胶在1%和500%的应变条件下进行交替的120s时间扫描，即1%应变下低剪切进行60s后，2000%应变下高剪切进行60s，共进行4个循环，循环完成后再进行一次60s的1%应变下低剪切测量，整个过程中频率保持1hz不变。
在时间扫描实验中，对比图5a和图5b，结果证明sa和ca(clo)2的加入对水凝胶的形成没有负面影响。同时结合溶胀和降解实验，我们选择ocs7/ha-hclo水凝胶进行以下所有测试。如图5c，200%以上的应力率可以破坏ocs7/ha-hclo水凝胶中的大部分交联。因此水凝胶在500%的应变率条件下是完全破碎的状态。选择1%和500%这两个应变率的连续转换测试，通过图5d的剪切变稀实验可以观察到水凝胶反复在500%的应变率下破碎，在1%的应变率下恢复，说明水凝胶具有自愈能力。
水凝胶的自愈性、可注射性及组织粘附性实验：
通过宏观实验测定了其自愈性、可注射性和粘附性。为了测试水凝胶的自愈性能，我们分别用亚甲基蓝和甲基橙对边为10mm、厚为1mm的两个三角形水凝胶片进行染色。水凝胶的这些行为通过特定时间间隔的数码照片进行监测。在注射行为测试方面，将染色后的水凝胶依次直接注射到五角星的pvc模具中。对水凝胶进行亚甲基蓝染色后使用购买的猪皮测试水凝胶的粘附性。
在图6a自愈合宏观照片中，蓝色和橙色的两个三角形水凝胶相互接触，15分钟后形成完整的菱形水凝胶。并且这两个水凝胶之间的接触界面的颜色变得亮绿色,这表明这两个三角形良好的融合，也说明水凝胶优良的自愈性能,这是由于ocs上的醛基和ha-adh上的酰肼之间发生的可逆动态希夫碱反应。将亚甲基蓝染色的ha-adh溶液和ocs溶液混合后注入聚四氟乙烯(ptfe)模具的左半部分。然后将亚甲基橙染色的ha-adh溶液和ocs混合后注入同一模具的右半部分。最后，ocs/ha-hclo水凝胶从ptfe模具中移除，可以保持完美的五角星形状（图6b）。这些结果表明，ocs/ha-hclo水凝胶具有完美匹配各种伤口形状的能力。此外，ocs/ha-hclo水凝胶对湿猪皮肤具有很强的组织粘附性，即使在持续折叠和扭转的情况下也是如此（图6c）。说明ocs/ha-hclo水凝胶覆盖创面后，可以紧紧附着在创面上，对创面提供全方位的保护。
水凝胶的体外抗菌性能测试：
用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌评价水凝胶的抗菌活性。体外用琼脂平板扩散试验评价了ocs/ha水凝胶和ocs/ha-hclo水凝胶的抗菌活性。选择ocs/ha水凝胶和ocs/ha-hclo水凝胶作为实验组。然后将制备好的含约1×106cfuml-1的菌悬液加入以下各组：1.pbs缓冲液(990ul);2.琼脂糖水凝胶；3.ocs/ha水凝胶;4.ocs/ha-hclo水凝胶；5.青霉素-链霉素(ps)溶液(990ul)。所有样品在37℃下孵育2h，将细菌重悬于1mlpbs缓冲液中。将稀释菌悬液(104cfuml−1)接种到luria-bertani(lb)琼脂表面，37℃下孵育24h。
体外抗菌实验表明，ocs/ha水凝胶具有明显的抗菌性能，这是由于ocs主链带正电荷所致（图7a）。更重要的是，ocs/ha-hclo水凝胶组的细菌死亡率达到100%，与抗生素ps阳性对照组处于同一水平。这些结果证明了水凝胶的抗菌行为，原因为在ocs/ha-hclo水凝胶形成过程中新鲜释放的hclo负责瞬间消毒，而ocs/ha-hclo水凝胶中的正电荷负责长期抗菌。
水凝胶的生物相容性测试：
在24孔板中制备ocs/ha水凝胶和ocs/ha-hclo水凝胶(200ul/水凝胶,n=4)。在24孔板中加入1ml含有20万个3t3细胞的生长培养基。培养2d或5d后，从24孔板中取出ocs/ha和ocs/ha-hclo水凝胶，通过活/死细胞染色检测水凝胶表面3t3细胞的细胞活力。
以3t3细胞为模型细胞，测试了ocs/ha和ocs/ha-hclo水凝胶的生物相容性（图7b）。在ocs/ha和ocs/ha-hclo水凝胶表面的3t3细胞大部分存活，且与阳性对照组无显著差异，说明ocs/ha和ocs/ha-hclo水凝胶具有良好的生物相容性。
上述实施例对本发明的实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式，在本领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。以上所述仅为本发明较佳可行的实施例而已，并非因此局限本发明的权力范围，凡运用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变化，均包含于本发明的权利范围之内。
1.一种抗菌水凝胶的制备方法，其特征在于该水凝胶按重量比由氧化壳聚糖和接枝酰肼的透明质酸以及水杨酸和次氯酸钙溶液组成，制备步骤如下：
步骤一：首先将壳聚糖粉末溶解在稀的冰醋酸水溶液中，再加入高碘酸钠(naio4)避光搅拌24h；随后，用去离子水透析，以去除未反应的小分子naio4；获得的氧化壳聚糖样品，冷冻干燥后存储在-20ºc冰箱里；
步骤二：首先将透明质酸（ha）粉末溶解在缓冲溶液中；再加入edc和hobt，搅拌1h后加入己二酸二酰肼，反应24小时；随后，用去离子水透析，获得的ha-adh样品，冷冻干燥后存储在-20ºc冰箱里；
步骤三：将步骤一所得的氧化壳聚糖溶解在水杨酸溶液中得到溶液1，步骤二所得的ha-adh溶解在次氯酸钙溶液中得到溶液2，将溶液1和溶液2按一定比例进行物理混合后得到可注射的抗菌水凝胶新材料。
2.根据权利要求1所述的抗菌水凝胶制备方法，其特征在于步骤一所述冰醋酸溶液浓度为0.5wt%。
3.根据权利要求1所述的抗菌水凝胶制备方法，其特征在于步骤一所述壳聚糖的分子质量为30000da，壳聚糖浓度为1g/100ml，加入的壳聚糖与高碘酸钠的质量比为1:0.66。
4.根据权利要求1所述的抗菌水凝胶制备方法，其特征在于步骤一所述透析为用去离子水透析5天，每天换4次去离子水。
5.根据权利要求1所述的抗菌水凝胶制备方法，其特征在于步骤二所述缓冲溶液为吗啉乙磺酸缓冲溶液，其ph值为6.5。
6.根据权利要求1所述的抗菌水凝胶制备方法，其特征在于步骤二所述透明质酸的分子质量为920000da，透明质酸的浓度为1g/100ml，加入的透明质酸与edc的质量比为1:1.25，加入的透明质酸与hobt的质量比为1:0.9，加入的透明质酸与己二酸二酰肼的质量比为1:4.5。
7.根据权利要求1所述的抗菌水凝胶制备方法，其特征在于步骤三中每100ìl水杨酸溶液中分别溶解8mg、10mg、12mg、14mg的氧化壳聚糖，每100ìl次氯酸钙溶液中溶解12mg的ha-adh；步骤三所述溶液1和溶液2按1:1的体积比进行物理混合。
8.权利要求1至7任一项所述的抗菌水凝胶的制备方法制得的一种可注射抗菌水凝胶。
技术总结