本发明属于改性膜制备领域，更具体地，涉及一种高酶活力改性膜及其制备方法。
背景技术：
高压脉冲电场作为一种新兴的非热力物理杀菌技术，由于其低能耗、短时间处理和无化学物残留的优点，高压脉冲电场已被用于调节许多酶的活性和稳定性，并取得了重大成功，表明低强度高压脉冲电场可以提高酶活性。但是高压脉冲电场处理后的酶活力在一段时间会降低，甚至比未处理酶活性还低，这将大大降低酶的重复使用。
酶作为一种生物催化剂，对环境敏感且易失活，通过对酶的固定化不仅能实现对酶的重复使用且增加了酶的稳定性。但酶固定化后酶的结构会发生变化，酶的灵活性和活力会大大降低。同时，这些物理固定化方法稳定性较差，在反应过程中酶易泄漏和流失。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对酶固定后酶活力降低和酶在膜上酶载量的问题，提供一种高酶活力改性膜及其制备方法。
为了实现上述目的，本发明的第一方面提供一种高酶活力改性膜的制备方法，该制备方法包括：
(1)制备高酶活力酶液
将胃蛋白酶粉末以柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液稀释得到胃蛋白酶溶液，冷藏后用脉冲电场进行处理，得到所述高酶活力酶液；
(2)制备改性膜
将pes膜浸泡在tris-hcl缓冲液中，加入原花青素和聚乙烯亚胺得到混合液，搅拌至原花青素和聚乙烯亚胺涂覆完成后，以去离子水清洗，得到所述改性膜；
(3)制备高酶活力改性膜
将改性膜浸没于所述高酶活力酶液中，可选地经过搅拌，经柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液清洗后，得到所述高酶活力改性膜。
本发明所提供的方法生产持续高酶活力的改性膜既具有高酶活力，又提高了酶的重复使用能力和膜的使用寿命。
作为优选方案，所述柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液的ph＝3.0，浓度为0.2m。
作为优选方案，所述tris-hcl缓冲液的ph＝8.5。
作为优选方案，所述冷藏的温度为3-5℃，如4℃。
作为优选方案，步骤(1)中，脉冲电场处理的条件包括：电场强度为4～16kv/cm，流速为40～100ml·min-1；作为进一步的优选方案，步骤(1)中，脉冲电场处理的条件包括：电场强度为8～11kv/cm，流速为70～90ml·min-1。电场强度进一步优选为8～11kv/cm，最优值为10kv/cm。
作为优选方案，步骤(2)中，相对于10-15cm2的pes膜，原花青素的添加量为0～1g且不包括0，聚乙烯亚胺的添加量为0～1g且不包括0；作为进一步的优选方案，步骤(2)中，相对于10-15cm2的pes膜，原花青素的添加量为0.1-0.3g，聚乙烯亚胺的添加量为0.2-0.4g，最优选的方案是：相对于10-15cm2的pes膜，原花青素的添加量为0.2g，聚乙烯亚胺的添加量为0.3g，如相对于13.4cm2的pes膜，原花青素的添加量为0.2g，聚乙烯亚胺的添加量为0.3g。
作为优选方案，步骤(2)中，搅拌的时间为8-10h。
作为优选方案，步骤(3)中，搅拌的时间为0-6h且不包括0，进一步优选为1～4h，最优选为1.5～3h。
作为优选方案，步骤(3)中，高酶活力酶液中胃蛋白酶的浓度为1～6mg/ml，进一步优选为3.5～5mg/ml。
本发明的第二方面提供由上述的制备方法制得的高酶活力改性膜。
本发明的有益效果：
原花青素是广泛存在于植物和日常食物中的一类多酚化合物。本发明中，由于原花青素结构中具有酚羟基，可以与富含氨基的物质通过shiff碱反应和迈克尔加成反应，因此可以将其与聚乙烯亚胺混合用作表面涂料。膜通过原花青素-聚乙烯亚胺共沉积，可以使其表面富含氨基和提高膜的亲水性和抗污染能力，延长膜的使用寿命和清洗成本。
本发明的方法制得的持续高酶活力的改性膜既具有高酶活力，同时酶的重复使用能力和膜的亲水性和抗污染能力都得以解决。
本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
图1示出了制备例2～制备例9的胃蛋白酶活力测试结果。
图2示出了制备例1、制备例10～制备例15的胃蛋白酶活力测试结果。
图3示出了聚醚砜(pes)原膜和实施例1步骤(1)制备得到的改性膜的红外光谱仪检测结果。
图4示出了聚醚砜原膜扫描电镜图。
图5示出了原花青素和聚乙烯亚胺改性后扫描电镜图。
图6示出了聚醚砜(pes)原膜和实施例1步骤(1)制备得到的改性膜的接触角检测结果。
图7示出了实施例1步骤(2)制备的高酶活力改性膜的稳定性测试结果。
图8示出了不同浓度高酶活力酶液下高酶活力改性膜表面的胃蛋白酶活力检测结果。
图9示出了不同搅拌时间下高酶活力改性膜表面的胃蛋白酶活力检测结果。
图10示出了本发明一个实施例的一种高酶活力改性膜的制备方法的流程示意图。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了使本发明更加透彻和完整，并且能够将本发明的范围完整地传达给本领域的技术人员。
测试例1
胃蛋白酶活力的测定方法为：在20ml试管中加入20ml0.2mmol/l溶液(nah2po4-柠檬酸缓冲液ph＝3.0)，再分别加入0.1ml各个制备例制备的酶液，混合液在37℃条件下反应37min，加入10％三氯乙酸，摇匀，经10000rpm离心15min后，于280nm波长下测定吸光度，并计算酶活。酶活力单位定义：在ph＝3.0、温度37℃，1min水解bsa释放1μmol酪氨酸时所需的酶量，为1个酶活力单位(u)。
制备例1
本制备例制备一种高酶活力酶液。步骤包括：
将胃蛋白酶粉末以ph＝3.0、浓度为0.2m的柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液稀释得到胃蛋白酶溶液，在4℃冷藏后用脉冲电场进行处理，电场强度为10kv/cm，流速为80ml·min-1，得到高酶活力酶液，高酶活力酶液中胃蛋白酶的浓度为6mg/ml，高酶活力酶液的胃蛋白酶酶活力为50(103，u)。
制备例2
与制备例1的不同之处在于，电场强度为0kv/cm、流速为0ml·min-1，酶活力为30(103，u)。
制备例3
与制备例1的不同之处在于，电场强度为4kv/cm，流速为50ml·min-1，酶活力为35.5(103，u)。
制备例4
与制备例1的不同之处在于，电场强度为6kv/cm，流速为50ml·min-1，酶活力为36(103，u)。
制备例5
与制备例1的不同之处在于，电场强度为8kv/cm，流速为50ml·min-1，酶活力为37(103，u)。
制备例6
与制备例1的不同之处在于，电场强度为10kv/cm，流速为50ml·min-1，酶活力为37.5(103，u)。
制备例7
与制备例1的不同之处在于，电场强度为12kv/cm，流速为50ml·min-1，酶活力为35.5(103，u)。
制备例8
与制备例1的不同之处在于，电场强度为14kv/cm，流速为50ml·min-1，酶活力为35.5(103，u)。
制备例9
与制备例1的不同之处在于，电场强度为16kv/cm，流速为50ml·min-1，酶活力为32.5(103，u)。
制备例2～制备例9的胃蛋白酶活力测试结果参见图1。
制备例10
与制备例1的不同之处在于，流速为40ml·min-1。
制备例11
与制备例1的不同之处在于，流速为50ml·min-1。
制备例12
与制备例1的不同之处在于，流速为60ml·min-1。
制备例13
与制备例1的不同之处在于，流速为70ml·min-1。
制备例14
与制备例1的不同之处在于，流速为90ml·min-1。
制备例15
与制备例1的不同之处在于，流速为100ml·min-1。
制备例1、制备例10～制备例15的胃蛋白酶活力测试结果参见图2。
实施例1
本实施例提供一种高酶活力改性膜。步骤包括：
(1)将13.4cm2的pes膜浸泡在100ml、ph＝8.5的tris-hcl缓冲液中，加入0.2g原花青素和0.3g聚乙烯亚胺得到混合液，在室温下搅拌9h，至原花青素和聚乙烯亚胺涂覆完成，然后以去离子水清洗三次，得到改性膜。
(2)将改性膜浸没于20ml制备例1制备得到的高酶活力酶液中，在室温下轻微搅拌2h，经ph＝3.0、浓度为0.2m的柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液清洗三次后，得到高酶活力改性膜。
实施例2
与实施例1的不同之处在于，步骤(2)中，高酶活力酶液的浓度分别为1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml，高酶活力改性膜表面的胃蛋白酶活力的结果如图8所示。
实施例3
与实施例1的不同之处在于，步骤(2)中，搅拌的时间为1h、2h、3h、4h、5h，高酶活力改性膜表面的胃蛋白酶活力的结果如图9所示。
测试例2
采用红外光谱仪检测实施例1步骤(1)制备得到的改性膜，红外光谱图如图3所示，由图3可知：与聚醚砜(pes)原膜相比，原花青素和聚乙烯亚胺共沉积后的膜在3100cm-1～3600cm-1处出现吸收峰，这是聚醚砜原膜中引入了-oh官能团，红外和电子扫描电镜结果表明我们成功的将原花青素和聚乙烯亚胺引入了聚醚砜膜上。
测试例3
采用扫描电子显微镜观察实施例1步骤(1)制备得到的改性膜，如图4和图5所示，图4是聚醚砜原膜扫描电镜图，图5是原花青素和聚乙烯亚胺改性后扫描电镜图，通过图4和图5可以看到，本试验制备的改性膜表面粗糙，致密，大大增加酶固定位点。
测试例4
采用接触角检测实施例1步骤(1)制备得到的改性膜，接触角图如图6所示，由图6可知：与聚醚砜(pes)原膜相比，原花青素和聚乙烯亚胺共沉积后的膜接触角明显降低，结合红外和接触角结果表明改性膜具有很好的亲水性和抗污染能力。
测试例5
对实施例1步骤(2)制备的高酶活力改性膜进行稳定性测试，测试结果如图7所示，结果表明高酶活力改性膜中酶具有很好的重复使用能力。
图10示出了一个实施例的一种高酶活力改性膜的制备方法的流程示意图。包括：将胃蛋白酶处理后用脉冲电场进行处理，得到所述高酶活力胃蛋白酶酶液；将聚醚砜超滤膜(pes)与原花青素和聚乙烯亚胺共沉淀进行涂覆得到改性膜；将改性膜浸没于高酶活力胃蛋白酶酶液中，得到高酶活力改性膜。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。
1.一种高酶活力改性膜的制备方法，其特征在于，该制备方法包括：
(1)制备高酶活力酶液
将胃蛋白酶粉末以柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液稀释得到胃蛋白酶溶液，冷藏后用脉冲电场进行处理，得到所述高酶活力酶液；
(2)制备改性膜
将pes膜浸泡在tris-hcl缓冲液中，加入原花青素和聚乙烯亚胺得到混合液，搅拌至原花青素和聚乙烯亚胺涂覆完成后，以去离子水清洗，得到所述改性膜；
(3)制备高酶活力改性膜
将改性膜浸没于所述高酶活力酶液中，可选地经过搅拌，经柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液清洗后，得到所述高酶活力改性膜。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，
所述柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液的ph＝3.0，浓度为0.2m；
所述tris-hcl缓冲液的ph＝8.5；
所述冷藏的温度为3-5℃。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤(1)中，脉冲电场处理的条件包括：
电场强度为4～16kv/cm，流速为40～100ml·min-1。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其中，步骤(1)中，脉冲电场处理的条件包括：
电场强度为8～11kv/cm，流速为70～90ml·min-1。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤(2)中，
相对于10-15cm2的pes膜，原花青素的添加量为0～1g且不包括0，聚乙烯亚胺的添加量为0～1g且不包括0。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其中，步骤(2)中，
相对于10-15cm2的pes膜，原花青素的添加量为0.1-0.3g，聚乙烯亚胺的添加量为0.2-0.4g。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤(2)中，搅拌的时间为8-10h。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤(3)中，搅拌的时间为0-6h且不包括0。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤(3)中，高酶活力酶液中胃蛋白酶的浓度为1～6mg/ml。
10.由权利要求1-9中任意一项所述的制备方法制得的高酶活力改性膜。
技术总结