本发明涉及一种依克多因-透明质酸复合凝胶的制备方法，还涉及按照此方法制得的复合凝胶以及该复合凝胶在注射用类产品中的应用，属于生物医用材料
技术领域：
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背景技术：
：依克多因(2-甲基-1,4,5,6,-四氢嘧啶-4-羧酸)来源于高嗜盐菌(halomonaselongata)，在高盐、高温、高紫外线辐射的极端条件下，依克多因可保护嗜盐菌免受伤害。研究表明，依克多因能够促进细胞的增殖、分化，同时遏制衰老基因的表达，从根本上改变皮肤细胞构成，延缓皮肤衰老；有效提升皮肤细胞的免疫防护能力，增加细胞修复能力，有效抵抗微生物及过敏原的入侵；缓解皮肤所受的各种压力：抵御紫外线损伤、干燥环境所致皮肤老化、表面活性剂引起的皮肤劣化等；同时还具有高效的滋润补水作用。因此，依克多因是一种高效的多功能抗衰老活性物质，医美研究者对其研究也越来越多，其应用也越来越广泛。透明质酸(hyaluronicacid，ha)是一种直链高分子粘多糖，由n-乙酰葡萄糖胺和d-葡萄糖酸组成，广泛存在于动物体和微生物体中，具有良好的黏弹性和高效的保水性、组织相容性和非免疫原性，是一种良好的生物相容高分子材料，深受医美学究研究工作者的欢迎。随着填充皱纹、填平凹陷部位、修正面部轮廓(丰唇、填充苹果肌和隆鼻)等软组织填充手术越来越受欢迎，人们对于软组织填充剂各项生物指标的要求也越来越高，透明质酸因其安全性高、生物相容性好、术后不良反应少、注射后填充效果立即显现等优势成为国内外最常用的软组织填充剂。传统的交联透明质酸钠凝胶仅起到填充作用，填充周期在3个月到1年半，其功能性相对单一。基于依克多因的功能，将依克多因与交联透明质酸钠凝胶相结合，不但可以保持交联透明质酸钠的填充功能，而且可以增加交联透明质酸钠凝胶抗衰老、皮肤修复再生等功能。cn110812250a公开了一种可快速凝胶化的面膜及其制备和使用方法，该方法以透明质酸、依克多因和交联剂在碱性环境下发生交联反应，形成交联产物，所得交联产物作为面膜基质，交联后的成分在使用的过程中能够起到缓释的作用，释放速度持续，同时依克多因交联在面膜基质中，在使用时分布均匀、能够持久的与皮肤接触，不易随水流失，能更好的被皮肤吸收，避免了依克多因的浪费。但是，该方法将透明质酸、依克多因和bdde交联剂混合进行交联，bdde的两端为环氧丙烷基团的结构，反应活性大，交联产物种类较为混杂，不但有经bdde交联的交联透明质酸，也有两侧是依克多因的bdde交联产物，还有枝接着依克多因的交联透明质酸等多种产物。该方法所得的交联凝胶成份复杂，接枝度低、可控性差，交联剂难纯化，生物安全性差，杂质含量难把控，只适用于对安全性要求相对较低的皮肤表面，无法用于体内。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种依克多因-透明质酸复合凝胶的制备方法，该方法通过反应步骤的改进和调整，所得复合凝胶产物成分可控，接枝度可调，交联剂易于纯化，安全性高，适合于体内使用，具有长效的抗衰老、修复皮肤、填充等功效。本发明通过分步法进行交联，能够可控的将一部分依克多因与透明质酸或其盐通过悬挂修饰的方法连接在一起，提升了产品的接枝度、产量和纯度，将另一部分依克多因与形成的凝胶混合，这部分依克多因以游离的形式存在，因此整个复合凝胶具有长效缓释的作用。本发明具体技术方案如下：一种依克多因-透明质酸复合凝胶的制备方法，该方法包括以下步骤：(1)将1,4丁二醇单缩水甘油醚和依克多因在催化剂作用下进行亲核反应，得到下述式b所示的化合物b；(2)将化合物b和环氧氯丙烷先在催化剂作用下进行开环反应，然后再在氢氧化钠作用下进行闭环反应，得到交联剂ebd；(3)以交联剂ebd和交联剂bdde为混合交联剂，与透明质酸或其盐发生交联反应，得交联透明质酸凝胶；(4)将交联透明质酸凝胶与依克多因溶液混合均匀，得依克多因-透明质酸复合凝胶。其中，1,4丁二醇单缩水甘油醚的结构式为：化合物b的结构式为：交联剂ebd的结构式为：本方法采用分步法合成ebd，将1,4丁二醇单缩水甘油醚和依克多因进行反应，1,4丁二醇单缩水甘油醚一侧为环氧丙烷基团，另一侧为醇羟基，环氧丙烷基团的活性远高于醇羟基，这就保证了1,4丁二醇单缩水甘油醚跟依克多因反应时的官能团选择性，依克多因只与含环氧丙烷的一侧反应；制备得化合物b后，裸露的醇羟基可转化成具有活性的环氧丙烷基团，与透明质酸或其盐发生交联反应。该方法工艺简单、条件温度、杂质少、易纯化，ebd在后续与透明质酸或其盐进行交联时，一端的环氧丙烷基团可与透明质酸或其盐进行交联，有效的将依克多因悬挂交联到透明质酸或其盐上。合成交联剂ebd的反应式如下所示：进一步的，步骤(1)中，1,4丁二醇单缩水甘油醚可以通过现有技术中公开的方法实现，现有技术报道的方法都可以使用。例如，可以以1,4丁二醇和环氧氯丙烷为原料，将1,4丁二醇和环氧氯丙烷先在催化剂作用下进行开环反应，然后在氢氧化钠作用下进行闭环反应，得到1,4丁二醇单缩水甘油醚。本发明某一具体实施方式中提供了一种1,4丁二醇单缩水甘油醚的制备方法，步骤是：将1,4丁二醇和催化剂混合，升温后滴加环氧氯丙烷，滴毕后继续反应，反应后冷却至室温，加入有机溶剂搅拌均匀，再加入氢氧化钠溶液，继续进行反应。反应后进行萃取、浓缩、纯化，得淡黄色油状物，即为1,4丁二醇单缩水甘油醚。所用催化剂为三氟化硼乙醚、四丁基溴化铵、incl3、sncl4、zncl2或三氟化硼三乙醇胺，优选为三氟化硼乙醚。催化剂用量一般为1,4丁二醇的0.5wt％～10wt％。1,4丁二醇和环氧氯丙烷的摩尔比一般为1:0.4～0.6，1,4丁二醇和环氧氯丙烷的反应温度一般为40℃～80℃。氢氧化钠与环氧氯丙烷的摩尔比为1-1.3:1，闭环反应的温度为40-45℃。进一步的，步骤(1)中，所用催化剂为5-叔丁基呋喃甲酸铬、pd(oac)2/binap(醋酸钯/1,1'-联萘-2,2'-双二苯膦)或alo3，优选为5-叔丁基呋喃甲酸铬。催化剂用量一般为1,4丁二醇单缩水甘油醚的0.1wt％～15wt％，优选为2-10wt％。进一步的，所用催化剂5-叔丁基呋喃甲酸铬可以通过现有技术中公开的方法实现，现有技术报道的方法都可以使用。进一步的，步骤(1)中，1,4丁二醇单缩水甘油醚和依克多因的摩尔比为1:1-2。这两者的反应温度一般为50℃～120℃。除此之外，反应在溶剂存在下进行，所述溶剂为非极性溶剂，例如甲苯、丙酮、正己烷等。进一步的，步骤(2)中，化合物b和环氧氯丙烷的摩尔比为1:1-2，氢氧化钠与环氧氯丙烷的摩尔比为1-1.3:1。开环反应的温度一般为40℃～80℃，闭环反应的温度一般为40-45℃。进一步的，步骤(2)中，所用催化剂为三氟化硼乙醚、四丁基溴化铵、incl3、sncl4、zncl2或三氟化硼三乙醇胺，优选为三氟化硼乙醚。催化剂用量一般为化合物b的0.05wt％～10wt％，优选为0.5-10wt％。进一步的，步骤(2)中，反应在有机溶剂存在下进行，所述溶剂为非极性溶剂，例如甲苯、丙酮、正己烷等。在本发明某一具体实施方式中，提供了一种ebd的合成方法，如下：将化合物b溶于有机溶剂中，加入催化剂，升温后滴加环氧氯丙烷，滴毕后继续反应，反应后冷却至室温，加入有机溶剂搅拌均匀，再加入氢氧化钠溶液，继续进行反应。反应结束后进行萃取、浓缩、柱层析，拉干，得交联剂ebd。进一步的，步骤(3)中，交联剂ebd与透明质酸或其盐的质量比为1:1～200，交联剂bdde与透明质酸或其盐的质量比为1:20～200。交联剂的用量影响所得交联透明质酸凝胶的黏弹性、硬度和流动性。优选的，交联剂ebd与透明质酸或其盐的质量比为1:30～100，交联剂bdde与透明质酸或其盐的质量比为1:50～150。在此优选范围内得到的凝胶黏弹性适中，便于注射和填充。进一步的，步骤(3)中，交联反应在碱性环境下进行，以水为溶剂。交联反应的ph大于10，该碱性环境可以由碱性物质的水溶液提供，一般常用的为氢氧化钠溶液。进一步的，步骤(3)中，交联反应的温度为30～60℃，优选为40～50℃。交联反应的时间为0.5～8h，优选为1～3h。进一步的，本发明中所指的透明质酸或其盐的分子量为100万da～300万da，该分子量范围所得的交联凝胶适合于人体注射美容填充，在体内具有较好的抗降解性能。所述的透明质酸盐选自透明质酸的钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、锌盐或金盐，优选为透明质酸的钠盐。进一步的，步骤(3)中，交联反应后，调整ph至中性，透析、制粒得到交联透明质酸凝胶。交联透明质酸凝胶中透明质酸的含量为1.0～3.5wt％，优选为1.5～2.5wt％。透析所用溶液为ph6.5～7.5的磷酸-氯化钠缓冲液，缓冲液的ph优选为6.8～7.2。透析的目的是为了去除未反应的交联剂等，对凝胶进行纯化，所述透析温度为20～35℃，优选22～28℃，透析至凝胶纯度满足要求，一般所需时间为8～68h。将透析后的凝胶过筛网进行制粒，制粒所用筛网为40～200目，优选为50～140目。进一步的，步骤(4)中，依克多因与交联透明质酸凝胶的质量比为1:2～100，依克多因添加量过多，最终产品中交联透明质酸凝胶含量降低，抗降解性能受到影响，依克多因添加量过低，起不到较长时间的抗衰老作用和抗衰老效果。因此，依克多因与交联透明质酸凝胶的质量比优选为1:7～20。混合均匀后的混合物灌装、灭菌即可得最终的产品。灭菌优选采用湿热灭菌，灭菌温度为121℃左右，灭菌时间为8～30min。本发明采用悬挂修饰的方式将依克多因与透明质酸或其盐结合在一起，使依克多因方便、可控的接枝到交联透明质酸凝胶上，所得凝胶再与游离的依克多因混合，得到最终的复合凝胶产品。该复合凝胶产品在体内代谢时，悬挂的依克多因逐渐被游离出来，可以起到长效的抗衰老和修复皮肤等功效；游离的依克多因可以在短时间内提高皮肤的免疫防护能力修复皮肤，以及促进细胞的增殖、分化，遏制衰老基因的表达。本发明所制备的复合凝胶在保持交联透明质酸凝胶填充作用的同时，通过游离和交联两种形态的依克多因相互配合，可从根本上改变皮肤细胞构成，发挥出高效抗衰老和皮肤修复再生的作用，性能优异。按照此方法制得的依克多因-透明质酸复合凝胶产品也在本发明保护范围之内。本发明具有以下优势：1、本发明以分步法制备了含依克多因的交联剂ebd，制备工艺简单，条件温和，工艺稳定性好，且易纯化，杂质少，制备的ebd纯度高。ebd与透明质酸或其盐反应将依克多因枝接于透明质酸或其盐时，反应彻底，杂质少且易纯化，避免了潜在的不良反应，解决了终产物多杂质、难纯化、安全性低的缺点。2、本发明先形成ebd后再接枝到透明质酸或其盐上，保证了依克多因的接枝度，依克多因可以实现在交联透明质酸凝胶上方便、可控的接枝。另外，也避免了直接使用bdde将依克多因枝接于透明质酸或其盐上时出现的多种杂质和枝接度低的缺点。3、本发明产品同时含有游离和交联两种形态的依克多因，交联形态的依克多因可以更长效的发挥其抗衰老和皮肤修复再生的作用，游离的依克多因可以快速的发挥皮肤修复及抗衰效果，与现有注射用修饰透明酸钠凝胶相比，本发明不仅具有填充作用，而且可以通过两种形态的依克多因在整个透明质酸凝胶填充周期内起到抗衰老和皮肤修复再生的作用，并在青光眼手术、泪道阻塞手术及玻璃体切除术等手术中作为粘弹剂辅助治疗更具潜力和效果。具体实施方式下面通过具体实施对本发明进行进一步说明，但本发明不限于这些实施例。以下实施例如无特别说明，采用的试剂均为市售产品，为分析级。下述实施例中，所用透明质酸来自华熙生物科技股份有限公司，所用催化剂购自国药集团和麦克林试剂有限公司。下述实施例中，5-叔丁基呋喃甲酸铬的制备方法为：称取5-叔丁基呋喃甲酸0.3g和醋酸铬0.1g溶于20ml甲醇中，搅拌回流3h，浓缩掉甲醇，加入20ml饱和碳酸氢钠溶液，40℃搅拌15min，抽滤，水洗滤饼，收集滤饼，真空干燥后得亮绿色固体，即为5-叔丁基呋喃甲酸铬。实施例1交联剂ebd的制备，具体如下：(1)将18g1,4-丁二醇和0.18g三氟化硼乙醚加入烧瓶中，升温至50℃，滴加9.2g环氧氯丙烷，滴毕后继续反应4小时，冷却至室温后加入100ml甲苯，搅拌，再加入10ml氢氧化钠(aq，40％)，45℃继续反应1小时。反应结束后加入100ml水，乙酸乙酯萃取，浓缩，得黄色油状产物，即为1,4丁二醇单缩水甘油醚。(2)将14.6g1,4丁二醇单缩水甘油醚和17.1g依克多因溶于100ml甲苯，加入0.34g5-叔丁基呋喃甲酸铬，115℃搅拌6h，反应结束后加入50ml水，乙酸乙酯萃取，浓缩，柱层析，得产物b。(3)将14.4g产物b溶于甲苯，加入0.072g三氟化硼乙醚，升温至60℃，滴加7.1g环氧氯丙烷，滴毕后继续反应6小时，冷却至室温后加入100ml甲苯，搅拌，再加入15ml氢氧化钠(aq，40％)，45℃继续反应。反应结束后加入一定量水，乙酸乙酯萃取，浓缩，柱层析，拉干得交联剂ebd，收率为91.3％，纯度为99.3％。实施例2交联剂ebd的制备，具体如下：(1)将18g1,4-丁二醇和0.09g三氟化硼乙醚加入烧瓶中，升温至40℃，滴加7.4g环氧氯丙烷，滴毕后继续反应2小时，冷却至室温后加入100ml甲苯，搅拌，再加入10ml氢氧化钠(aq，40％)，45℃继续反应1小时。反应结束后加入100ml水，乙酸乙酯萃取，浓缩，得黄色油状产物，即为1,4丁二醇单缩水甘油醚。(2)将14.6g1,4丁二醇单缩水甘油醚和14.2g依克多因溶于100ml丙酮，加入0.071g5-叔丁基呋喃甲酸铬，60℃搅拌2h，反应结束后加入50ml水，乙酸乙酯萃取，浓缩，柱层析，得产物b。(3)将14.4g产物b溶于丙酮，加入0.028g三氟化硼乙醚，升温至40℃，滴加7.1g环氧氯丙烷，滴毕后继续反应2小时，冷却至室温后加入100ml丙酮，搅拌，再加入15ml氢氧化钠(aq，40％)，45℃继续反应。反应结束后加入一定量水，乙酸乙酯萃取，浓缩，柱层析，拉干得交联剂ebd，收率为87.6％，纯度为96.1％。实施例3交联剂ebd的制备，具体如下：(1)将18g1,4-丁二醇和2.7g三氟化硼乙醚加入烧瓶中，升温至80℃，滴加10.8g环氧氯丙烷，滴毕后继续反应12小时，冷却至室温后加入100ml甲苯，搅拌，再加入10ml氢氧化钠(aq，40％)，45℃继续反应1小时。反应结束后加入100ml水，乙酸乙酯萃取，浓缩，得黄色油状产物，即为1,4丁二醇单缩水甘油醚。(2)将14.6g1,4丁二醇单缩水甘油醚和28.4g依克多因溶于100ml正己烷，加入1.46g5-叔丁基呋喃甲酸铬，80℃搅拌12h，反应结束后加入50ml水，乙酸乙酯萃取，浓缩，柱层析，得产物b。(3)将14.4g产物b溶于正己烷，加入1.44g三氟化硼乙醚，升温至80℃，滴加9.25g环氧氯丙烷，滴毕后继续反应12小时，冷却至室温后加入100ml正己烷，搅拌，再加入15ml氢氧化钠(aq，40％)，45℃继续反应。反应结束后加入一定量水，乙酸乙酯萃取，浓缩，柱层析，拉干得交联剂ebd，收率为86.7％，纯度为95.5％。实施例4按照实施例1的方法制备ebd，不同的是：步骤(1)和(3)中，所用的催化剂为sncl4，步骤(2)中，所用的催化剂为pd(oac)2/binap。最终所得ebd的收率为73.6％，纯度为96.1％。实施例5按照实施例1的方法制备ebd，不同的是：步骤(1)和(3)中，所用的催化剂为四丁基溴化铵，步骤(2)中，所用的催化剂为alo3。最终所得ebd的收率为77.4％，纯度为95.2％。实施例6称取10g透明质酸钠(分子量200万da)加到80ml氢氧化钠(aq.0.25m)中，混合均匀，加入不同质量的bdde和实施例1制备的ebd，混合均匀，在50℃下交联2h，交联后降至室温，将得到的凝胶剪碎，加到250mlph为7.0的磷酸缓冲液中溶胀48h，过60目筛网制得交联透明质酸钠凝胶。交联透明质酸钠凝胶黏弹性的检测：在(25±0.5)℃，采用流变仪在剪切速率从0.01hz至100hz频率范围内进行频率扫描(oscillationfrequencysweep模式)，使用转子p20til，参数设置cd项下γ＝0.01，扫描范围为0.01hz至100hz；记录0.1hz频率下g’和g”数据。不同bdde和ebd的用量下所得交联透明质酸钠凝胶的黏弹性检测数据如下表1所示：表1结果显示：实施例6-1到实施例6-5的弹性模量(g’)和黏性模量(g”)均大于200pa.s，具有良好的弹性和较强的流动性，适合作为填充材料。实施例6-6弹性、黏性较差，不适宜作为填充材料。实施例7称取10g透明质酸钠(分子量200万da)加到80ml氢氧化钠(aq.0.25m)中，混合均匀，加入0.1408gbdde和0.1515g实施例1制备的ebd，混合均匀，在40℃下交联3h，降至室温，将得到的凝胶剪碎，加到250mlph为7.0的磷酸缓冲液中，溶胀48h，过60目筛网制得交联透明质酸钠凝胶。将依克多因加入交联透明质酸钠凝胶中，混匀，灌装、灭菌得注射用依克多因-透明质酸复合凝胶。依克多因和的交联透明质酸钠凝胶用量如下表2所示：表2编号依克多因/g交联透明质酸钠凝胶/g7-166.67133.337-225.01175.037-320.03180.027-49.52190.487-51.98198.02实施例8称取10g透明质酸钠加到80ml氢氧化钠(aq.0.25m)中，混合均匀，加入0.1408gbdde和0.1515g实施例1制备的ebd，混合均匀，在60℃下交联1h，降至室温，将得到的凝胶剪碎，加到250mlph为7.0的磷酸缓冲液中，溶胀48h，过60目筛网制得交联透明质酸钠凝胶。将20.03g依克多因加入180.02g交联透明质酸钠凝胶中，混匀，灌装、灭菌得注射用依克多因-透明质酸复合凝胶。复合凝胶黏弹性的检测：在(25±0.5)℃，采用流变仪在剪切速率从0.01hz至100hz频率范围内进行频率扫描(oscillationfrequencysweep模式)，使用转子p20til，参数设置cd项下γ＝0.01，扫描范围为0.01hz至100hz；记录0.1hz频率下g’和g”数据。透明质酸钠分子量及黏弹性指标数据如下表3所示：表3编号透明质酸钠分子量弹性模量(g’)hz黏性模量(g”)hz8-1100万da223.34pa.s245.32pa.s8-2200万da287.22pa.s273.17pa.s8-3300万da257.08pa.s209.43pa.s结果显示：实施例8-1到实施例8-3的弹性模量(g’)和黏性模量(g”)均大于200pa.s，具有良好的弹性和较强的流动性，其中，分子200万da的透明质酸钠制备的复合凝胶弹性和流动性能最好。对比例称取10g透明质酸钠(分子量200万da)和20.03g依克多因加到80ml氢氧化钠溶液(0.25m)中，混合均匀，加入0.20gbdde，混合均匀，50℃交联2h，降至室温，将得到的凝胶剪碎，加到250mlph为7.0的磷酸缓冲液中，溶胀48h，过60目筛网制得凝胶，经灌装、灭菌得注射用依克多因-透明质酸复合凝胶。枝接度的测定取适量按照实施例和对比例方法交联制备的交联透明质酸钠凝胶，经透析、沉醇、烘干和解交联后，以hplc法测定样品中枝接的依克多因含量，并计算依克多因的枝接度。枝接度数据如下表4所示：表4结果显示：各实施例制备的凝胶样品中依克多因的接枝率均明显好于对比例，其中，实施例6-3至6-5制备的交联透明质酸钠凝胶接枝率好于实施例6-1和6-2；实施例6-4与实施例7、实施例8的接枝率差别不大，说明游离依克多因和透明质酸的分子量对复合凝胶依克多因的接枝率影响不大。抗衰老实验样品试液配制方法：实施例6-4经灌装、灭菌后与实施例7、实施例8、对比例分别用dmem培养液稀释至100ug/ml、50ug/ml、25ug/ml、5ug/ml浓度，配置成样品试液。实验方法：建立肾小管上皮衰老细胞模型对本发明实施例及对比例所得的产品进行抗衰老实验。具体步骤如下：3t3细胞经复苏、培养及传代后，取对数生长期细胞以1.875×104个/cm2接种密度培养细胞，每两天更换一次dmem培养液，第7天弃去dmem培养液加入上述方法配置的样品试液，平行两份，培养24h和48h后经sabg染色。空白对照组不添加样品试液，始终用dmem培养液进行培养，每两天更换一次dmem培养液。衰老比例(％)＝衰老细胞数/细胞总数×100％。各样品对衰老比例的影响见表5。表5各样品对衰老比例的影响结果显示：各实施例均具有抗衰老作用，说明不论是游离形式的依克多因还是交联形式的依克多因均可发挥抗衰老作用，且依克多因浓度越高，效果越明显。根据实施例6可以看出，48h的抗衰老作用优于24h，说明交联凝胶可将交联态依克多因缓慢释放出来，发挥抗衰老作用。根据实施例7、实施例8可以看出，添加高浓度的样品试液24小时的抗衰效果优于48小时，说明游离依克多因有即时的抗衰老作用，随着游离依克多因浓度的降低和时间的延长，游离依克多因的效果逐渐减弱，复合凝胶释放的交联依克多因发挥主要抗衰老作用。本发明的抗衰老凝胶不仅具有填充作用，而且可以通过两种形态的依克多因的搭配在整个透明质酸凝胶填充周期内起到抗衰老的作用。本发明不但具有单纯交联透明质酸钠凝胶填充面部、颈部、额头的医美作用及青光眼手术粘弹剂的作用，更结合了依克多因抗炎、抗衰老等功能优势，使其在医美填充和青光眼手术、泪道阻塞手术及玻璃体切除术等手术中作为辅助治疗手段更具潜力和效果。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式不受上述实施例的局限，其它任何为背离本发明核心实质的改动、修饰等变换方式都在本发明的保护范围之内。当前第1页1 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技术特征：1.一种依克多因-透明质酸复合凝胶的制备方法，其特征是包括以下步骤：
（1）将1,4丁二醇单缩水甘油醚和依克多因在催化剂作用下进行亲核反应，得到下述式b所示的化合物b；
（2）将化合物b和环氧氯丙烷先在催化剂作用下进行开环反应，然后再在氢氧化钠作用下进行闭环反应，得到交联剂ebd；
（3）以交联剂ebd和交联剂bdde为混合交联剂，与透明质酸或其盐发生交联反应，得交联透明质酸凝胶；
（4）将交联透明质酸凝胶与依克多因溶液混合均匀，得依克多因-透明质酸复合凝胶；
、。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：步骤（1）中，所述催化剂为5-叔丁基呋喃甲酸铬、pd(oac)2/binap或alo3，优选为5-叔丁基呋喃甲酸铬；步骤（2）中，所述催化剂均为三氟化硼乙醚、incl3、sncl4、zncl2或三氟化硼三乙醇胺，优选为三氟化硼乙醚。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征是：步骤（1）中，催化剂用量为1,4丁二醇单缩水甘油醚的0.1~15wt%；步骤（2）中，催化剂用量为化合物b的0.05~10wt%。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：步骤（1）中，化合物a和依克多因的摩尔比为1:1-2；步骤（2）中，化合物b和环氧氯丙烷的摩尔比为1:1-2，氢氧化钠与环氧氯丙烷的摩尔比为1-1.3:1。
5.根据权利要求1或4所述的制备方法，其特征是：步骤（1）中，反应温度为50~120℃；步骤（2）中，开环反应的温度为40℃~80℃，闭环反应的温度为40-45℃。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：步骤（3）中，交联剂ebd与透明质酸或其盐的质量比为1:1~200，优选为1:30~100；交联剂bdde与透明质酸或其盐的质量比为1:20~200，优选为1:50~150。
7.根据权利要求1或6所述的制备方法，其特征是：步骤（3）中，交联反应在碱性环境下进行，以水为溶剂，反应的ph大于10；步骤（3）中，交联反应的温度为30~60℃，优选为40~50℃；交联时间为0.5~8h，优选为1~3h。
8.根据权利要求1、2、4或6所述的制备方法，其特征是：步骤（3）中，透明质酸盐选自透明质酸的钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、锌盐或金盐，优选为透明质酸的钠盐；所述透明质酸或其盐的分子量为100万da~300万da。
9.根据权利要求1、2、4或6所述的制备方法，其特征是：步骤（4）中，依克多因与交联透明质酸凝胶的质量比为1:2~100，优选为1:7~20。
10.按照权利要求1-9中任一项所述的依克多因-透明质酸复合凝胶的制备方法制得的依克多因-透明质酸复合凝胶。
技术总结本发明公开了一种依克多因‑透明质酸复合凝胶的制备方法及所得产品，首先通过分步法制备出交联剂EBD；然后EBD与BDDE作为混合交联剂与透明质酸或其盐发生交联反应制备交联透明质酸凝胶，再次在上述交联透明质酸凝胶中加入游离依克多因，混合得依克多因‑透明质酸复合凝胶。本发明含有游离和交联两种形态的依克多因，不仅具有填充作用，而且可以通过两种形态的依克多因的搭配在整个透明质酸凝胶填充周期内起到抗衰老和皮肤修复再生的作用，并在青光眼手术、泪道阻塞手术及玻璃体切除术等手术中作为粘弹剂辅助治疗更具潜力和效果。
技术研发人员：李敏;李超;庞萌萌;王静;刘建建;郭学平
受保护的技术使用者：华熙生物科技股份有限公司
技术研发日：2020.11.27
技术公布日：2021.03.12
