本发明属于生物材料领域，具体涉及一种用于细胞培养的超亲水涂层及制备方法。
背景技术：
现代生物医学快速进步，干细胞培养成为很多研究及应用领域中十分重要的基础性工作。一直以来，人们普遍采用聚苯乙烯材质的培养板或培养瓶作为细胞培养的工具。聚苯乙烯透光性能好，具有较好的强度和易塑性，并且没有毒性，成为一次性细胞培养皿和细胞培养板等一次性细胞培养耗材的首选材料。然而聚苯乙烯表面是疏水的，所以需要经过表面的改性处理，变成亲水后才能适用于细胞培养。
tc处理(tissueculturetreated)是聚苯乙烯培养皿的最常见表面亲水改性处理方法，通常采用的是等离子体表面处理技术。等离子体对聚苯乙烯进行改性处理形成的亲水表面达到的亲水性接触角为60°，而上述细胞的良好贴壁生长需要亲水性接触角到10度以下，因此难以满足那些生长条件苛刻的细胞贴壁生长。专利201510194152.4通过等离子体技术制备超亲水细胞生长表面。
纳米涂层技术条件温和，过程简单，可以通过涂覆量精确控制涂层厚度。涂层技术操作简单、不需要高昂的设备，但是超亲水涂层普遍存在稳定性差，透明性低，附着力低，容易受紫外、水分的影响脱落。同时也存在生物相容性、细胞毒性、细胞贴壁低等问题，因此基于纳米涂层法制备超亲水表面用于细胞培养仍是一个重大的难题。
技术实现要素：
为克服现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种用于细胞培养的超亲水涂层及制备方法，该超亲水涂层具有持久、稳定的超亲水效果，其水接触角低于10°。同时涂层附着力强，透明度高，耐紫外、水浸泡，且生物相容性好、细胞毒性低、细胞贴壁率高。
为实现上述目的，本发明提出如下技术方案：
一种用于细胞培养的超亲水涂层，该涂层为聚乙烯醇-壳聚糖互穿网络超亲水涂层，水接触角为2～8°。
具体的，所述涂层通过喷涂、浸涂或滚涂等方式涂布到细胞培养装置上。
具体的，所述涂层厚度为8～30μm。
上述聚乙烯醇-壳聚糖互穿网络超亲水涂层的制备方法包含如下步骤：
1)将壳聚糖(黏度400mpa.s)溶于酸性水溶液中，壳聚糖质量分数为1％，溶液ph＝4～6；
2)溶液中加入聚乙烯醇1788，加热至60-80℃溶解，聚乙烯醇与壳聚糖的质量比为1：4～1：2；
3)加入少量交联剂，加热至40～80℃反应1～3h。
具体的，步骤1)所述酸性水溶液包含乙酸水溶液、丙烯酸水溶液、hcl水溶液中的一种或多种；
具体的，步骤3)所述交联剂包含戊二醛、乙二醇、乙二酸中的一种或多种。
通过本方案制得的含超亲水涂层的聚苯乙烯培养皿光透过率达95％～98％；
通过本方案制得的含超亲水涂层的聚苯乙烯培养皿经过水接触角测量仪测得水接触角为2～8°；
通过本方案制得的含超亲水涂层的聚苯乙烯培养皿在纯水中浸泡7天，涂层不脱落，水接触角不衰减；
通过本方案制得的含超亲水涂层的聚苯乙烯培养皿在乙酸溶液中浸泡7天，涂层不脱落，水接触角不衰减；
通过本方案制得的含超亲水涂层的聚苯乙烯培养皿在氢氧化钠水溶液中浸泡7天，涂层不脱落，水接触角不衰减。
上述超亲水涂层经过百格测试测得附着力为0级；
上述超亲水涂层经过高温加速老化测试，加热至80°经过5000小时后涂层不脱落，水接触角不衰减；
上述超亲水涂层经过紫外老化测试，经1000小时紫外照射后涂层不脱落，水接触角不衰减；
上述超亲水涂层表面带正电，zeta电位为28.6±0.2mv～30.4±0.2mv；
上述聚乙烯醇-壳聚糖互穿网络超亲水涂层所用组分均为生物相容性较好的聚合物。
本发明还提供一种细胞培养装置，包含聚苯乙烯基层和上述用于细胞培养的超亲水涂层。
具体的，所述聚苯乙烯基层为培养皿、培养板、培养瓶中的一种。
本发明还提供一种用于细胞培养的方法，将细胞种植于上述的细胞培养装置上进行培养。
本方案中所用细胞为小鼠胚胎成纤维细胞、小鼠脂肪成体干细胞等难养细胞。
上述细胞用本方案所述含超亲水涂层的培养皿培养，贴壁率可87％～90％且细胞生长状态良好，用普通tc处理培养皿处理贴壁率仅为40％～45％。
本发明中，壳聚糖和聚乙烯醇是两种单一的组分为线性分子，形成的涂层在水溶液中极易脱落，因此本发明将这两种亲水聚合物设计为互穿网络结构，形成网状结构增强涂层的强度，同时壳聚糖和聚乙烯醇两种亲水聚合物能通过化学反应接枝，使得疏水部分与培养皿基材有很好的附着力，亲水基团羟基、氨基等在最表面形成超亲水结构，这种设计提高了涂层的附着力，使基材能在水中不脱落。表面的氨基基团使得涂层带正电，这有利于蛋白的吸附。本发明涂层在室温下即可固化，操作简便，成本较低，适合大规模工业生产。
本发明提供一种用于细胞培养的超亲水涂层及制备方法，该超亲水涂层水接触角低10°且带正电，能使难以培养的细胞良好地贴壁生长，且生物相容性好、细胞毒性低、细胞贴壁率高。同时涂层附着力强，透明度高，耐紫外、水浸泡，具有持久、稳定的超亲水效果。
附图说明
图1为实施例12中含超亲水涂层聚苯乙烯培养皿水接触角测试结果；
图2为超亲水涂层培养皿与tc处理培养皿培养细胞的贴壁率比较。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例和附图进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1配置壳聚糖溶液
将1g壳聚糖(黏度400mpa.s)溶于99g乙酸水溶液中，壳聚糖质量分数为1％，溶液ph＝4。
实施例2配置壳聚糖溶液
将1g壳聚糖(黏度400mpa.s)溶于99g丙烯酸水溶液中，壳聚糖质量分数为1％，溶液ph＝5。
实施例3配置壳聚糖溶液
将1g壳聚糖(黏度400mpa.s)溶于99g盐酸溶液中，壳聚糖质量分数为1％，溶液ph＝6。
实施例4配置壳聚糖-聚乙烯醇溶液
在实施例1溶液中加入0.25g聚乙烯醇1788，加热至60℃溶解。
实施例5配置壳聚糖-聚乙烯醇溶液
在实施例2溶液中加配置入0.4g聚乙烯醇1788，加热至70℃溶解。
实施例6配置壳聚糖-聚乙烯醇溶液
在实施例3溶液中加入0.5g聚乙烯醇1788，加热至80℃溶解。
实施例7制备聚乙烯醇-壳聚糖互穿网络超亲水涂层1
在实施例4溶液中加入0.05g戊二醛，加热至40℃反应1h，所得超亲水涂层测试zeta电位为28.6±0.2mv。
实施例8制备聚乙烯醇-壳聚糖互穿网络超亲水涂层2
在实施例5溶液中加入0.05g乙二醇，加热至60℃反应2h，所得超亲水涂层测试zeta电位为29.7mv±0.1mv。
实施例9制备聚乙烯醇-壳聚糖互穿网络超亲水涂层3
在实施例6溶液中加入0.05g乙二酸，加热至80℃反应3h，所得超亲水涂层测试zeta电位为30.4±0.2mv。
实施例10制得含超亲水涂层的培养皿
将实施例7所得超亲水涂层通过喷涂的方式涂布到培养皿上，涂层厚度为8μm。
实施例11制得含超亲水涂层的培养皿
将培养皿浸泡在实施例8所得超亲水涂层中，浸泡时间5min后取出，涂层厚度为20μm。
实施例12制得含超亲水涂层的培养皿
将实施例9所得超亲水涂层通过淋涂设备淋涂到聚苯乙烯培养皿上，涂层厚度为30μm。
对实施例10、实施例11和实施例12所得含超亲水涂层的培养皿进行透光率、附着力、未处理的水接触角，以及其他处理后的水接触角的测试。其中，其他处理为如下：
在纯水中浸泡7天，除去水分，干燥；在20％乙酸水溶液中浸泡7天，除去水分，干燥；在10％氢氧化钠水溶液中浸泡7天，除去水分，干燥；高温加速老化测试，加热至80°经过5000小时；紫外老化测试，经1000小时紫外照射。
测试结果如下表所示：
实施例13
将小鼠胚胎成纤维细胞(mef细胞)悬液以1500rpm离心5分钟收集细胞，再用30ml生长培养基洗涤两次。细胞沉淀用15ml生长培养基重悬后分别加入含超亲水涂层和tc处理的聚苯乙烯培养皿中，之后在37℃细胞培养箱中培养，24小时后更换新鲜的生长培养基。细胞长满后，先用d-pbs冲洗，倒掉后加胰酶消化，按1:5传代。将每一代细胞进行计数以及用荧光显微镜观察贴壁情况。含超亲水涂层的聚苯乙烯培养皿细胞存活率在95％以上，细胞贴壁率为90％。而tc处理的聚苯乙烯培养皿细胞存活率为80％，细胞贴壁率为40％，结果如图2所示。
实施例14
与实施例13类似，将小鼠的脂肪成体干细胞(adas细胞)分别在含超亲水涂层的聚苯乙烯培养皿和tc处理的聚苯乙烯培养皿中培养，含超亲水涂层的聚苯乙烯培养皿细胞存活率在93％以上，细胞贴壁率为87％。而tc处理的聚苯乙烯培养皿细胞存活率为78％，细胞贴壁率为45％，结果如图2所示。
1.一种用于细胞培养的超亲水涂层，其特征在于，该涂层为聚乙烯醇-壳聚糖互穿网络超亲水涂层，水接触角为2～8°。
2.根据权利要求1所述的用于细胞培养的超亲水涂层，其特征在于，所述涂层通过喷涂、浸涂或滚涂等方式涂布到细胞培养装置上。
3.根据权利要求1所述的用于细胞培养的超亲水涂层，其特征在于，所述涂层厚度为8～30μm。
4.一种权利要求1～3任一项所述用于细胞培养的超亲水涂层的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：
1)将壳聚糖溶于酸性水溶液中，壳聚糖质量分数为1％，溶液ph＝4～6；
2)溶液中加入聚乙烯醇1788，加热至60-80℃溶解，聚乙烯醇与壳聚糖的质量比为1：4～1：2；
3)加入少量交联剂，加热至40～80℃反应1～3h。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中的酸性水溶液包含乙酸水溶液、丙烯酸水溶液、hcl水溶液中的一种或多种。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)交联剂包含戊二醛、乙二醇、乙二酸中的一种或多种。
7.一种细胞培养装置，其特征在于，包含聚苯乙烯基层和权利要求1～3任一项所述用于细胞培养的超亲水涂层。
8.根据权利要求7所述的细胞培养装置，其特征在于，所述聚苯乙烯基层为培养皿、培养板、培养瓶中的一种。
9.一种用于细胞培养的方法，其特征在于，将细胞种植于权利要求8任一项所述的细胞培养装置上进行培养。
10.根据权利要求9所述的用于细胞培养的方法，其特征在于，所述细胞为小鼠胚胎成纤维细胞、小鼠脂肪成体干细胞。
技术总结