本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于检测细胞内谷胱甘肽的荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术：
谷胱甘肽(gsh)是由甘氨酸、半胱氨酸(cys)和甘氨酸形成的三肽化合物，是哺乳动物细胞中最丰富的非酶类抗氧化剂。在许多生命活动中gsh起着直接或者间接的作用包括基因表达调控、酶活性、代谢调节、免疫功能调节等。在正常的情况下，gsh的水平异常会直接导致癌变、心脏病、衰老以及其他的疾病。
荧光检测法因其灵敏度高、检测速度快、分辨率高而成为一种重要的检测方法。近年来有许多关于gsh荧光探针的报道，例如：申请号为cn201510917437.6(公开号为cn106866689a)的中国发明专利、申请号为cn201710466525.8(公开号为cn107235946a)的中国发明专利等均公开了现有的gsh荧光探针。然而，大部分现有的探针不能特异性的响应gsh的变化，由于细胞微环境复杂，关于gsh的检测大都会受到其他硫醇的影响如cys、同型半胱氨酸(hcy)等。因此，开发安全性高、特异性强的、可快速检测细胞内gsh水平的物质是目前生物医药领域研究的重点。
技术实现要素：
本发明所要解决的第一个技术问题是针对现有技术而提供一种灵敏度高、选择性好、能特异性检测细胞内gsh的荧光探针。
本发明所要解决的第二个技术问题是针对现有技术而提供一种上述荧光探针的制备方法。
本发明所要解决的第三个技术问题是针对现有技术而提供一种上述荧光探针的应用。
本发明解决上述第一个技术问题所采用的技术方案为：一种用于检测细胞内谷胱甘肽的荧光探针，其结构式如式(ⅰ)所示。
本发明解决上述第二个技术问题所采用的技术方案为：一种如上所述的荧光探针的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
第一步，7-(二乙基氨基)-4-羟基-香豆素的合成：
向含丙二酸二苯酯的甲苯溶液中加入3-(n,n-二乙基氨基)苯酚，加热回流，反应后得浅黄色固体，该浅黄色固体即为所需的7-(二乙基氨基)-4-羟基-香豆素，且该7-(二乙基氨基)-4-羟基-香豆素的结构式如式(ⅱ)所示；
第二步，4-氯-7-二乙基氨基香豆素-3-醛的合成：
在氩气保护下，室温下将dmf滴加到pocl3中并搅拌，得到红色液体；将一部分上述7-(二乙基氨基)-4-羟基-香豆素滴加到上述红色液体中，得到猩红色悬浮液；将该悬浮液在70℃下搅拌直至完全反应，加入naoh溶液沉淀，得橙黄色固体，该橙黄色固体即为4-氯-7-二乙基氨基香豆素-3-醛，且该4-氯-7-二乙基氨基香豆素-3-醛的结构式如式(ⅲ)所示；
第三步，2-二氰基亚甲基-3-氰基-4,5,5-三甲基-2,5-二氢呋喃的合成：
向3-羟基-3-甲基-2-丁酮和丙二腈的乙醇混合物中加入乙醇钠，加热回流直至tlc显示没有3-羟基-3-甲基-2-丁酮，得到灰色固体tcf，tcf的结构式如式(ⅳ)所示；
式(ⅳ)
第四步，荧光探针的合成：
向上述第二步合成的4-氯-7-二乙基氨基香豆素-3-醛的无水乙醇溶液中加入2-二氰基亚甲基-3-氰基-4,5,5-三甲基-2,5-二氢呋喃，室温下搅拌反应完，得到黑绿色产物，该黑绿色产物即为所需的荧光探针。
本发明解决第三个技术问题所采用的技术方案为：一种如上所述的荧光探针在细胞内gsh检测的应用。
进一步，所述的细胞为肿瘤细胞。
再进一步，所述荧光探针能同时检测肿瘤细胞的内源性gsh和外源性gsh含量的变化。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明中的荧光探针无毒、安全性高，对肿瘤细胞、肝细胞、巨噬细胞没有毒性，抗干扰能力强、特异性高，具有良好的组织穿透性，能较好地检测细胞内源性和外源性的gsh，并且不受cys、hcy、so2的干扰，此外，本发明中的探针也能应用于细胞内复杂环境中gsh的检测，可响应细胞内氧化应激引起的gsh的变化。可见，本发明中的荧光探针在生物及医学领域具有重要的应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例1中荧光探针合成过程示意图；
图2为本发明实施例1中荧光探针与csh反应机理示意图；
图3为本发明实施例1中荧光探针的与gsh反应的光谱图；
图4为本发明实施例1中荧光探针与csh结合的1h-nmr谱图；
图5为本发明实施例2中荧光探针对raw264.7、l-02和bel-7402细胞存活率的影响；
图6为本发明实施例3中不同浓度荧光探针对内源性gsh的响应；
图7为本发明实施例4中5μm浓度探针作用不同时间点对内源性gsh的响应；
图8为本发明实施例5中5μm浓度探针对外源加入不同浓度gsh的响应；
图9为本发明实施例6中5μm浓度探针对外源加入0.5mmgsh作用不同时间点的响应；
图10本发明实施例7中荧光探针对硫醇及so2的响应；
图11本发明实施例8中荧光探针对氧化应激的响应。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1：荧光探针的合成
本发明中的荧光探针的合成过程如图1所示，具体过程如下：
第一步，7-(二乙基氨基)-4-羟基-香豆素的合成：
向含丙二酸二苯酯(20g，78.05mmol)的甲苯(80ml)溶液中加入3-(n,n-二乙基氨基)苯酚(12.9g，78.05mmol)，加热回流7h。反应完成后，过滤，过滤所得的滤饼用己烷洗涤，真空干燥后得浅黄色固体(约9.8g，53.8％)，7-(二乙基氨基)-4-羟基-香豆素，且该7-(二乙基氨基)-4-羟基-香豆素的结构式如式(ⅱ)所示。
式(ⅱ)
第二步，4-氯-7-二乙基氨基香豆素-3-醛的合成：
在氩气保护下，室温下将新鲜蒸馏的dmf(n,n-二甲基甲酰胺)(5.6ml)滴加到pocl3(5.6ml)中并搅拌30min，得到红色液体。将一部分上述制得的7-(二乙基氨基)-4-羟基-香豆素(5.00g，21.43mmol，溶于25mldcf中)滴加到上述红色溶液中，得到猩红色悬浮液。将该悬浮液在70℃下搅拌12h直至完全反应，倒入150ml冰水中，加入naoh溶液(20％)ph调节至6，得到大量沉淀。过滤粗产物，滤饼用水洗涤，真空干燥得橙黄色固体(5.5g，91.7％)，粗产物可直接用于后续实验无需进一步纯化。上述橙黄色固体即为4-氯-7-二乙基氨基香豆素-3-醛，且该4-氯-7-二乙基氨基香豆素-3-醛的结构式如式(ⅲ)所示；
式(ⅲ)
第三步，2-二氰基亚甲基-3-氰基-4,5,5-三甲基-2,5-二氢呋喃的合成：
向3-羟基-3-甲基-2-丁酮(4.50g，44.06mmol)和丙二腈(5.96g，90.22mmol)的乙醇(20ml)混合物中加入乙醇钠(0.45g，6.61mmol)，加热回流2h，直至tlc显示没有原料3-羟基-3-甲基-2-丁酮。将反应液冷却至室温后，过滤，滤饼用冷乙醇洗涤3次后真空干燥，得到灰色固体tcf(约7.20g，83％)，即所需的2-二氰基亚甲基-3-氰基-4,5,5-三甲基-2,5-二氢呋喃。
(4)荧光探针的合成
向含4-氯-7-二乙基氨基香豆素-3-醛(0.2g，0.72mmol)的7ml无水乙醇溶液中加入2-二氰基亚甲基-3-氰基-4,5,5-三甲基-2,5-二氢呋喃(0.14g，0.72mmol)，室温下搅拌。反应完成后，过滤，滤饼用冷乙醇洗涤。将固体真空干燥，并通过柱色谱法进一步纯化，得到黑绿色产物(0.260g，78.9％)，该黑绿色产物即为所需的荧光探针，且该荧光探针的结构式如式(ⅰ)所示，上述制得的荧光探针与gsh作用机制如图2所示，光谱图如图3所示，该荧光探针与csh结合的1h-nmr谱图如图4所示。
实施例2：荧光探针对细胞毒性检测
本实施例中探究上述实施例1制备的荧光探针对巨噬细胞raw264.7(购于中国武汉典型培养物保藏中心，编号：3142c0001000000131)、肝细胞l-02(购于中国武汉典型培养物保藏中心，编号：3142c0001000000077)和肿瘤细胞bel-7402毒性(中国武汉典型培养物保藏中心，编号：3142c0001000000035)的影响。由图5所示，在荧光探针浓度(0.625-5μm)作用24h下，3种细胞存活率均在90％以上，说明本发明中的荧光探针对细胞是无毒、安全的。
实施例3：不同浓度荧光探针对内源性gsh的响应
本发明中的荧光探针发红色和蓝色两种荧光，其中红色为荧光探针的自发荧光，蓝色为荧光探针和gsh反应后的荧光。bel-7402细胞爬片生长于24孔板中，待细胞融合率达80％左右，加入不同浓度的荧光探针(0.625、1.25、2.5和5μm)作用30min。实验结束后，用荧光显微镜拍照，蓝色通道激发波长为405nm，发射波长为430～490nm；红色通道激发波长为575nm，发射波长为590～650nm。
由图6所示，其中a-d为0.625、1、2.5、5μm荧光探针分别作用30min，scalebar为50μm。由图6可知，不同浓度荧光探针作用30min后红色荧光趋于稳定，蓝色荧光逐渐增强，说明本发明中的荧光探针可用于后续细胞内源性gsh的检测。
实施例4：5μm浓度荧光探针作用不同时间点对内源性gsh的响应
本实施例利用浓度为5μm的荧光探针进行后续时间点的检测，具体过程如下：bel-7402细胞培养于24孔板中，待细胞融合率达80％左右，加入5μm浓度荧光探针分别作用30、60、90min，实验结束后荧光显微镜拍照。
由图7所示，a为对照组(未加荧光探针)，b-d为5μm浓度荧光探针分别作用30、60、90min，scalebar为50μm。由图7可知，随着荧光探针作用时间的延长，红色荧光保持不变，蓝色荧光逐渐增强，说明该荧光探针可用于不同时间点内源性gsh的检测。
实施例5：5μm浓度荧光探针对外源加入不同浓度gsh的响应
待bel-7402细胞融合率达80％左右，先加入0.25mmnem作用30min，5μm浓度荧光探针作用30min，不同浓度gsh(0.125、0.25、0.5、1和2mm)作用30min，实验结束后荧光显微镜拍照。
由图8所示，a为nem作用30min，5μm浓度荧光探针作用30min；b-f为nem作用30min，5μm浓度荧光探针作用30min，不同浓度gsh分别作用30min，scalebar为50μm。由图8可知，随着gsh浓度的升高，红色荧光保持稳定，蓝色荧光逐渐增强。由上可知，本发明中的荧光探针可以响应广泛的gsh浓度的变化。
实施例6：5μm浓度荧光探针对外源加入0.5mmgsh作用不同时间点的响应
本实施例中选用0.5mmgsh浓度进行gsh作用不同时间点的研究，具体过程如下：先加入0.25mmnem作用30min，5μm荧光探针作用30min，0.5mmgsh分别作用30、60、90min。
由图9所示，a为nem作用30min，5μm荧光探针作用30min；b-d为nem作用30min，5μm荧光探针作用30min，0.5mmgsh分别作用30、60、90min，scalebar为50μm。由图9可知，随着gsh作用时间的延长，红色荧光保持稳定，蓝色荧光逐渐增强。由上可知，本发明中的荧光探针可以检测外源性不同时间点的gsh。
实施例7：荧光探针对硫醇及so2的响应
细胞内主要的硫醇有3种：gsh、cys、hcy，其中cys为gsh合成的限速底物，因此本实施例检测了该荧光探针是否可以特异性检测细胞内gsh，此外也探究了so2是否会干扰gsh的检测。具体过程如下：bel-7402细胞爬片生长于24孔板中，待细胞存活率达80％左右，加入0.25mmnem作用30min，5μm浓度荧光探针作用30min，0.5mmgsh/cys/hcy/nahso3分别作用30min。
由图10所示，a为nem作用30min，5μm荧光探针作用30min；b为nem作用30min，5μm荧光探针作用30min，0.5mmgsh作用30min；c为nem作用30min，5μm荧光探针作用30min，0.5mmcys作用30min；d为nem作用30min，5μm荧光探针作用30min，0.5mmhcy作用30min；e为nem作用30min，5μm荧光探针作用30min，0.5mmnahso3作用30min；scalebar为50μm。由图10可知，cys、hcy、nahso3作用下红色荧光稳定，未观察到蓝色荧光的变化。而gsh作用下，荧光探针出现明显的蓝色荧光，说明荧光探针可以特异性检测细胞内的gsh。
实施例8：荧光探针对氧化应激的响应
gsh作为细胞内主要的非酶类抗氧化物质，在细胞抵抗氧化应激方面起重要的作用。本实施例利用不同浓度的h2o2作用来探究荧光探针是否可以检测到h2o2引起的细胞内gsh的变化。bel-7402细胞爬片生长于24孔板中，待细胞存活率达80％左右，加入h2o2(0.25、1、2.5μm)作用60min，pbs洗1次，加入5μm荧光探针作用30min，实验结束后荧光显微镜拍照。
由图11所示，a为5μm荧光探针作用30min，b-d为0.25、1、2.5mmh2o2作用1h，5μm荧光探针作用30min；scalebar为50μm。由图11可知，与对照组相比，0.25和1mmh2o2作用下，红光荧光趋于稳定，蓝色荧光在h2o2作用下增强；在2.5mmh2o2作用下，红色荧光和蓝色荧光都减弱，原因可能是低浓度h2o2作用调动了细胞内源性的抗氧化机制来共同抵抗氧化应激，因此gsh水平出现先升高的趋势；而高浓度h2o2(2.5mm)作用下细胞难以抵抗氧化应激引起的损伤而趋于程序性死亡，因此荧光减弱。由上可见，本荧光探针可以应用于细胞氧化应激的检测。
1.一种用于检测细胞内谷胱甘肽的荧光探针，其结构式如式(ⅰ)所示。
2.一种如权利要求1所述的荧光探针的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
第一步，7-(二乙基氨基)-4-羟基-香豆素的合成：
向含丙二酸二苯酯的甲苯溶液中加入3-(n,n-二乙基氨基)苯酚，加热回流，反应后得浅黄色固体，该浅黄色固体即为所需的7-(二乙基氨基)-4-羟基-香豆素，且该7-(二乙基氨基)-4-羟基-香豆素的结构式如式(ⅱ)所示；
第二步，4-氯-7-二乙基氨基香豆素-3-醛的合成：
在氩气保护下，室温下将dmf滴加到pocl3中并搅拌，得到红色液体；将一部分上述7-(二乙基氨基)-4-羟基-香豆素滴加到上述红色液体中，得到猩红色悬浮液；将该悬浮液在70℃下搅拌直至完全反应，加入naoh溶液沉淀，得橙黄色固体，该橙黄色固体即为4-氯-7-二乙基氨基香豆素-3-醛，且该4-氯-7-二乙基氨基香豆素-3-醛的结构式如式(ⅲ)所示；
第三步，2-二氰基亚甲基-3-氰基-4,5,5-三甲基-2,5-二氢呋喃的合成：
向3-羟基-3-甲基-2-丁酮和丙二腈的乙醇混合物中加入乙醇钠，加热回流直至tlc显示没有3-羟基-3-甲基-2-丁酮，得到灰色固体tcf，tcf的结构式如式(ⅳ)所示；
式(ⅳ)
第四步，荧光探针的合成：
向上述第二步合成的4-氯-7-二乙基氨基香豆素-3-醛的无水乙醇溶液中加入2-二氰基亚甲基-3-氰基-4,5,5-三甲基-2,5-二氢呋喃，室温下搅拌反应完，得到黑绿色产物，该黑绿色产物即为所需的荧光探针。
3.一种如权利要求1所述的荧光探针在细胞内gsh检测的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的细胞为肿瘤细胞。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述荧光探针能同时检测肿瘤细胞的内源性gsh和外源性gsh及其含量的变化。
技术总结