本发明涉及生物医学检测中近红外二区活体成像领域，具体涉及一种基于x射线激发的近红外二区发光长余辉纳米探针、制备方法及其在活体成像分析上的应用。
背景技术：
恶性肿瘤已严重威胁着人们的健康与生存，近年来我国癌症的病发率有显著的增长。介入治疗是利用现代高科技手段进行的一种微创性治疗，在肿瘤手术治疗中如何精准地移除病变癌组织和减少对患者健康细胞的切除是关键难题。因此，发展临床上可辅助精准治疗的技术对于减少患者肿瘤复发并提高其五年生存率具有重要的意义。长余辉发光探针在生物分析应用中可有效地克服生物自荧光、激发光的活体穿透性不足、常规荧光探针需要持续激发光照射等问题，在生物传感、光动力治疗、活体成像分析等应用的研究引起了广泛的兴趣。长余辉发光探针在经过一次激发后，可保持几分钟甚至数个小时的持续发光，非常适合用于长时间连续的活体成像，特别是在临床上的手术导航。然而，传统高温固相合成的长余辉发光纳米探针存在制备难、发光效率低、分散性差、尺寸形貌不易调控等不足，并且目前缺乏对深层活体组织具有较好穿透能力的近红外二区长余辉发光探针。因此，发展新的长余辉发光探针制备方法及发光机制具有重要的科学意义。
x射线发光生物分析是一种高灵敏、无自荧光背景、活体穿透深度大的发光生物分析新技术，近年来在生物医学领域研究中得到了迅速地发展。x射线光子在生物活体组织中具有更好的穿透性能力，适当的x射线剂量在医学应用中的安全性已被临床广泛地接受。发展一类可用x射线激发并在nir-ii区发光的纳米探针，并用于构建高分辨、高灵敏的深层活体组织成像分析技术具有重要的科学意义。
稀土氟化物纳米晶体是一类具有声子能小和发光效率高的发光纳米材料，在上转换发光领域得到了大量的应用。考虑到稀土离子具有重原子效应的强x射线吸收能力、稀土氟化物的形貌尺寸可控性、表面易于功能化修饰、纳米颗粒稳定性高和毒性小等特点，同时采用表面钝化技术，有望得到亮度较强的发光纳米探针。利用x射线作为激发光源可解决激发光穿透性不足、激光热效应、生物自荧光背景等问题，通过调控发光波长在近红外二区窗口，可用于发展高分辨的深层活体成像分析。综上所述，发展此类基于x射线近红外二区长余辉发光纳米探针的活体成像分析新方法，从而实现对肿瘤和边缘血管的高分辨、高灵敏、高信噪比、无创的深层组织成像分析具有重要的临床应用前景。
技术实现要素：
本发明目的在于提供基于x射线激发的近红外二区发光长余辉纳米探针、制备方法及其在活体成像分析上的应用。通过将具有声子能小和发光效率高稀土氟化物纳米晶体与几乎具有无限组织穿透深度能力的x射线相结合，调控稀土离子掺杂实现近红外二区长余辉发光纳米探针的构建，并用于深层活体组织成像。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于x射线激发的近红外二区发光长余辉纳米探针nalu0.8f4:gd0.2-x/lnx@naref4的制备方法，包括以下步骤：
步骤s1内核的制备：
步骤s11将稀土醋酸盐投入到存有油酸和十八烯的混合相溶液中，混合物抽真空加热并反应一定时间；
步骤s12冷却至室温后，将氢氧化钠和氟化铵的甲醇溶液加入步骤s11反应液中，升温用于成核反应；
步骤s13将混合溶液继续加热至100°c，排除多余的甲醇，随后进行脱气处理10min；
步骤s14在n2保护下升温到一定温度，反应得到近红外二区发光长余辉纳米探针（nalu0.8f4:gd0.2-x/lnx）；
步骤s15用乙醇和环己烷进行洗涤离心后，最终纳米产物分散在环己烷溶液中，得到内核溶液；
步骤s2核-壳结构的纳米粒子的制备：
步骤s21将醋酸镥或醋酸钆或醋酸钇加入到油酸和十八烯混合相溶液中，混合物抽真空加热并反应一定时间；
步骤s22将步骤s1中制备的内核溶液全部加入到步骤s21制得的混合液中，加热至80°c反应30min，除去体系中的环己烷；
步骤s23将甲醇溶解的氢氧化钠和氟化铵混合液加入到步骤s22所得混合液中，升温成核一定时间；
步骤s24升温至80°c除低沸点物质，并抽真空；
步骤s25将温度升高至一定温度，反应1小时得到核壳结构的近红外二区发光长余辉纳米探针nalu0.8f4:gd0.2-x/lnx@naref4；
ln选自nd3 ,ho3 ,er3 ,tm3 ,或yb3 。re选自lu3 ,gd3 ,或y3 ；
步骤s26用乙醇、环己烷混合液多次洗涤后分散在环己烷溶液中。
其中，步骤s1所述的稀土醋酸盐由lu(ch3coo)3·4h2o,gd(ch3coo)3·4h2o和ln(ch3coo)3·4h2o按摩尔比80:(20-x):x混合而成，所述的x为0.05-0.20；ln，选自er3 ,tm3 ,ho3 ,yb3 ,或nd3 ,可得到900-1600nm近红外二区可调荧光发射，具体可选为：nalu0.8f4:gd0.195er0.005,nalu0.8f4:gd0.19er0.01,nalu0.8f4:gd0.18er0.02,nalu0.8f4:gd0.15er0.05,nalu0.8f4:gd0.1er0.1,或nalu0.8f4:gd0.05er0.15。
步骤s11真空加热温度130-160°c，时间为15~30min；
其中，步骤s12成核温度为40~60°c,时间为15~30min；
其中，步骤s14所述温度为280~310°c,时间为30~90min;
其中，步骤s11油酸和十八烯的体积比例为1：(1~10)，步骤s12中氢氧化钠和氟化铵的摩尔比例为1：(1~2)，甲醇溶解的氢氧化钠和氟化铵混合液与步骤s11所得混合液的体积比为(1~10)：1，稀土醋酸盐的用量为0.05~1mmol；
其中，步骤s21中核壳制备中所述的稀土醋酸盐为y(ch3coo)3或gd(ch3coo)3或lu(ch3coo)3，稀土醋酸盐的用量为0.1~1mmol；步骤s21真空加热温度130-160°c，时间为15~30min；
其中，步骤s22中氢氧化钠和氟化铵的摩尔比例为1：(1~2)，油酸和十八烯的体积比例为1：(1~10)，步骤s23甲醇溶解的氢氧化钠和氟化铵混合液与步骤s22所得混合液的体积比为(1~10)：1。
其中，步骤s23成核温度为40~60°c,时间为15~30min；
其中，步骤s25所述反应温度为280~310°c,时间为30~90min。
其中，获得的镧系近红外二区长余辉纳米粒子，其尺寸可调为30~150nm，晶相为(100)六方晶相。其中，核心颗粒稀土掺杂离子ln3 可选er3 ,tm3 ,ho3 ,yb3 ,和nd3 中的一种或多种。其包覆壳层结构中离子掺杂re3 可选y3 ,gd3 和lu3 。所掺杂的稀土离子掺杂量为0.1~15%。
一种基于x射线激发的近红外二区发光长余辉纳米探针在活体成像分析上的应用，包括以下步骤：
1）近红外二区发射可调谐的纳米颗粒：用x射线激发该长余辉纳米探针发射近红外二区荧光，通过改变稀土离子掺杂元素的种类及含量和调整壳层包覆类型，可获得900-1600nm发射可调的近红外二区荧光及长余晖发光；
2）近红外二区长余辉活体成像分析技术构建：对合成的长余辉纳米探针进行生物相容性的表面修饰，可作为一种具有较高组织穿透深度的生物相容性探针用于小鼠活体组织成像分析。
步骤2）中将所述长余辉纳米颗粒进行生物相容性的表面修饰，主要利用生物相容性分子聚（马来酸酐）-alt-1-十八碳烯和聚乙二醇氨基进行纳米颗粒表面修饰，并通过尾部静脉注射或足部注射，进行基于x射线激发的近红外二区活体组织荧光成像分析。
本发明实现近红外二区发光长余辉纳米探针的活体成像机制为：制备的氟化物稀土纳米颗粒具有较高的x射线吸收性能，在x射线照射下，主晶格原子的内壳电子被x射线光子从晶格原子中光激发产生高能电子，并产生电子-空穴对，同时，通过x射线到原子的动量和能量传递，高能x射线光子与晶体中小氟原子的弹性碰撞产生电子阱。这些产生的热载流子经过热化并产生低能量的电子被电子阱储存。在关闭x射线激发源后，捕获的电子从陷阱中缓慢释放出来，与发光的镧系催化剂上的空穴重新结合，导致在nir-ii波长区域产生持久的余辉发射。由于x射线具有几乎无线穿透深度的能力，因此可将次探针用于深层活体组织成像分析。
本发明的显著优点在于：
（1）本发明发展的一系类近红外二区镧系稀土长余辉纳米粒子具有较强的x射线发光，形貌和尺寸可控；
（2）近红外二区长余辉的应用能有效的减少背景信噪，可实现高分辨、高灵敏的深层活体组织成像分析。
附图说明
图1x射线激发的近红外二区镧系稀土荧光纳米粒子电镜图；
图2x射线激发的近红外二区长余辉纳米粒子x射线粉末衍射图；
图3x射线激发的近红外二区长余辉发光图和余晖表征；
图4可调谐波长的近红外二区荧光发射和余晖表征；
图5长余辉纳米颗粒表面修饰和生物相容性表征；
图6x射线激发的近红外二区长余辉活体成像分析。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
实施例1
镧系长余辉荧光探针nalu0.8f4:gd0.15/er0.5@naluf4的合成：
步骤一：首先将0.4mmollu(ch3co2)3、0.075mmolgd(ch3co2)3、0.025mmoler(ch3co2)3的稀土盐混合，加到含有5ml油酸（oa）和7.5ml十八烯（ode）的50ml二颈烧瓶中。混合液抽真空加热到150°c保持30min。冷却至室温后，将含有0.05gnaoh和0.075gnh4f的甲醇溶液加入反应液中，升温至50°c继续反应30min。将混合溶液继续加热至100°c，对溶液进行脱气处理10min，排除多余的甲醇后。再充n2保护下进一步升温到300°c反应60min。在搅拌冷却到室温后，用乙醇和环己烷多次洗涤离心后，得到最终核心纳米产物naluf4:gd/er分散在4ml环己烷中。
步骤二：将0.4mmol的lu(ch3co2)3、5mloa和7.5mlode混合加入50ml烧瓶中均匀搅拌，抽真空加热至150°c反应30min。冷却至室温后，将合成分散在4ml环己烷中的naluf4:gd/er(15/5mol%)迅速加入反应烧瓶，升温至80°c并在这个温度下持续30min，以除去环己烷。随后降温至50°c，将含有0.05gnaoh和0.075gnh4f的10ml甲醇溶液加入反应液中，此温度下保持30min，随后是升温至80°c除低沸点物质，并抽真空；将温度升高300°c保持此温度1h，反应得到核壳结构的近红外二区发光长余辉纳米探针；最后，nalu0.8f4:gd0.15/er0.5@naluf4核壳纳米颗粒经环己烷和乙醇多次离心冲洗，分散在4ml环己烷。
图1为核心结构x射线荧光纳米粒子的透射电子显微镜（tem），图中标尺为200nm，从图1中可以看出明显的球型结构，纳米粒子分布均匀、尺寸可调。图2表明该x射线荧光纳米粒子具有良好的结晶性，其衍射峰的位置与naluf4的pdf标准卡片（jcpds：27-0726）一致，为纯的六方相结构，无杂相，充分说明了长余辉纳米颗粒的成功制备。图3表明所制备的x射线激发的近红外二区长余辉荧光探针nalu0.8f4:gd0.15/er0.5@naluf4具有优良的x射线响应荧光和超长的余辉发光性能。
实施例2
x射线激发近红外二区发射可调谐的纳米颗粒的制备。
镧系长余辉荧光探针nalu0.8f4:gd0.19/ln0.01@naluf4的合成：
步骤一：首先将0.4mmollu(ch3co2)3、0.095mmolgd(ch3co2)3、0.005mmolln(ch3co2)3的稀土盐混合（ln可选nd3 ,ho3 ,er3 ,tm3 ,或yb3 ），加到含有5mloa和7.5mlode的50ml二颈烧瓶中。混合液加热到150°c保持30min。冷却至室温后，将含有0.05gnaoh和0.075gnh4f的甲醇溶液加入反应液中，升温至50°c继续反应30min。将混合溶液继续加热至100°c，对溶液进行脱气处理10min，排除多余的甲醇后。再充n2保护下进一步升温到300°c反应60min。在搅拌冷却到室温后，用乙醇和环己烷多次洗涤离心后，得到最终核心纳米产物分散在4ml环己烷中。
步骤二：将0.4mmol的lu(ch3co2)3、5mloa和7.5mlode混合加入50ml烧瓶中均匀搅拌，加热至150°c反应30min。冷却至室温后，将合成分散在4ml环己烷中的naluf4:gd/er(15/5mol%)迅速加入反应烧瓶，升温至80oc并在这个温度下持续30min。随后，将含有0.05gnaoh和0.075gnh4f的甲醇溶液加入反应液中，此温度下保持30min，随后是升温至80°c除低沸点物质，并抽真空；将温度升高300°c保持此温度1h，反应得到核壳结构的近红外二区发光长余辉纳米探针；最后，nalu0.8f4:gd0.15/er0.5@naluf4核壳纳米颗粒经环己烷和乙醇多次离心冲洗，分散在4ml环己烷。
图4所示：在278μgys−1、50kv的x射线激发下，掺杂不同稀土元素的长余辉的纳米实现近红外二区辐射发光发光可调谐，并展示了一系类近红外二区长余晖发光。
实施例3
近红外二区长余辉活体成像分析技术构建。
步骤一：首先取分散在环己烷中的nalu0.8f4:gd0.15/er0.5@naluf4长余辉纳米颗粒溶液1ml（约20mg/ml）加入到5ml含有80mg聚（马来酸酐-alt-1-十八烯）（pmh）的氯仿溶液中，搅拌6h，随后氮气吹干氯仿溶液。将溶解于6ml水溶液中的4-二甲氨基吡啶dmap(80mg)加入上述烧瓶中，超声检测至nalu0.8f4:gd0.15/er0.5@naluf4长余辉纳米颗粒完全分散。上述溶液14000rpm离心1小时，用去离子水洗涤2次，去除多余的pmh和dmap。将前体重悬于3ml的4-吗啉乙烷磺酸(mes)溶液(10mm,ph=8.5)中。将聚乙二醇氨基（mpeg-nh2）5mg(5kda)和八臂聚乙二醇氨基（8arm-peg-nh2）1mg(40kda)加入到2ml的mes溶液中，再加入溶入mes溶液的1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)8mg，摇动3h。含有修饰后的长余辉纳米颗粒的上清液经离心过滤器(100kda)洗涤两次，以去除多余的edc、mpeg-nh2和8arm-peg-nh2。将带聚合物网络的最终反应物分散在水溶液中，4℃冷冻保存。
进行活体荧光成像时，通过小鼠足部注射一定剂量的近红外二区发射长余辉纳米探针，并进行5分钟的激发，并通过小动物成像系统收集相关成像信号。
图5为长余辉纳米颗粒表面修饰，可见进行修饰后的纳米颗粒具有较高的稳定性，和较低的细胞毒性。其中pmh为聚（马来酸酐-alt-1-十八烯）,cln为聚乙二醇氨基和八臂聚乙二醇氨基的交联产物。
图6为利用x射线激发的近红外二区长余辉纳米探针进行深层组织活体成像。可见此类纳米探针具有较高的组织穿透深度，近红外二区长余辉成像时间最高可达90分钟，同时具有较高的信噪比。
1.一种基于x射线激发的近红外二区发光长余辉纳米探针的制备方法，其特征在于：
步骤s1内核的制备：
步骤s11将稀土醋酸盐投入到存有油酸和十八烯的混合相溶液中，混合物抽真空加热并反应一定时间；
步骤s12冷却至室温后，将氢氧化钠和氟化铵的甲醇溶液加入步骤s11反应液中，升温用于成核反应；
步骤s13将混合溶液继续加热至100°c，排除多余的甲醇，随后进行脱气处理10min；
步骤s14在n2保护下升温到一定温度，反应得到近红外二区发光长余辉纳米探针nalu0.8f4:gd0.2-x/lnx；
步骤s15用乙醇和环己烷进行洗涤离心后，最终纳米产物分散在环己烷溶液中，得到内核溶液；
步骤s2核-壳结构的纳米粒子的制备：
步骤s21将稀醋酸盐加入到油酸和十八烯混合相溶液中，混合物抽真空加热并反应一定时间；
步骤s22将步骤s1中制备的内核溶液全部加入到步骤s21制得的混合液中，加热至80°c反应30min，除去体系中的环己烷；
步骤s23将甲醇溶解的氢氧化钠和氟化铵混合液加入到步骤s22所得混合液中，升温成核一定时间；
步骤s24升温至80°c除低沸点物质，并抽真空；
步骤s25将温度升高至一定温度，反应一定时间得到核壳结构的近红外二区发光长余辉纳米探针nalu0.8f4:gd0.2-x/lnx@naref4；
步骤s26用乙醇、环己烷混合液多次洗涤后分散在环己烷溶液中。
2.根据权利要求1所述的一种基于x射线激发的近红外二区发光长余辉纳米探针的制备方法，其特征在于：其中，步骤s11所述的稀土醋酸盐由lu(ch3coo)3·4h2o,gd(ch3coo)3·4h2o和ln(ch3coo)3·4h2o按摩尔比80:(20-x):x混合而成，所述的x为0.05-0.20；ln，选自er3 ,tm3 ,ho3 ,yb3 ,或nd3 。
3.根据权利要求1所述的一种基于x射线激发的近红外二区发光长余辉纳米探针的制备方法，其特征在于：步骤s11真空加热温度130-160°c，时间为15~30min。
4.根据权利要求1所述的一种基于x射线激发的近红外二区发光长余辉纳米探针的制备方法，其特征在于：步骤s12成核温度为40~60°c,时间为15~30min。
5.根据权利要求1所述的一种基于x射线激发的近红外二区发光长余辉纳米探针的制备方法，其特征在于：步骤s14所述温度为280~310°c,时间为30~90min。
6.根据权利要求1所述的一种基于x射线激发的近红外二区发光长余辉纳米探针的制备方法，其特征在于：步骤s11油酸和十八烯的体积比例为1：(1~10)，步骤s12中氢氧化钠和氟化铵的摩尔比例为1：(1~2)，甲醇溶解的氢氧化钠和氟化铵混合液与步骤s11所得混合液的体积比为(1~10)：1，稀土醋酸盐的用量为0.05~1mmol。
7.根据权利要求1所述的一种基于x射线激发的近红外二区发光长余辉纳米探针的制备方法，其特征在于：步骤s21中核壳制备中所述的稀土醋酸盐为y(ch3coo)3或gd(ch3coo)3或lu(ch3coo)3，稀土醋酸盐的用量为0.1~1mmol；步骤s21真空加热温度130-160°c，时间为15~30min。
8.根据权利要求1所述的一种基于x射线激发的近红外二区发光长余辉纳米探针的制备方法，其特征在于：步骤s22中氢氧化钠和氟化铵的摩尔比例为1：(1~2)，油酸和十八烯的体积比例为1：(1~10)，步骤s23甲醇溶解的氢氧化钠和氟化铵混合液与步骤s22所得混合液的体积比为(1~10)：1；步骤s23成核温度为40~60°c,时间为15~30min。
9.根据权利要求1所述的一种基于x射线激发的近红外二区发光长余辉纳米探针的制备方法，其特征在于：步骤s25所述反应温度为280~310°c,时间为30~90min；所述的近红外二区发光长余辉纳米探针nalu0.8f4:gd0.2-x/lnx@naref4中的ln选自nd3 ,ho3 ,er3 ,tm3 ,或yb3 ；re选自lu3 ,gd3 ,或y3 。
10.一种如权利要求1-9任一项方法所述制备的基于x射线激发的近红外二区发光长余辉纳米探针在活体成像分析上的应用。
技术总结