本发明属于生物技术领域，涉及一种基于微流控技术实现高活力精子筛选的芯片。
背景技术：
世界范围内不孕不育的发病率的增加，大大推动了辅助生殖技术的发展，但辅助生殖技术过程中许多操作均可能造成精子的损伤，最终导致胚胎不发育或流产，这也是导致试管婴儿技术成功率难以超过50％的重要原因之一，这些有损伤的操作包括：精子的离心操作、密度梯度离心操作和分离液中某些成分的影响等，而要减少这些操作的影响，对高活力精子的筛选应尽可能避免离心操作。因此，需要研究一种操作简易、样品损伤小的精子筛选平台。
技术实现要素：
本发明提出一种基于微流控技术实现高活力精子筛选的芯片，解决现有辅助生殖技术过程中对精子体外离心、洗涤等各种操作所造成的潜在不利影响，其利用精子趋化性和沿界面泳动特性，能有效筛选高活力精子，可获得辅助生殖技术所需的高活力精子，可以大大提高体外受精的成功率，适用范围广，人类生殖和动物育种中均可使用此装置。
本发明解决上述问题的技术方案是：一种基于微流控技术实现高活力精子筛选的芯片，其特殊之处在于：
包括基底和载片，所述基底用于支撑载片；
所述载片上设有装载池，装载池包括进样口，装载池的外围依次设有分级池和收集池；所述装载池、分级池和收集池依次连通；
所述载片上还设有取样口，所述取样口与收集池连通。
进一步地，上述分级池为环形池，所述环形池环绕装载池。
进一步地，上述分级池包括第一分级池、第二分级池和第三分级池，第一分级池、第二分级池和第三分级池从内到内同心设置。
进一步地，上述第一分级池、第二分级池和第三分级池内部的高度不同。
进一步地，上述第一分级池、第二分级池和第三分级池的高度依次降低。
进一步地，上述第一分级池的高度约50um宽度约5000um，第二分级池的高度约20um宽度约2500um，第三分级池的高度约5um宽度约2500um。
进一步地，上述分级池和收集池内均匀分布有挡流柱，直径约为100um。挡流柱用于防止塌陷(防止芯片内部坍塌)和减少液体扰动对精子运动的影响。
进一步地，上述取样口的数量为四个，在收集池外围圆周均布。
进一步地，上述载片的材料为具有良好生物相容性的聚二甲基硅氧烷(pdms)，也可以采用其他微流控芯片材料，例如pc、pmma、纯玻璃等材料。
进一步地，上述基底采用玻璃材质。
本发明的优点：
1)本发明将芯片设计为同心的环形池结构，以装载池、三层不同高度的分级池、收集池为基本结构，利用分级筛选实现高活力精子的筛选，减少离心对精子的损伤，快速地完成精子筛选。
2)本发明在每个池对应的位置设计了小圆形挡流柱，防止坍塌的同时减少液体扰动对精子运动的影响。
3)本发明芯片以第三分级池作为精子特征观察评价区域，在显微镜的辅助下能实时观察精子运动，为实际使用提供了更多精子特征评价的可能性。
4)本发明使用时不引入其他粘性物质，利于后期分离，筛选出的精子可直接进行体外受精(ivf)或卵细胞质内单精子注射(icsi)。
附图说明
图1是基于微流控技术实现高活力精子筛选的芯片的结构图；
图2是本发明芯片纵切面图；
图3是本发明的使用流程图；
图4是本发明在显微镜下实时观察精子运动和测速的截面示意图；
图5是利用本发明进行实验后的结果图；
图6是图1中的局部放大图。
其中：1、基底，2、载片，3、装载池，4、进样口，5、收集池，6、取样口，7、第一分级池，8、第二分级池，9、第三分级池，10、挡流柱。
具体实施方式
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。
微流控芯片技术(microfluidics)指的是把生物、化学和医学分析过程等领域中所涉及的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成或基本集成到一块几平方厘米(甚至更小)的芯片上，由微通道形成网络，以可控流体贯穿整个系统，用以取代常规生物或化学实验室的各种功能的一种技术。它的基本特征和最大优势是多种单元技术在微小平台上的灵活组合和规模集成。
针对精子筛选传统方法中的不足，本发明结合新一代高通量微流控技术的应用，设计一种筛选高活力精子芯片，实现在正常生长的条件下对精子进行无损伤的筛选及对其收集，有利于获得辅助生殖技术所需的高活力精子，以大大提高体外受精的成功率，且适用范围广，不仅适用于人类生殖(如各医疗机构的生殖中心)，而且适用于动物育种。在辅助生殖技术上有很大的应用前景。
一种基于微流控技术实现高活力精子筛选的芯片，包括基底1和载片2，所述基底1用于支撑载片2；所述载片2上设有装载池3，装载池3包括进样口4，装载池3的外围依次设有分级池和收集池5；所述装载池3、分级池和收集池5依次连通；所述载片2上还设有取样口6，所述取样口6与收集池5连通。所述分级池为环形池，环形池以装载池3为中心进行环绕。
作为本申请的一个优选实施例，所述分级池分为三级，包括第一分级池7、第二分级池8和第三分级池9，第一分级池7、第二分级池8和第三分级池9从内到外同心设置。
作为本申请的一个优选实施例，所述第一分级池7、第二分级池8和第三分级池9内部的高度不同。且所述第一分级池7、第二分级池8和第三分级池9内的高度依次降低。
作为本申请的一个优选实施例，所述第一分级池7内部的高度约50um宽度约5000um，第二分级池8内部的高度约20um，宽度约2500um，第三分级池9内部的高度约5um宽度约2500um。
参见图6，作为本申请的一个优选实施例，所述每个环形池内均匀设有挡流柱10，挡流柱分散着，密度不是固定的是可调节的，直径约为100um，防止芯片塌陷和减少液体扰动对精子运动的影响。
作为本申请的一个优选实施例，所述取样口6的数量为多个，多个取样口6在收集池5外围圆周均布。
作为本申请的一个优选实施例，所述载片2的材料为具有良好生物相容性的聚二甲基硅氧烷(pdms)，或者采用pc、pmma或玻璃材料等材料。所述基底1采用玻璃材质。
本发明一种基于微流控技术实现高活力精子筛选的芯片，利用分级池的高度递减和通道宽度来对精子进行分级筛选，在温度适宜的情况下，将精子样品通入中间进样口4，进入装载池3。由于精子对储有诱导剂的最外层收集池5有趋向性，精子将游动起来依次通过高度依次递减的第一分级池7、第二分级池8和第三分级池9，最终在最外层的收集池5中达到收集。实现了高活力精子的筛选又避免了对精子的损伤。同时，因为pdms的透明性以及只允许单层精子通过的第三分级池9的设计，结合显微镜的使用后可提供一个精子特征评价区域，使得更多精子活力特征(例如运动速度，运动方向等)得到实时的评价，为下一步体外受精(ivf)或卵细胞质内单精子注射(icsi)提供参考。有利于其在辅助生殖技术中的应用。
实施例
参见图1和图2，一种基于微流控技术实现高活力精子筛选的芯片，包括基底1以及设置在基底1上的载片2。载片2上同心设置了多层环形池结构。芯片最内层的装载池3和最外层的收集池5高度都约为50um，加样前先通入液体充满整个芯片内部结构避免压力差，且两个池宽度比其他池的宽度宽，适应于精子的进样装载和收集。芯片有三个环形的分级池：第一分级池7内部的高度约50um宽度约5000um，第二分级池8内部的高度约20um，宽度约2500um，第三分级池9内部的高度约5um宽度约2500um。四个取样口6在收集池5外围圆周均布。
由于各个分级池的高度和宽度不同，起到不同的分级筛选作用。第一分级池7进行粗筛，第二分级池8进行细筛，第三分级池9进行单层精子筛选。
由于精子趋化性和沿界面泳动特性，精子由进样口4加入最里层装载池3后，会向最外层装有诱导剂的收集池5运动。经由第一分级池7的初筛后，活力较低的精子留在装载池中，活力较高的精子游入第二分级池8，更高活力的精子能通过第二分级池8，进入和收集池连通的第三分级池9通道。第三分级池9通道设计高度仅能使单层精子通过。最终高活力的精子经由第三分级池9到达收集池中。
在每个池对应的位置设计了小圆形挡流柱10，直径约为100um。目的是为了防止塌陷和减少液体扰动对精子运动的影响。在出样口可将筛选后的含有高活力精子的样品吸取出。
本发明以装载池、三层不同高度的分级池、收集池为基本结构，利用分级筛选将高活力精子筛选收集于收集池中，避免过多操作对精子带来损伤。用于制作芯片的材料是具有良好生物相容性的聚二甲基硅氧烷(pdms)，芯片通道结构为微米级别，具备精子游动条件。同时，芯片的透明特性能满足显微镜下观测的条件，为后期其他精子特性评价提供了可能性。
本发明在每个环形池对应的位置设计了小圆形挡流柱，大大减少了实际使用中，液体对筛选过程的干扰，提高准确率；由于pdms的透明性和只允许单层精子通过的通道设计，提供了一个精子特征评价区域，使得更多精子活力特征可得到实时的观察评价，满足实际操作的需求。因为不引入琼脂或凝胶等物质，筛选出的精子可直接进行体外受精(ivf)或卵细胞质内单精子注射(icsi)。
本发明的使用实施例：
参见图3，对本发明的基于微流控技术实现高活力精子筛选的芯片抽真空，是营养液充满载片中的内部结构通道，然后在四个取样口6加入诱导剂，在装载池3的进样口4加入1.5ml精子样品，室温静置，并在显微镜下实时观察，1小时后收集取样口6内的样品。
参见图4，在筛选过程中结合显微镜在第三分级池9区域进行精子特征(包括精子形态和运动等)观察评价。芯片设计满足明场/相差落射光照射成像需求，落射光透过微流控芯片后进入物镜，实现照明成像。在液体环境中，利用10倍物镜的相差显微镜拍摄分辨率为0.65μm,2048×2048，时长为60s，帧率为10fps的视频。通过计算机程序，自动化追踪各个精子的运动轨迹，通过计算得出精子的游动速度，统计分析得到精子的速度分布图，参见图5，可以得出，经过筛选后的高速精子占比提高，平均速度也增大。该芯片对精子活力筛选有明显作用。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，本领域的技术人员其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行调节，或者对其中部分技术特征进行等同替换。所以，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
1.一种基于微流控技术实现高活力精子筛选的芯片，其特征在于：
包括基底(1)和载片(2)，所述基底(1)用于支撑载片(2)；
所述载片(2)上设有装载池(3)，装载池(3)包括进样口(4)，装载池(3)的外围依次设有分级池和收集池(5)；所述装载池(3)、分级池和收集池(5)依次连通；
所述载片(2)上还设有取样口(6)，所述取样口(6)与收集池(5)连通。
2.根据权利要求1所述的一种基于微流控技术实现高活力精子筛选的芯片，其特征在于：
所述分级池为环形池，所述环形池环绕装载池(3)。
3.根据权利要求2所述的一种基于微流控技术实现高活力精子筛选的芯片，其特征在于：
所述分级池包括第一分级池(7)、第二分级池(8)和第三分级池(9)，第一分级池(7)、第二分级池(8)和第三分级池(9)从内到外同心设置。
4.根据权利要求3所述的一种基于微流控技术实现高活力精子筛选的芯片，其特征在于：
所述第一分级池(7)、第二分级池(8)和第三分级池(9)内部的高度不同。
5.根据权利要求4所述的一种基于微流控技术实现高活力精子筛选的芯片，其特征在于：
所述第一分级池(7)、第二分级池(8)和第三分级池(9)内的高度依次降低。
6.根据权利要求5所述的一种基于微流控技术实现高活力精子筛选的芯片，其特征在于：
所述第一分级池(7)内部的高度约50um宽度约5000um，第二分级池(8)内部的高度约20um，宽度约2500um，第三分级池(9)内部的高度约5um宽度约2500um。
7.根据权利要求1-6任一所述的一种基于微流控技术实现高活力精子筛选的芯片，其特征在于：
所述分级池和收集池(5)内均匀分布有挡流柱(10)，挡流柱(10)的直径为100um。
8.根据权利要求7所述的一种基于微流控技术实现高活力精子筛选的芯片，其特征在于：
所述取样口(6)的数量为多个，多个取样口(6)在收集池(5)外围圆周均布。
9.根据权利要求8所述的一种基于微流控技术实现高活力精子筛选的芯片，其特征在于：
所述载片(2)的材料为聚二甲基硅氧烷、pc、pmma或玻璃材料。
10.根据权利要求9所述的一种基于微流控技术实现高活力精子筛选的芯片，其特征在于：
所述基底(1)采用玻璃材质。
技术总结