本发明涉及一种热凝胶固定化壳聚糖酶填充床反应器及其应用，属于生物工程领域。
背景技术：
壳寡糖(chitosanoligosaccharides，cos)是通过β-1,4糖苷键连接而成的聚合度为2-10的寡糖，由于其粘度低、溶解度高、吸湿性好、吸附能力强、生物相容性好，在化妆品、医药、食品和农业等行业有广泛的应用。目前cos的制备方法主要有化学法、物理法和酶促法。在这些制备方法中，酶促法具有很好的应用前景。壳聚糖酶可以有效地降解壳聚糖，它来源于不同的微生物，包括细菌和真菌。专利cn110628848a公开了来自于烟曲霉(aspergillusfumigatus)的75家族的壳聚糖酶csn75可以很好的在毕赤酵母中表达，并且该酶具有不能切割壳二糖、壳三糖、壳四糖，很难切割壳五糖的特质，通过控制水解条件，可以实现可控制备壳二糖、壳三糖、壳四糖、壳五糖、壳六糖的目的，具有良好的工业应用价值。
酶的固定化技术因其可回收及重复利用酶，并实现产物、底物及酶的高效分离，是酶工业化应用的关键。目前已经有多种壳聚糖酶固定化技术被报道。如专利cn109943557a《一种固定化壳聚糖酶及其载体的制备方法》，先将纳米二氧化钛加入无水乙醇中分散，再加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷作为氨基化试剂，冰乙酸作为催化剂制备氨基化修饰纳米二氧化钛，再以氨基化修饰纳米二氧化钛作为载体实现对壳聚糖酶的固定化；专利cn101508985a《内切壳聚糖酶载体的制备方法和内切壳聚糖酶的固定方法》，经过naoh、冰乙酸、对甲苯磺酰氯、吡啶处理得到的棉质纤维条可以作为内切壳聚糖酶载体；专利cn1772915a《一种用固定化酶生产壳寡糖的方法》，利用无机或有机的多孔或微孔固定化介质如：多孔氧化铝微球、分子筛、氧化铝、玻璃珠、吸附树脂或离子交换树脂等，以氨丙基三乙氧基硅烷、环氧氯丙烷或戊二醛等为偶联剂，将可特异性水解壳聚糖的壳聚糖酶或非特异性水解壳聚糖的纤维素酶、菠萝蛋白酶等固定，实现壳寡糖的制备。
但是，繁琐、费时费力的酶纯化过程、昂贵的载体、有毒有机化合物的引入及酶自身的不稳定性，限制了壳聚糖酶固定化工业应用。
cbm是广泛存在于碳水化合物活性酶(carbohydrateactivityenzymes，cazymes)中，具有独立的折叠和功能的结构域，无催化活性但具有特异性结合特定碳水化合物(特别是不溶性底物)的活性，且特异性识别和结合底物能力达100％。近年来，碳水化合物结合模块(cbm)与蛋白质融合表达的策略已被证明在酶的一步纯化和固定化中是有效的。cbms是碳水化合物活性酶中广泛存在的具有独立折叠和功能的结构域，能够特异性靶向、区分和结合结构略有差异的碳水化合物，特别是不溶性多糖。此外，这一策略提高了融合酶的特性，如稳定性、活性、选择性和特异性，这些结构域的引入为广泛的蛋白质固定化提供了一个通用平台，且固定化率接近100％。而且，这种策略的固定化载体多为不溶性的天然多糖，如纤维素、几丁质等。
qin,z.等人使用热凝胶(curdlan)为载体利用cbm实现了酶的固定化。(qin,z.；lin,s.；qiu,y.j.；chen,q.m.；zhang,y.；zhou,j.c.；zhao,l.m.one-stepimmobilization-purificationofenzymesbycarbohydrate-bindingmodulefamily56tagfusion.foodchem.2019,299,9.doi:10.1016/j.foodchem.2019.125037.)。但是，qin,z.等人是在大肠杆菌胞内表达了酶，在固定化之前需要对细胞进行破坏，这对工业应用来说是很大的麻烦，也增加了处理成本。
技术实现要素：
[技术问题]
本发明实际解决的技术问题是现有的固定化壳聚糖酶的方法需要繁杂的纯化酶的工艺，且缺少利用固定化酶连续可控生产目标聚合度壳寡糖的方法。
[技术方案]
本发明提供了一种固定化酶填充床反应器的制备方法，是利用酵母表达系统融合表达酶和cbm结合模块，将酵母发酵得到的含有融合酶的发酵上清液加载到填充了热凝胶的填充床反应器中，热凝胶以cbm结合模块为抓手吸附固定融合酶，即得到固定化酶填充床反应器；所述cbm结合模块是碳水化合物活性酶中、具有独立的折叠和功能的结构域，cbm结合模块无催化活性但具有特异性结合特定碳水化合物的活性。
所述酶可以是壳聚糖酶。
所述cbm结合模块可选来源于嗜盐杆菌的β-1,3-葡聚糖酶的可特异结合热凝胶的结构域。所述cbm结合模块的编码序列如seqidno:2所示。
所述酵母可选pichiapastorisgs115。
本发明提供了在毕赤酵母gs115中融合表达可特异性结合热凝胶(curdlan)的碳水化合物结合模块cbm及壳聚糖酶csn75的方法，实现了融合壳聚糖酶csn75-cbm的胞外过表达、一步纯化和固定化壳聚糖酶csn75、可控地连续化生产目标聚合度的壳寡糖。
本发明提供了一种融合表达壳聚糖酶和cbm结合模块的方法，所述cbm结合模块是广泛存在于碳水化合物活性酶(carbohydrateactivityenzymes，cazymes)中、具有独立的折叠和功能的结构域，cbm结合模块无催化活性但具有特异性结合特定碳水化合物(特别是不溶性底物)的活性；所述cbm结合模块的编码序列如seqidmo:2所示，所述方法包括步骤：
(1)合成具有连接子的cbm结合模块的编码序列，并将其插入携带壳聚糖酶编码序列的ppic9k载体，以构建得到ppic9k-csn75-cbm；
(2)对ppic9k-csn75-cbm进行线性化处理，然后将其转化至pichiapastorisgs115感受态细胞中，筛选得到阳性克隆子gs115-ppic9k-csn75-cbm；
(3)对阳性克隆子gs115-ppic9k-csn75-cbm进行培养，并利用甲醇诱导阳性克隆子表达融合酶csn75-cbm；
(4)收集阳性克隆子发酵液的上清液，用于制备壳聚糖酶填充床反应器。
在本发明的一种实施方式中，所述cbm结合模块来源于嗜盐杆菌的β-1,3-葡聚糖酶的可特异结合热凝胶的结构域。
在本发明的一种实施方式中，具有连接子的cbm结合模块的编码序列，插入ppic9k-csn75的not1位点。所述连接子用于连接cbm结合模块和壳聚糖酶。所述连接子优选刚性连接子。
在本发明的一种实施方式中，用saci对ppic9k-csn75-cbm进行线性化处理。
本发明提供了一种原位一步纯化、固定化壳聚糖酶得到热凝胶固定化壳聚糖酶填充床反应器(curdlanimmobilizedchitosanasepacked-bedreactor，cicpr)的方法，以gs115-ppic9k-csn75-cbm为菌种经高密度发酵获得含有大量融合酶csn75-cbm的发酵上清，将发酵上清泵入装有热凝胶的填充床反应器，利用热凝胶吸附融合酶，即可快速实现一步纯化、固定化的壳聚糖酶填充床反应器的制备。
所述方法包括以下步骤：
(1)热凝胶溶胀：用乙酸盐缓冲液溶胀热凝胶粉，待热凝胶溶胀至原来干粉体积的4-6倍，离心去除上清，再用乙酸盐缓冲液洗涤热凝胶；
(2)填充：将溶胀洗涤好的热凝胶倒入垂直放置的填充床反应器中，然后用乙酸盐缓冲液为流动相压实填充床反应器中的热凝胶，即得热凝胶填充床反应器；
(3)固定化融合壳聚糖酶csn75-cbm：将含有融合壳聚糖酶csn75-cbm的发酵上清液加载到热凝胶填充床反应器中，然后，在37-50℃保温孵育，使发酵上清液中的csn75-cbm在填充床反应器中被热凝胶充分绑定，孵育结束后，用醋酸缓冲液平衡填充床反应器，以除去未结合的csn75-cbm和其他杂蛋白，获得热凝胶固定化壳聚糖酶填充床反应器。
在本方法的一种实施方式中，步骤(1)所述乙酸缓冲液是0.2m、ph5.5的乙酸缓冲液，乙酸缓冲液与热凝胶粉的用量比例是30-60ml：2-4g。
在本方法的一种实施方式中，步骤(1)所述离心是8,000×g离心10min。
在本方法的一种实施方式中，步骤(1)所述洗涤的次数是3次。
在本方法的一种实施方式中，步骤(2)所述乙酸盐缓冲液是0.2m、ph5.5的乙酸缓冲液。流速是0.5-1ml/min。
在本方法的一种实施方式中，步骤(2)中，填充床反应器中的热凝胶的装载量不超过填充床反应器的有效容积。
在本方法的一种实施方式中，步骤(3)中，融合壳聚糖酶csn75-cbm的装载量不超过热凝胶的饱和吸附量。例如10-100u/g热凝胶。
在本方法的一种实施方式中，步骤(3)发酵上清液的流速是0.5ml/min，发酵上清液的酶活是10-12u/ml。
在本方法的一种实施方式中，步骤(3)孵育时间是20-30min。
在本方法的一种实施方式中，步骤(3)中孵育结束后，用0.2m、ph6.0的醋酸缓冲液以1ml/min的流速平衡填充床反应器。
本发明提供了利用所述热凝胶固定化壳聚糖酶填充床反应器制备壳寡糖的方法，是将壳聚糖溶液流经所述热凝胶固定化壳聚糖酶填充床反应器，利用热凝胶固定化壳聚糖酶水解壳聚糖得到壳寡糖。
在所述方法中，可以通过控制酶的加载量、底物浓度流速来实现不同聚合度壳寡糖的连续制备。通过间歇分批补料壳聚糖酶至cicpr，可连续实现壳寡糖的制备(如图1所示第1-3步)。
在所述方法中，还可以间歇分批补料融合壳聚糖酶csn75-cbm至热凝胶固定化壳聚糖酶填充床反应器，以此弥补酶活性随着时间流逝的损失。
在本方法的一种实施方式中，在50℃条件下，以0.5-1.5ml/min的速率流加1％的壳聚糖溶液，连续水解4h作为第一个反应周期。所述壳聚糖的脱乙酰度≥95％，壳聚糖溶液的溶剂为0.1～0.5m乙酸溶液；壳聚糖溶液的ph为4～6。例如，在50℃条件下，以1ml/min的速率流加0.5％-1.5％的壳聚糖溶液，连续水解4h作为第一个反应周期。
在本方法的一种实施方式中，在50℃条件下，在酶量为60u/g热凝胶、以0.5ml/min速度流加0.5％的壳聚糖溶液时，水解产物以dp为2、3、4、5的coss为主。
在本方法的一种实施方式中，在50℃条件下，在酶量为80u/g热凝胶、以1.0ml/min速度流加1.0％的壳聚糖溶液时，水解产物中以dp为3、4、5的coss为主要产物。
在本方法的一种实施方式中，在50℃条件下，在酶量为100u/g热凝胶、以1.0ml/min速度流加1.5％的壳聚糖溶液时，其水解产物为dp为3、4、5、6的coss。
在本方法的一种实施方式中，将10mlgs115-ppic9k-csn75-cbm发酵上清液(无细胞)泵入cicpr，37℃孵育30min，用20ml醋酸盐缓冲液(0.2m,ph6.0)平衡，用平衡后的cicpr在50℃条件下，以1ml/min的速率水解1％的壳聚糖，连续水解4h作为第一个反应周期。为了连续制备coss，每隔4h在cicpr中加入10ml新鲜的gs115-ppic9k-csn75-cbm发酵上清液(无细胞)，37℃孵育30min，用20ml醋酸盐缓冲液(0.2m,ph6.0)平衡，再连续水解1％壳聚糖4h。
本发明提供了一种固定化酶填充床反应器，是在填充床反应器中填充了热凝胶，热凝胶通过cbm结合模块固定了酶；所述cbm结合模块是碳水化合物活性酶中、具有独立的折叠和功能的结构域，cbm结合模块无催化活性但具有特异性结合特定碳水化合物的活性。所述酶可以是壳聚糖酶。所述cbm结合模块可选来源于嗜盐杆菌的β-1,3-葡聚糖酶的可特异结合热凝胶的结构域。所述cbm结合模块的编码序列如seqidno:2所示。
[有益效果]
(1)本发明基于分子技术，将可特异性结合热凝胶多糖的cbm结构域与壳聚糖酶在毕赤酵母中融合表达，实现融合壳聚糖酶csn75-cbm的胞外过表达；并基于该cbm的靶向性、选择性和高特异性结合热凝胶的机理，实现原位、一步纯化固定化地快速制备热凝胶固定化csn75-cbm填充床反应器(cicpr)；再通过分批补料csn75-cbm，实现真正连续生产壳寡糖的目的，还通过控制填充床酶量、底物浓度及底物流速实现不同聚合度壳寡糖的制备。
(2)传统的固定化方法存在载体吸附非目标蛋白的现象，而基于cbm辅助的固定化技术使得目的蛋白对于载体(填料)的靶向性、选择性及特异性几乎为100％，减少了填料对非特异性蛋白的吸附。具体地，当发酵上清液流经热凝胶填充床反应器时，融合壳聚糖酶中可以抓住热凝胶的抓手cbm会让融合壳聚糖酶挂在热凝胶上，而不具有抓手的其他杂蛋白都会流穿。所以仅仅让粗酶液流过装有热凝胶的填充床，就可以实现壳聚糖酶的原位一步纯化、固定化。
(3)本发明所选用的填料热凝胶为天然不溶性多糖，安全、绿色、环保。
(4)本发明一步法纯化、固定化壳聚糖酶，且这种方法具有普适性，即任何引入该结构域的目的蛋白都可以实现利用热凝胶对其一步纯化、固定化。
(5)本发明原位制备固定化酶填充床的方法使得生产成本大幅降低，无需反复拆卸安装，因而也节约了拆装时间，提高了生产效率。
(6)本发明可控连续制备目标聚合度的壳寡糖，通过控制水解条件实现不同聚合度壳寡糖的制备，通过分批补料实现真正意义上的连续生产。
(7)由于酶会随着时间推移和活性降低，本发明采用间歇分批补料酶的方式实现对损失酶的回补。
(8)本发明方法具有省时、省力、安全、高效及环境友好等特点，适合食品及医药领域酶的固定化应用。
附图说明
图1为热凝胶固定化壳聚糖酶填充床反应器的制备及其连续制备壳寡糖操作流程。
图2热凝胶溶胀及填充前后的变化；a：溶胀前后的热凝胶，b：制备好的热凝胶填充床反应器，c：电镜下的热凝胶。
图3gs115-ppic9k-csn75-cbm构建示意图。
图4固定化壳聚糖酶填充床反应器水解产物的薄层色谱分析。a：酶量的影响；b：壳聚糖浓度的影响；c：流量的影响。m表示糖标记，g1-g6分别代表葡萄糖胺:glcn、壳二糖(glcn)2、壳三糖(glcn)3、壳四糖(glcn)4、壳二糖(glcn)5和壳六糖(glcn)6的标准品。
图5采用薄层色谱和高效液相色谱法分析了三种不同优化工艺条件下连续生成的水解产物；
a：三种不同优化参数下水解产物的薄层色谱分析；m代表制糖机，g1-g6代表葡萄糖胺、壳二糖、壳三糖、壳四糖、壳戊糖和壳六糖的标准；
b：壳寡糖的hplc分析标准；
c：hplc分析三种不同优化参数下的水解产物；峰上的1-6分别代表葡萄糖胺、几丁糖、几丁糖、几丁糖、几丁糖和几丁糖的标准；(a)酶用量60u，壳聚糖浓度0.5％，流速0.5ml/min；(b)酶量80u，壳聚糖浓度1.0％，流速1.0ml/min；(c)酶量100u，壳聚糖浓度1.5％，流速1.0ml/min；
d：在a、b、c条件下，dp2-6水解产物中的coss浓度和总coss产率；
图例中g2-6分别代表壳二糖、壳三糖、壳四糖、壳戊糖和壳六糖的标准。
图6固定化酶的稳定性和可重复实用性；a：保存不同时间后，固定化酶的催化活性保持率；b：重复使用1-6次，固定化酶的催化活性保持率；c：分批补料制备壳寡糖的过程中coss的浓度。
具体实施方式
壳聚糖酶的酶活定义和检测方法：
用二硝基水杨酸法测定壳聚糖酶的活性。将100微升适当稀释的酶溶液加入到0.5％(w/v)用醋酸钠缓冲液配制(0.2m，ph5.5)的壳聚糖底物中，混合均匀后在50℃水浴中孵育15分钟，加入200molldns溶液停止反应，100℃加热10分钟，最后在冰中冷却。12000g离心5分钟，去除未反应的剩余的壳聚糖。上清液中的还原糖通过测量540nm处的od值以d-氨基葡萄糖作为标准来测定。壳聚糖酶的一个活性单位定义为在上述试验条件下，每分钟释放1mold-氨基葡萄糖当量还原糖所需的酶量。
实施例1热凝胶填充床反应器的制备
制备方法的步骤包括：
(1)热凝胶溶胀：将30-60ml乙酸盐缓冲液(0.2m，ph5.5)加入到2-4g热凝胶粉中，静置10-30min待热凝胶溶胀至原来干粉体积的5倍左右，经8,000×g离心10min后，弃上清，再用过量的乙酸盐缓冲液(0.2m，ph5.5)重复洗涤3次。洗涤后的热凝胶如图2(a)-b。
(2)热凝胶填充床反应器的制备：8ml的反应器装载约1.6g的热凝胶(溶胀前的质量)，将洗涤溶胀好的热凝胶轻轻倒入垂直放置的填充床反应器中，然后用乙酸盐缓冲液(0.2m，ph5.5)为流动相以0.5-1ml/min流速压实填充床反应器中的热凝胶，即得热凝胶填充床反应器，如图2(b)。
实施例2基于分子水平将cbm与壳聚糖酶csn75融合表达的一步纯化、固定化填充床反应器的制备方法
制备方法的步骤包括：
(1)重组酵母gs115-ppic9k-csn75-cbm的构建：我们合成了具有刚性连接子的cbm序列，并将其插入ppic9k-csn75not1位点构建得到ppic9k-csn75-cbm。ppic9k-csn75的构建方法参见文献(zhou,j.l.；liu,x.b.；yuan,f.；deng,b.；yu,x.b.biocatalysisofheterogenously-expressedchitosanaseforthepreparationofdesirablechitosanoligosaccharidesappliedagainstphytopathogenicfungi.acssustain.chem.eng.2020,8,4781-4791.doi:10.1021/acssuschemeng.9b07288.)或cn110628848a。
编码具有刚性连接子的cbm结合模块的核苷酸序列如seqidno:1所示(黑框中的序列为连接子)：
用saci对ppic9k-csn75-cbm进行线性化处理，然后将其电转至pichiapastorisgs115感受态细胞中。被转化的细胞被涂布在无氨基酵母碳源葡萄糖琼脂(md)培养基上，于30℃培养4d。挑取阳性克隆子，进行摇瓶诱导培养，收集培养液的上清，通过跑胶和酶活测定，确认有壳聚糖酶活力，进而确认阳性克隆子确实为gs115-ppic9k-csn75-cbm。
(2)gs115-ppic9k-csn75-cbm的高密度表达及融合壳聚糖酶csn75-cbm粗酶液的获得：
高密度发酵方法和培养基配方参照毕赤酵母发酵工艺指南(invitrogen)。简单地说，将单个gs115-ppic9k-csn75-cbm接种于10mlypd培养基中，于28℃、220rpm振荡培养12h。然后，将10ml种子液接种到200毫升ypd培养基中培养24h获得二级种。将二级种接种到装有1.3升bsm培养基的5l发酵罐中，ph控制在4.5-5.5，温度28-30℃，搅拌速度为500rpm，通气比为1-1.5vvm，培养至溶氧do反弹，在do反弹后的4-6h内缓慢加入50％(w/v)的甘油120ml。当溶氧再次反弹后，将细胞饥饿1.5-2h，然后控制溶氧不低于20％，缓慢加入120ml100％甲醇，调节ph至5.5，转速保持在700-1000rpm诱导表达5d。发酵结束，通过离心或者过滤的手段除去菌体，收集发酵上清液即为融合壳聚糖酶csn75-cbm粗酶液，经检测，粗酶液的酶活是10.26±0.77u/ml，酶蛋白含量是4mg/ml，比酶活是2.565u/mg。
(3)一步法纯化、固定化制备热凝胶壳聚糖酶填充床反应器：以0.5ml/min的流速将10ml经0.45μm滤膜过滤后的发酵上清液加载到实施例1制备的热凝胶填充床反应器上。然后，在37-50℃的水浴中孵育20-30min，使发酵上清液中的csn75-cbm在填充床反应器中被热凝胶充分绑定。孵育后，用30ml醋酸缓冲液(0.2m,ph6.0)以1ml/min的流速平衡填充床反应器，以除去未结合的csn75-cbm和其他杂蛋白。最后获得了热凝胶固定化壳聚糖酶填充床反应器(cicpr)。
实施例3可控、连续制备目标聚合度壳寡糖的方法
通过控制酶的装载量、底物浓度和流速，可将壳聚糖底物连续地降解为不同聚合度的壳寡糖的产物。步骤包括：
(1)酶的装载量：以0.5ml/min的流速将10-100u粗酶液(发酵上清液酶活为10.03u/ml，10-100u即1-10ml发酵上清液。)加载到热凝胶填充床反应器上，然后，在37-50℃的水浴中孵育20-30min，使发酵上清液中的csn75-cbm在填充床反应器中被热凝胶充分绑定。孵育后，用30ml醋酸缓冲液(0.2m,ph6.0)以1ml/min的流速平衡填充床反应器，以除去未结合的csn75-cbm和其他杂蛋白。
(2)底物浓度：将壳聚糖(脱乙酰度≥95％)先溶于0.1～0.5m乙酸溶液，再调ph至4～6，配制成0.5％-1.5％(即，5-15mg/ml)壳聚糖溶液；
(3)流速：控制底物流速为0.5-1.5ml/min。
反应结束后，用薄层色谱(tlc)和高效液相色谱(hplc)对水解产物进行分析。所有样品煮沸10分钟，然后以1,2000×g离心2分钟。样品在薄层色谱板(merck,darmstadt,germany)上点样，在异丙醇/氢氧化铵/水(15:1:75,v/v)溶液中展开4.5h，展开结束后，在薄层班上喷淋0.1％茚三酮试剂。随后，对样品进行了分析高效液相色谱系统(agilent)配有zorbaxnh2柱和示差折光检测器在下列条件：柱温30℃，流动相乙腈/水(70:40,v/v)，和流速1ml/min。
对不同条件下的cos产物进行了薄层色谱分析。结果表明，低dpcoss的比例随着酶量的增加而增加(图5a)。然而，随着壳聚糖浓度的降低(图5b)和流速的降低，低dpcoss的比例增大(图5c)。在酶量为60u、壳聚糖浓度为0.5％(w/v)、流速为0.5ml/min时，水解产物以dp为2、3、4、5的coss为主；当酶量为80u，壳聚糖浓度为1.0％(w/v)，流速为1.0ml/min时，水解产物中以dp为3、4、5的coss为主要产物；而当酶量为100u，壳聚糖浓度为1.5％(w/v)，流速为1.0ml/min时，其水解产物为dp为3、4、5、6的coss。三种条件下的coss产率分别为97.75％、75.45％和73.2％。如预期的那样，低酶量、低壳聚糖浓度和低流速导致水解产物中dps较低的coss产率较高。相比之下，高酶量、高壳聚糖浓度和高流速导致水解产物中dps高的coss产率低。可以看出，水解产物中高dps的coss可以通过牺牲水解收率来补偿。
固定化酶的稳定性和可重复使用性是决定其工业应用成本的重要性质。如图6a所示，将cicpr在合适的条件下(50℃、1％壳聚糖、1ml/min流速)运行30min，测定产物中壳寡糖的浓度；然后将cicpr在4℃下分别保存5、10、15、20d后，再将cicpr运行30min，测定产物中壳寡糖的浓度，并计算该浓度占4℃保存前cicpr所得产物中壳寡糖浓度的比例，即得催化活性保持率。结果表明，cicpr在4℃下分别保存5、10、15、20d后，催化活性分别保持97.8％、95.6％、92.0％和88.3％。20d后，cicpr仍有88％以上的催化活性。这表明cicpr在4℃贮藏时具有良好的稳定性，这有利于其在实际生产中二次应用的灵活性。
为了进一步确认cicpr的重复使用性，在50℃下，将1％壳聚糖以1ml/min的流速水解30min后，检测产物中壳寡糖的浓度，该过程作为第1个循环；再重复4次，计算第2-5次循环产物中壳寡糖的浓度占第一次循环产物中壳寡糖的浓度的比例，即得催化活性保持率。如图6b，在5个循环中，cicpr的水解活性保持在86％以上，表明该工艺在操作过程中具有良好的稳定性和可重用性。
实施例4分批补料制备壳寡糖
为了实现连续生产，进行了分批补料，如图1所示。
将10mlgs115-ppic9k-csn75-cbm发酵上清液(无细胞)泵入cicpr，37℃孵育30min，用20ml醋酸盐缓冲液(0.2m,ph6.0)平衡，用平衡后的cicpr在50℃条件下，以1ml/min的速率水解1％的壳聚糖，连续水解4h作为第一个反应周期。为了连续制备coss，每隔4h在cicpr中加入10ml新鲜的gs115-ppic9k-csn75-cbm发酵上清液(无细胞)，37℃孵育30min，用20ml醋酸盐缓冲液(0.2m,ph6.0)平衡，再连续水解1％壳聚糖4h。
用高效液相色谱法检测水解液中coss的浓度(图6c)。水解4h后，coss的浓度由9.8mg/ml下降到7.2mg/ml。然而，每4小时添加csn75-cbm后，coss的浓度始终保持在10mg/ml左右。我们观察到，在分批补料发酵后，cicpr可以更新，因此可以连续生产coss。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
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<110>江南大学
<120>一种热凝胶固定化壳聚糖酶填充床反应器及其应用
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1.一种固定化酶填充床反应器的制备方法，其特征在于，利用酵母表达系统融合表达酶和cbm结合模块，将酵母发酵得到的含有融合酶的发酵上清液加载到填充了热凝胶的填充床反应器中，热凝胶以cbm结合模块为抓手吸附固定融合酶，即得到固定化酶填充床反应器；所述cbm结合模块是碳水化合物活性酶中、具有独立的折叠和功能的结构域，cbm结合模块无催化活性但具有特异性结合特定碳水化合物的活性。
2.根据权利要求1所述的一种固定化酶填充床反应器的制备方法，其特征在于，所述酶是壳聚糖酶。
3.根据权利要求1所述的一种固定化酶填充床反应器的制备方法，其特征在于，所述cbm结合模块来源于嗜盐杆菌的β-1,3-葡聚糖酶的可特异结合热凝胶的结构域。
4.根据权利要求3所述的一种固定化酶填充床反应器的制备方法，其特征在于，所述cbm结合模块的编码序列如seqidno:2所示。
5.根据权利要求1或2或3任一项所述的一种固定化酶填充床反应器的制备方法，其特征在于，所述酵母是pichiapastorisgs115。
6.根据权利要求1-5任一项所述的一种固定化酶填充床反应器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)合成具有连接子的cbm结合模块的编码序列，并将其插入携带壳聚糖酶编码序列的ppic9k载体，以构建得到ppic9k-csn75-cbm；
(2)对ppic9k-csn75-cbm进行线性化处理，然后将其转化至pichiapastorisgs115感受态细胞中，筛选得到阳性克隆子gs115-ppic9k-csn75-cbm；
(3)对阳性克隆子gs115-ppic9k-csn75-cbm进行培养，并利用甲醇诱导阳性克隆子表达融合酶csn75-cbm；
(4)收集阳性克隆子发酵液的上清液，用于制备壳聚糖酶填充床反应器；
(5)热凝胶溶胀：用乙酸盐缓冲液溶胀热凝胶粉，待热凝胶溶胀至原来干粉体积的4-6倍，离心去除上清，再用乙酸盐缓冲液洗涤热凝胶；
(6)填充：将溶胀洗涤好的热凝胶倒入垂直放置的填充床反应器中，然后用乙酸盐缓冲液为流动相压实填充床反应器中的热凝胶，即得热凝胶填充床反应器；
(3)固定化融合壳聚糖酶csn75-cbm：将含有融合壳聚糖酶csn75-cbm的发酵上清液加载到热凝胶填充床反应器中，然后，在37-50℃保温孵育，使发酵上清液中的csn75-cbm在填充床反应器中被热凝胶充分绑定，孵育结束后，用醋酸缓冲液平衡填充床反应器，以除去未结合的csn75-cbm和其他杂蛋白，获得热凝胶固定化壳聚糖酶填充床反应器。
7.制备壳寡糖的方法，其特征在于，利用权利要求1-6任一项所述的方法制备固定化壳聚糖酶填充床反应器，将壳聚糖溶液流经热凝胶固定化壳聚糖酶填充床反应器，利用热凝胶固定化壳聚糖酶水解壳聚糖得到壳寡糖。
8.根据权利要求7所述的制备壳寡糖的方法，其特征在于，通过控制酶的加载量、底物浓度和流速来控制产物的聚合度。
9.根据权利要求7或8所述的制备壳寡糖的方法，其特征在于，通过间歇分批补料壳聚糖酶，实现连续制备壳寡糖。
10.一种固定化酶填充床反应器，其特征在于，填充了热凝胶，热凝胶通过cbm结合模块固定了酶；所述cbm结合模块是碳水化合物活性酶中、具有独立的折叠和功能的结构域，cbm结合模块无催化活性但具有特异性结合特定碳水化合物的活性。
技术总结