本发明涉及海洋微生物领域，特别是涉及一种破囊壶菌的分离培养基及其分离纯化方法。
背景技术：
破囊壶菌（thraustochytrids）是海洋中一种单细胞类真菌类异养原生生物，广泛分布于海洋、湿地、咸水湖、海底沉积物等海洋环境中。目前破囊壶菌被归类为：藻菌界(stramenopila)、不等鞭毛藻门(heterokonta)、网粘菌纲（labyrinthulomycetes）、破囊壶菌目(thraustochytridiales)、破囊壶菌科(thraustochytriidae)。破囊壶菌在海洋生态系统中不仅存在广泛，而且在诸多领域充当重要角色。作为分解者，海洋中任何一种处于腐烂状态的物质（包括腐烂的动植物残骸、海洋动物的粪便等）都是其潜在的营养来源；破囊壶菌拥有在海洋环境中独立浮游生存的能力，但是也常作为寄生型微生物，寄生在海藻、海草或其他软体动物组织中，同时可能会引起寄主致病，但致病机制尚不清楚；作为被捕食者，在食物网中它们同时也是滤食性动物和碎屑食性动物的来源，由于其细胞内含有大量的脂肪酸，也常是甲壳类动物的重要食物来源。在海洋生态系统中破囊壶菌被认为是细菌的竞争者，因为它不仅可以降解细菌难降解的物质，而且拥有巨大的生物量。但是能用于实验室可培养的破囊壶菌很少，而适合用来培养它们的培养基也很有限。
此外，破囊壶菌拥有很强的生物技术应用潜力，其细胞内含有大量的脂肪酸，能占细胞干重的50%以上。包括饱和脂肪酸（sfas）、单不饱和脂肪酸(mufa)、多不饱和脂肪酸(pufa)。其中sfa和mufa是合成生物柴油的重要原料，而pufa包括二十二碳六烯酸（dha）、二十碳五烯酸（epa）、角鲨烯等。其中，利用破囊壶菌生产dha已经有用于商业的报道。研究指出，dha能促进大脑、视网膜和心脏组织中灰质的形成、对婴幼儿神经和免疫系统的发育起重要作用。dha还能作为前体合成类二十烷酸，调节体内炎症反应，促进凝血，维持血压稳定。随着人们生活水平的提高，人们越来越重视对dha的摄入。鱼油一直是dha的传统来源，然而，由于鱼油的生产成本高、油成分受季节性变化、鱼类资源稀缺、重金属污染、氧化稳定性差等弊端，因此通过破囊壶菌合成dha是一种健康、经济、环保的途径。角鲨烯也是一种多不饱和萜类碳氢化合物，在动植物中扮演着重要角色，是许多类固醇的前体物质，包括胆固醇、胆汁酸、激素和维生素d，在自然界中广泛存在。从深海鲨鱼的肝脏中所产的油类物质中，角鲨烯能占80%左右。角鲨烯也被广泛用作药物乳剂的辅料，用于疫苗、药物和其他药物的输送。它可以改善免疫系统，因此被用作癌症治疗的保护剂，也被用作化妆品的保湿剂和抗氧化剂。鲨鱼肝油一直是角鲨烯的传统来源，但对这些动物的肆意捕杀已经引起了越来越多的环境问题。而重金属的累积对人体健康产生诸多不良影响。因此通过破囊壶菌合成角鲨烯是一种健康、经济、环保的途径。此外，破囊壶菌还能分泌多种胞外酶、产生多种胞外多糖等。
技术实现要素：
针对现有技术不足，本发明一种分离破囊壶菌的培养基及其纯化方法，能直接从海洋水体中和湿地中腐烂状的海草上分离出破囊壶菌，培养基成分简单，成本低廉、操作方便。
一种分离破囊壶菌的培养基配方，其培养基的组成是：glucose1-5g、peptone0.5-2g、yeastextractpowder0.5-2g、谷氨酸钠0.5-1g、玉米浆0.5-1g、agar15-20g、海盐20-30g、青霉素g0.5~1g、streptomycin0.5~1.5g、利福平50~100mg、nystatin5~20mg、h2o1l。
一种分离破囊壶菌的纯化方法，主要包括以下步骤：
（1）一种分离破囊壶菌的培养基制备，其培养基的组成是：glucose1-5g、peptone0.5-2g、yeastextractpowder0.5-2g、谷氨酸钠0.5-1g、玉米浆0.5-1g、agar15-20g、海盐20-30g、自然ph加入加入超纯水后定容至990ml，用玻璃棒搅拌均匀后，超声5-10min，置于高压灭菌锅中115-121℃，灭菌15-21min；
（2）一种分离和纯化破囊壶菌的培养基所用的抗生素混合液制备方法：称取青霉素g0.5~1g、streptomycin0.5~1.5g、利福平50~100mg、nystatin5~20mg然后加入10ml超纯水，混合均匀然后振荡器震荡直至混合液完全溶解，该抗生素混合液需现用现配；等（1）中培养基冷却到55±5℃后倒入用0.22um无菌滤头过滤的抗生素混合液，摇匀，然后倒入无菌培养皿，冷却之后即可得分离破囊壶菌的固体培养基；
（3）菌株的分离：直接量取10-30ml的海水，加入1~2g松花粉摇匀倒入培养皿中，27±1℃培养3~5天，用接种环挑取适量的松花粉于培养基中直接均匀划线或者吸取适量带有松花粉的混合溶液于培养基中涂布均匀，于培养箱中27±1℃培养2~7天，获得初筛菌株；
（4）形态学观察：用40×或100×的显微镜镜头观察平板上的单菌落形态，无菌条件下，用接种环将形似破囊壶菌的单菌落挑至（2）中的固体培养基中培养，待培养基上长出单菌落后再划线培养，如此反复3~5次即可得到纯化的破囊壶菌；
（5）18srrna测序：无菌条件下，用灭菌的牙签从（4）中的平板上挑取破囊壶菌的单菌落，经过pcr基因扩增、跑琼脂糖凝胶电泳、凝胶成像仪分析后送样dna测序。
一种分离破囊壶菌的培养基及其纯化方法，能直接从海洋水体中和湿地中腐烂状的海草上分离出破囊壶菌，培养基成分简单，成本低廉、操作方便可作为实验室用破囊壶菌的分离培养方法。
附图说明
图1是实例1分离出来的破囊壶菌的显微形态图；
图2是实例1分离出来的破囊壶菌18srrna鉴定blast结果图；
图3是实例2分离出来的破囊壶菌的显微形态图；
图4是实例2分离出来的破囊壶菌18srrna鉴定blast结果图。
具体实施方式
下面通过具体实例和附图对本发明作进一步的说明。本发明的实例是为了使本领域的技术人员更好地理解本发明，并不对本发明作任何的限制。
实施例1
本发明所用的海水是从山东青岛鳌山湾附近的海水浴场采集，采集时间为2018年10月1日利用一种分离破囊壶菌的培养基筛选培养：
（1）分离破囊壶菌的培养基制备：glucose5g、peptone2g、yeastextractpowder0.5、谷氨酸钠0.5、玉米浆1g、agar20g、海盐20g、自然ph加入超纯水后定容至990ml，用玻璃棒搅拌均匀后，超声5-10min，置于高压灭菌锅中115-121℃，灭菌15-21min；
（2）分离和纯化破囊壶菌的培养基所用的抗生素混合液制备：称取青霉素g1g、streptomycin1.5g、利福平50mg、nystatin5mg然后加入10ml超纯水，混合均匀然后振荡器震荡直至混合液完全溶解，该抗生素混合液需现用现配。等（1）中培养基冷却到55±5℃后倒入用0.22um无菌滤头过滤的抗生素混合液，摇匀，然后倒入无菌培养皿，冷却之后即可得分离破囊壶菌的固体培养基；
（3）菌株的分离直接量取30ml采集的海水，加入2g松花粉摇匀倒入培养皿中，27±1℃培养3~5天，用接种环挑取适量的松花粉于培养基中直接均匀划线或者吸取适量带有松花粉的混合溶液于培养基中涂布均匀，于培养箱中27±1℃培养2~7天，获得初筛菌株；
（4）形态学观察：用40×或100×的显微镜镜头观察平板上的单菌落形态，无菌条件下，用接种环将形似破囊壶菌的单菌落挑至（2）中的固体培养基中培养，待培养基上长出单菌落后再划线培养，如此反复3~5次即可得到纯化的破囊壶菌，结果如图1所示；
（5）18srrna测序：无菌条件下，用灭菌的牙签从（4）中的平板上挑取破囊壶菌的单菌落，经过pcr基因扩增、跑琼脂糖凝胶电泳、凝胶成像仪分析后送样dna测序，经18srrna测序分析结果如图2所示，为thraustochytrium属的破囊壶菌。
实施例2
本发明所用的海水及腐烂的海草是从黄海海域胶州湾附近的湿地公园采集，采集时间为2018年10月1日利用一种分离破囊壶菌的培养基筛选培养：
（1）分离破囊壶菌的培养基制备：glucose1g、peptone0.5g、yeastextractpowder2g、谷氨酸钠0.5g、玉米浆0.5g、agar15g、海盐30g、自然ph加入超纯水后定容至990ml，用玻璃棒搅拌均匀后，超声5-10min，置于高压灭菌锅中115-121℃，灭菌15-21min；
（2）分离和纯化破囊壶菌的培养基所用的抗生素混合液制备：称取青霉素g0.5g、streptomycin0.5g、利福平100mg、nystatin15mg然后加入10ml超纯水，混合均匀然后振荡器震荡直至混合液完全溶解，该抗生素混合液需现用现配。等（1）中培养基冷却到55±5℃后倒入用0.22um无菌滤头过滤的抗生素混合液，摇匀，然后倒入无菌培养皿，冷却之后即可得分离破囊壶菌的固体培养基；
（3）菌株的分离采集处于腐烂状态的海草，用灭菌的剪刀截成1-2cm的小段，用无菌海水冲洗2-3次将其置于（2）中的培养基中，于培养箱中27±1℃培养2~7天，即可获得初筛菌株；
（4）形态学观察：用40×或100×的显微镜镜头观察平板上的单菌落形态，无菌条件下，用接种环将形似破囊壶菌的单菌落挑至（2）中的固体培养基中培养，待培养基上长出单菌落后再划线培养，如此反复3~5次即可得到纯化的破囊壶菌，结果如图3所示；
（5）18srrna测序：无菌条件下，用灭菌的牙签从（4）中的平板上挑取破囊壶菌的单菌落，经过pcr基因扩增、跑琼脂糖凝胶电泳、凝胶成像仪分析后送样dna测序，经18srrna测序分析结果如图4所示，为oblongichytrium属的破囊壶菌。
1.一种分离破囊壶菌的培养基，其特征在于：培养基的组成是：glucose1-5g、peptone0.5-2g、yeastextractpowder0.5-2g、谷氨酸钠0.5-1g、玉米浆0.5-1g、agar15-20g、海盐20-30g、青霉素g0.5~1g、streptomycin0.5~1.5g、利福平50~100mg、nystatin5~20mg、h2o1l。
2.一种采用权利要求1所述的分离破囊壶菌培养基的纯化方法，其特征在于：主要包括以下步骤：
（1）一种分离破囊壶菌的培养基制备：glucose1-5g、peptone0.5-2g、yeastextractpowder0.5-2g、谷氨酸钠0.5-1g、玉米浆0.5-1g、agar15-20g、海盐20-30g、自然ph加入加入超纯水后定容至990ml，用玻璃棒搅拌均匀后，超声5-10min，置于高压灭菌锅中115-121℃，灭菌15-21min；
（2）培养基所用抗生素混合液制备：称取青霉素g0.5~1g、streptomycin0.5~1.5g、利福平50~100mg、nystatin5~20mg然后加入10ml超纯水，混合均匀然后振荡器震荡直至混合液完全溶解，该抗生素混合液需现用现配；等（1）中培养基冷却到55±5℃后倒入用0.22um无菌滤头过滤的抗生素混合液，摇匀，然后倒入无菌培养皿，冷却之后即可得分离破囊壶菌的固体培养基；
（3）菌株的分离：直接量取10-30ml的海水，加入1~2g松花粉摇匀倒入培养皿中，27±1℃培养3~5天，用接种环挑取适量的松花粉于培养基中直接均匀划线或者吸取适量带有松花粉的混合溶液于培养基中涂布均匀，于培养箱中27±1℃培养2~7天，获得初筛菌株；
（4）形态学观察：用40×或100×的显微镜镜头观察平板上的单菌落形态，无菌条件下，用接种环将形似破囊壶菌的单菌落挑至（2）中的固体培养基中培养，待培养基上长出单菌落后再划线培养，如此反复3~5次即可得到纯化的破囊壶菌；
（5）18srrna测序：无菌条件下，用灭菌的牙签从（4）中的平板上挑取破囊壶菌的单菌落，经过pcr基因扩增、跑琼脂糖凝胶电泳、凝胶成像仪分析后送样dna测序。
技术总结