(一)技术领域
本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种微生物发酵技术在桑叶多糖提取中的应用。
(二)
背景技术：
桑叶为桑科植物桑(morusalbal.)的叶子，是《中国药典》收录的传统中药材，具有疏散风热，清肺润燥，清肝明目的功能，主治风热感冒，肺热燥咳，头晕头痛，目赤昏花。现代药理学研究表明桑叶具有抗凝、降血压、降血糖、降血脂、抗衰老、抗肿瘤等药理作用。桑叶的化学成分有多糖、黄酮、生物碱、维生素、胡萝卜素和许多人体所需的氨基酸，其中多糖是主要有效成分之一。
现代医学研究表明，桑叶多糖具有降血脂、抗血栓、降血糖、降血压、抗衰老、抗炎和提高免疫力等功能。作为一种植物性功能多糖，桑叶多糖在医疗和保健方面的应用前景广阔。我国桑叶资源丰富，而传统的养蚕业在逐渐萎缩，所以开发桑叶多糖产品有着较高的社会和经济价值。
目前，常见的桑叶多糖提取方法主要有热水浸提法、超声或微波辅助提取法和酶辅助提取法等。不同的提取工艺有各自的优缺点，多糖的提取收率也差异较大。热水浸提法的耗时长且多糖提取率低；超声或微波辅助提取法是在热水浸提的基础上，增加超声或微波处理步骤，提取收率相对较高，因此具有相对的优势；酶辅助提取法是在前面三种提取方法的基础上，增加了酶处理步骤，虽然可以获得较高的多糖收率，但酶的使用无疑增加了生产成本，限制了它的广泛应用。为了进一步提高桑叶多糖的提取收率，本发明对桑叶多糖超声提取法工艺进行改进，增加微生物发酵预处理步骤，从而可以显著提高了桑叶多糖的提取收率。
(三)
技术实现要素：
本发明目的是将微生物发酵技术应于桑叶多糖的超声提取中，从而显著提高桑叶多糖提取收率。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种利用微生物发酵法提取桑叶多糖的方法，所述方法为：桑叶粉中加入无菌生理盐水，接种总状毛霉(mucorracemosus)sy5-47的孢子，于28–30℃发酵3–4d，发酵物经超声水提后浓缩(优选浓缩至原体积的1/4–1/5)，获得浓缩物；浓缩物经醇沉和真空干燥后，获得桑叶粗多糖；所述的总状毛霉(mucorracemosus)sy5-47菌株，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：gdmccno:61272，保藏日期2020年11月5日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070。
进一步，所述无菌生理盐水体积用量以桑叶粉重量计为2.5–3.0ml/g，所述总状毛霉sy5-47孢子接种量以桑叶粉重量计为3–5×107个/g；所述桑叶粉是将成熟的绿色桑叶烘干粉碎后过40目筛获得。
进一步，所述生理盐水中还添加有蔗糖，所述蔗糖在无菌生理盐水中的浓度是1–10g/l，优选10g/l。
进一步，所述总状毛霉sy5-47孢子接种以孢子液的形式加入，所述孢子液的制备方法为：低温保藏的总状毛霉sy5-47接种于马铃薯平板培养基(pda)，于28–30℃恒温培养2–3d后，加入无菌生理盐水于培养皿中，用接种环搅动使孢子悬浮，获得孢子液；优选将孢子液转移到无菌试管中，用无菌生理盐水调整孢子浓度为3–5×108个/ml。所述的pda平板培养基(马铃薯蔗糖琼脂培养基)终浓度组成为：马铃薯200g/l(煮沸30min后过滤留汁)，蔗糖20g/l，琼脂20g/l，溶剂为自来水，ph自然(实测6.5)。
进一步，所述浓缩物的制备方法为：发酵物加入去离子水，搅拌均匀后，先置于30℃水浴中保温4–6h，然后转入水温70-85℃的超声波清洗机中，100–200w超声提取2–3h；超声水提结束后，趁热过滤，将滤液55℃减压浓缩至原体积的1/4–1/5，获得浓缩物；所述去离子水体积加入量以发酵前桑叶粉重量计为20–30ml/g。
进一步，所述桑叶多糖的制备方法为：向浓缩物中加入4–5倍体积的95％乙醇，室温静置8–12h后，室温条件下8000r/min离心5–10min，收集多糖沉淀，于60℃真空干燥至恒重，得桑叶粗多糖。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：在桑叶多糖超声水提前，增加了总状毛霉sy5-47的发酵预处理。总状毛霉sy5-47在桑叶粉中适度生长，产生多种多糖水解酶，对桑叶细胞壁的水解，使得桑叶结构组织疏松，促进结合态可溶性多糖的解离，在热水超声浸提时更容易溶出。较不采用发酵预处理的超声水提法相比，桑叶多糖的提取收率可以提高35％以上。
(四)附图说明
图1总状毛霉sy5-47的菌落形态图。
图2苯酚-硫酸法测定多糖的标准曲线。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明所述的桑叶是植物桑(morusalbal.)的成熟的绿色叶片。桑叶粉是将采摘的叶片(无叶柄)经自来水冲洗干净后，自然风干或60℃烘干，粉碎过40目筛后，于塑料袋中密封保存。
实施例1发酵菌株的筛选和鉴定
1、菌株筛选
(1)250-ml三角瓶中加入约10g的桑叶粉，再加入25ml无菌生理盐水润湿，于28℃恒温培养3d。将长满霉菌的富集培养物用无菌生理盐水稀释1×108倍后涂布于pda平板培养基上，于28℃恒温培养2d，挑取颜色和形态不同的霉菌菌落转接新鲜pda培养基，置于28℃恒温培养2d，得纯培养菌株8株，分别予以编号sy1–sy8。8个菌株的新鲜平板培养物中，分别加入5ml无菌生理盐水，用接种环搅拌使得孢子悬浮，孢子液转移到无菌试管中，用无菌生理盐水调整孢子浓度为3×108个/ml。
(2)250-ml三角瓶于160℃干热灭菌2h，加入10g的桑叶粉，加25ml的无菌生理盐水，再接种1ml上述步骤(1)各菌株的孢子液，搅拌均匀。三角瓶用八层纱布扎口，于28℃条件下培养3d。
(3)步骤(2)经发酵的全部桑叶粉转入500-ml的三角瓶中，加入200ml的去离子水，搅拌均匀后置于30℃恒温水浴锅中保温4h，间隔15min手摇振荡一次。之后，三角瓶转入水温70℃的超声波清洗机中，100w超声提取2h。超声水提结束后，趁热布氏漏斗抽滤，将滤液55℃减压浓缩至50ml，获得浓缩液。
(4)向步骤(3)获得的全部浓缩液中，加入200ml的95％乙醇，室温静置10h后，室温条件下8000r/min离心5min，收集多糖沉淀，60℃真空干燥12h，得桑叶粗多糖，采用苯酚-硫酸法测定粗多糖中的多糖含量。
同样条件下，以不接种霉菌孢子液为未经发酵的对照，桑叶粉经不同菌株发酵后，多糖的提取收率见表1。
表1不同菌株发酵桑叶后多糖的提取收率
由表1数据可以看出，桑叶粉经菌株sy5发酵后，较未经发酵的对照相比，多糖的提取收率提高幅度最高，达到了11.7％，本发明选定该菌株作为提高桑叶多糖提取收率的发酵菌种。
2、菌株鉴定
菌株sy5接种在pda平板培养基上，28℃条件下培养，菌落初期为灰白色绒毛状，随着培养时间的延长，逐渐变为灰色，表面有黑色孢子囊；菌丝无假根；孢子囊梗单轴状分枝，分枝不规则；孢子囊呈球形、灰褐色；孢子呈球形或短椭圆形，大小6–10μm×5–8μm。菌株sy5在pda平板培养基上28℃培养2d的菌落照片见图1；菌株sy5的rdna核糖体内转录间隔区(rdna-its)核苷酸序列为seqidno.1所示。
将菌株sy5交由生工生物工程(上海)有限公司鉴定，测得其核糖体its区rdna核苷酸序列为seqidno.1所示，根据菌株sy5菌落特征和核糖体its区rdna核苷酸序列比对，确定菌株sy5为一株总状毛霉(mucorracemosus)。
所述的平板培养基为马铃薯蔗糖琼脂培养基(pda)，按如下组成和方法配制：马铃薯洗净去皮切成小块，称取200g，加自来水1000ml，煮沸30min，4层纱布过滤去渣，滤液补足到1000ml，再加入蔗糖20g、琼脂20g，ph自然(实测6.5)，加热至琼脂溶化后于三角瓶中，经高压蒸汽121℃灭菌15min后倒入直径9cm的无菌培养皿，冷却后备用。
所述的桑叶多糖含量采用苯酚-硫酸法测定，具体方法为：将桑叶粗多糖用蒸馏水配制成浓度为0.1mg/ml的样品溶液。吸取样品溶液2ml于25ml比色管中，加1ml的体积浓度5％苯酚水溶液，摇匀后迅速滴加2.5ml浓硫酸(质量浓度98％)，摇匀后室温放置10min，沸水浴中加热15min，流水冷却至室温。以1ml蒸馏水作为空白对照的相同处理为参比，测定吸光度a490。以相同方法测定不同蔗糖浓度样品的a490，绘制蔗糖浓度—a490标准曲线(图2)，得回归方程，由回归方程计算测定桑叶粗多糖样品中多糖含量。
所述的桑叶多糖提取收率按以下公式计算：
实施例2诱变育种
对总状毛霉sy5进行诱变育种，筛选发酵性能优良的菌株，具体方法为：
(1)孢子液的制备：将总状毛霉sy5经pda活化培养后，加5ml无菌生理盐水，用接种环搅动使孢子悬浮后，转入含45ml无菌生理盐水的三角瓶中，室温振荡30min。孢子悬液经过过滤除去菌丝(三角漏斗颈部放一棉花团过滤)，在显微镜下用血球计数板对悬液中的孢子计数，用无菌生理盐水做适当倍数稀释，调整孢子数量在1×108个/ml左右。
(2)诱变：诱变在红光下操作。取2.0ml上述孢子悬液和一枚无菌回形针至直径6cm的培养皿中，培养皿置于磁力搅拌器上，在预热30min的30w紫外灯下分别照射1、2、3、4、5min。取0.5ml上述照射处理后的孢子液，作适当倍数稀释后，分别移取0.2ml涂布pda平板。以同样操作，做未经紫外线照射的孢子液稀释涂平板作为对照，以计算致死率。接种后的pda平板用黑布包裹，于28℃培养1d，对平板上的菌落进行计数，计算致死率。
(3)筛选：挑取致死率在90％以上pda平板上的菌落转接新鲜pda平板，按实施例1所述的方法，对突变菌株进行筛选。经过2轮筛选，获得一株编号为sy5-47的菌株对提高桑叶多糖提取率的发酵性能最好。用该菌株发酵桑叶后，多糖的提取率为13.6％，较出发菌株提高了18.3％，较未经发酵的对照提高了32.0％。sy5-47菌株经过转接传代5次，每代发酵桑叶后的黄酮提取率波动范围小于10％，说明该菌株遗传稳定性良好。
由总状毛霉sy5菌株，经紫外线诱变后，筛选获得了sy5-47菌株，即总状毛霉(mucorracemosus)sy5-47，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：gdmccno:61272，保藏日期2020年11月5日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070。
实施例3总状毛霉sy5-47应用于桑叶多糖的提取
(1)低温保藏的总状毛霉sy5-47(冻干管或平板菌落)接种于新鲜pda平板培养基，于28℃恒温培养2d，加5ml的无菌生理盐水于培养皿中，用接种环搅动使孢子悬浮，孢子液转移到无菌试管中，用无菌生理盐水调整孢子浓度为3×108个/ml。所述的pda平板培养基成分和配制方法同实施例1。
(2)250-ml三角瓶于160℃干热灭菌2h，加入10g的桑叶粉，加25ml的无菌生理盐水，接种1ml步骤(1)制备的总状毛霉sy5-47的孢子液，搅拌均匀。三角瓶用八层纱布扎口，于28℃条件下培养3d，得发酵桑叶粉。
(3)步骤(2)经发酵的全部桑叶粉转入500-ml的三角瓶中，加入200ml的去离子水，搅拌均匀后，置于30℃恒温水浴锅中保温4h，间隔15min手摇振荡一次。之后，三角瓶转入水温70℃的超声波清洗机中，100w超声提取2h。超声水提结束后，趁热布氏漏斗抽滤，将滤液55℃减压浓缩至50ml，获得浓缩液。
(4)向步骤(3)获得的全部浓缩液中，加入200ml的95％乙醇，室温静置12h后，室温条件下8000r/min离心5min，收集多糖沉淀，60℃真空干燥10h至恒重，得桑叶粗多糖，采用苯酚-硫酸法测定粗多糖中的多糖含量。
按上述步骤，从10g桑叶中提取得桑叶粗多糖1.88g，多糖含量为72.7％，即得到桑叶多糖1.37g，提取收率为13.7％，产品为灰绿色粉状物。
实施例4总状毛霉sy5-47应用于桑叶多糖的提取
(1)低温保藏的总状毛霉sy5-47(冻干管或平板菌落)接种于新鲜pda平板培养基，于28℃恒温培养2d，加5ml的无菌生理盐水于培养皿中，用接种环搅动使孢子悬浮，孢子液转移到无菌试管中，用无菌生理盐水调整孢子浓度为5×108个/ml。所述的pda平板培养基成分和配制方法同实施例1。
(2)250-ml三角瓶于160℃干热灭菌2h，加入10g的桑叶粉，加含10g/l蔗糖的无菌生理盐水20ml，接种1ml步骤(1)制备的总状毛霉sy5-47的孢子液，搅拌均匀。三角瓶用八层纱布扎口，于30℃条件下培养4d，得发酵桑叶粉。
(3)步骤(2)经发酵的全部桑叶粉转入500-ml的三角瓶中，加入300ml的去离子水，搅拌均匀后，置于30℃恒温水浴锅中保温6h，间隔15min手摇振荡一次。之后，三角瓶转入水温85℃的超声波清洗机中，200w超声提取3h。超声水提结束后，趁热布氏漏斗抽滤，将滤液55℃减压浓缩至60ml，获得浓缩液。
(4)向步骤(3)获得的全部浓缩液中，加入250ml的95％乙醇，室温静置12h后，室温条件下8000r/min离心10min，收集多糖沉淀，60℃真空干燥10h至恒重，得桑叶粗多糖，采用苯酚-硫酸法测定粗多糖中的多糖含量。
按上述步骤，从10g桑叶中提取得桑叶粗多糖2.01g，多糖含量为71.9％，即得到桑叶多糖1.45g，提取收率为14.5％，产品为灰绿色粉状物。
实施例5总状毛霉sy5-47应用于桑叶多糖的提取
(1)低温保藏的总状毛霉sy5-47(冻干管或平板菌落)接种于新鲜pda平板培养基，于28℃恒温培养3d，加5ml的无菌生理盐水于培养皿中，用接种环搅动使孢子悬浮，孢子液转移到无菌试管中，用无菌生理盐水调整孢子浓度为5×108个/ml。所述的pda平板培养基成分和配制方法同实施例1。
(2)250-ml三角瓶于160℃干热灭菌2h，加入50g的桑叶粉，加含10g/l蔗糖的无菌生理盐水100ml，接种5ml步骤(1)制备的总状毛霉sy5-47的孢子液，搅拌均匀。三角瓶用八层纱布扎口，于30℃条件下培养4d，得发酵桑叶粉。
(3)向步骤(2)经发酵的全部桑叶粉转入2-l的三角瓶中，加入1500ml的去离子水，搅拌均匀后，置于30℃恒温水浴锅中保温6h，间隔15min手摇振荡一次。之后，三角瓶转入水温85℃的超声波清洗机中，200w超声提取3h。超声水提结束后，趁热布氏漏斗抽滤，将滤液55℃减压浓缩至300ml，获得浓缩液。
(4)向步骤(3)获得的全部浓缩液中，加入1500ml的95％乙醇，室温静置12h后，室温条件下8000r/min离心10min，收集多糖沉淀，60℃真空干燥12h至恒重，得桑叶粗多糖，采用苯酚-硫酸法测定粗多糖中的多糖含量。
按上述步骤，从50g桑叶中提取得桑叶粗多糖9.82g，多糖含量为72.8％，即得到桑叶多糖7.15g，提取收率为14.3％，产品为灰绿色粉状物。
如不经本实施例步骤(2)的发酵过程，其他步骤按本实施例方法，50g的桑叶粉可提取获得桑叶粗多糖7.76g，多糖含量为67.6％，即得到桑叶多糖5.25g，提取收率为10.5％。可见，本实施例中，在桑叶多糖超声水提前，增加了总状毛霉sy5-47的发酵预处理，较不采用发酵预处理的常规方法相比，桑叶多糖的提取收率可以提高了36.2％。
序列表
<110>浙江工业大学
<120>一种利用微生物发酵法提取桑叶多糖的方法
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>613
<212>dna
<213>总状毛霉(mucorracemosus)
<400>1
ggatcattaaataatcaataatcttggcttgtccattattatctatttactgtgaactgt60
attattatttgacattcgagggatgttccaatgttataaggatagacattgggaatgtta120
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1.一种利用微生物发酵法提取桑叶多糖的方法，其特征在于所述方法为：向桑叶粉中加入无菌生理盐水，接种总状毛霉(mucorracemosus)sy5-47的孢子，于28–30℃发酵3–4d，发酵物经超声水提后浓缩，获得浓缩物；浓缩物经醇沉和真空干燥后，获得桑叶粗多糖；所述总状毛霉sy5-4，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：gdmccno:61272，保藏日期2020年11月5日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述无菌生理盐水体积用量以桑叶粉重量计为2.5–3.0ml/g；所述总状毛霉sy5-47孢子接种量以桑叶粉重量计为3–5×107个/g。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述桑叶粉是将成熟的绿色桑叶烘干粉碎后过40目筛获得。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述总状毛霉sy5-47以孢子液的形式加入，所述孢子液的制备方法为：低温保藏的总状毛霉sy5-47接种于pda平板培养基，于28–30℃恒温培养2–3d后，加入无菌生理盐水于培养皿中，用接种环搅动使孢子悬浮，获得孢子液。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述浓缩物的制备方法为：发酵物加入去离子水，搅拌均匀后，先置于30℃水浴中保温4–6h，然后转入水温70-85℃的超声波清洗机中，100–200w超声提取2–3h；超声水提结束后，趁热过滤，将滤液55℃减压浓缩至原体积的1/4–1/5，获得浓缩物。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述去离子水体积加入量以发酵前桑叶粉重量计为20–30ml/g。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述桑叶多糖的制备方法为：向浓缩物中加入4–5倍体积的95％乙醇，室温静置8–12h后，室温条件下8000r/min离心5–10min，收集多糖沉淀，于60℃真空干燥至恒重，得桑叶粗多糖。
技术总结