本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种产类胡萝卜素的酵母突变菌株及其突变位点应用。
背景技术：
类胡萝卜素是一大类有颜色的类异戊二烯物质，由于其具有超强的抗氧化性，可以用于着色剂、营养品、抗氧化剂等。当前，化学合成和天然提取是制备类胡萝卜素的主要方式。由于结构的复杂性和原料供应不稳定、有机溶剂污染、得率低等因素限制了类胡萝卜素的规模化生产。野生型酿酒酵母并不能合成类胡萝卜素，但是通过基因工程改造酿酒酵母用于类胡萝卜素合成已经取得了长足的进步。但是，要在已有报道的基础上，发现新的基因改造靶点，进一步提高类胡萝卜素的合成还是很困难的。而自然诱变或者定向进化为寻找新靶点提供了可能。例如，通过常温等离子诱变(artp)可以将虾青素的产量提高0.83倍，并揭示了3个潜在的靶点。另外，artp结合过氧化氢介导的实验室适应性进化可以将虾青素含量提高4倍，但并未揭示相关潜在基因。
实验室适应性进化(ale)是一种经过长期驯化，不断适应筛选压力进而累积有益突变的一种技术。在代谢工程研究中，ale可以发现新的改造靶点，并获得高产菌株。ale可以提高菌株生长速率、提高产物产量、利用非天然底物、提高对环境胁迫的抗性等。并且可以通过基因组测序，揭示表型性状与基因改变的关系。例如，在重组酿酒酵母中，通过过氧化氢介导的适应性进化显著提高了类胡萝卜素的合成，并揭示了相关突变。相比较紫外诱变等诱变形式，ale突变率较低，更容易揭示潜在的突变基因。
ale往往需要选择合适的筛选压力来驱动定向进化。根据已知的酿酒酵母乙醇耐受性机理，可以通过改变细胞膜结构来增加酿酒酵母对乙醇的耐受性，而同样也可以通过改变细胞膜结构来增加类胡萝卜素的积累。所以，我们推测可以利用乙醇作为筛选压力，来驱动细胞膜结构的改变，从而筛选到利于类胡萝卜素积累的突变。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一株高产类胡萝卜素的酿酒酵母变菌株-酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)m3，其于2020年12月3日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号59号楼5楼，邮编510070，保藏编号为：gdmccno:61336。
本发明人以申请人已申请专利(申请号为：2019103999462)中酿酒酵母bl03，cit1-thmg1，δald6菌株为出发菌株，通过乙醇介导的实验室适应性进化获得类胡萝卜素含量明显提升的酿酒酵母变菌株，并确定了pfk1基因的缺失是促进作用的主要来源，为类胡萝卜素合成提供了新的改造靶点。
本发明的第二个目的是提供上述酿酒酵母m3在类胡萝卜素生产中的应用。
优选是将酿酒酵母m3接种到ypd或ypm培养基中进行发酵培养，产类胡萝卜素。
本发明的第三个目的是提供一种提高酿酒酵母类胡萝卜素产量的方法，其是将酿酒酵母基因组中的pfk1基因突变失活。
优选是将酿酒酵母基因组中的pfk1基因突变失活的突变株接种到ypd或ypm培养基中进行发酵培养，产类胡萝卜素。
本发明的第四个目的是提供将酿酒酵母基因组中的pfk1基因突变失活在提高酿酒酵母产类胡萝卜素中的应用。
本发明的第五个目的是提供一种突变菌株，是将酿酒酵母基因组中的pfk1基因突变失活获得的菌株。
本发明的第六个目的是提供一种突变菌株，是将酿酒酵母基因组中的pfk2基因突变失活获得的菌株。
本发明通过乙醇介导的实验室适应性进化筛选获得一株酿酒酵母突变菌株m3。该菌株在摇瓶发酵条件下，ypd培养基中类胡萝卜素含量可以达到19.7mg/g，比出发菌株提高5.1倍；而在ypm培养基中类胡萝卜素含量可以达到42.4mg/g细胞干重。
saccharomycescerevisiaem3，其于2020年12月3日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编510070，保藏编号为：gdmccno:61336。
附图说明
图1是实验室适应性进化示意图。
图2是突变菌株及出发菌株性能表征。(a)不同培养基中突变菌株类胡萝卜素含量；(b)不同乙醇浓度下生长速率；(c)不同乙醇浓度下类胡萝卜素含量；(d)细胞生长曲线，其中bl03-d-4代表出发菌株，m3代表酿酒酵母m3。
图3是反向代谢工程改造。m3代表酿酒酵母m3；be1代表敲除基因pfk1的酿酒酵母；be2代表敲除pfk2基因的酿酒酵母。
图4是比较转录组分析。(a)显著表达基因。(b)显著变化代谢途径。(c)go富集分析。(d)kegg富集分析。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
实施例1乙醇介导的实验室适应性进化
本实施例的酿酒酵母发酵培养基为：ypd培养基：酵母提取物10g/l(oxoid公司)，蛋白胨20g/l，葡萄糖20g/l，溶剂为水；或ypm培养基：酵母提取物10g/l(安琪酵母股份有限公司)，蛋白胨20g/l，葡萄糖20g/l，磷酸二氢钾10g/l，七水硫酸镁5g/l，硫酸钾3.5g/l，磷酸钠2.5g/，tms溶液1ml/l(六水氯化镁250mg/l，二水氯化钙104.5mg/l，mg/l，五水合硫酸铜0.4mg/l，碘化钠0.08mg/l，四水合氯化锰0.1mg/l，二水合钼酸钠0.5mg/l，硼酸1mg/l，六水合氯化钴0.3mg/l，七水硫酸锌6.25mg/l，七水合硫酸亚铁3.5mg/l)，溶剂为水。其配制方法是将各成分混合均匀，灭菌制得。
基于已报道的酿酒酵母乙醇耐受性机理，我们推测乙醇可以作为一种胁迫压力驱动酿酒酵母定向进化，从而达到提高类胡萝卜素的积累。所以我们设计了一套乙醇介导的实验室适应性进化(如图1)，基本原理是：以申请号为：cn2019103999462中酿酒酵母bl03，cit1-thmg1，δald6菌株为出发菌株，以ypd培养基为发酵培养基，先从新鲜的ypd固体平板挑取单克隆，于5mlypd液体培养基中，30℃培养过夜；按2％体积接种量，接种于50mlypd液体培养基中，待菌体进入稳定期后，同样按2％接种量接种含更高浓度乙醇的ypd液体培养基。本发明采取三种策略进行适应性进化，第一种：按2％，4％，10％，12％(体积比)顺序不断增加乙醇浓度，每一个浓度下菌体达到稳定期后，取适量菌液进行稀释，涂布于不含乙醇ypd固体培养基；第二种；按4％，8％，10％，12％顺序不断增加乙醇浓度进行适应性进化；第三种：按2％，4％，8％，10％四个固定乙醇浓度进行适应性进化，细胞达到稳定期进行涂布筛选。最后，在第一种策略中乙醇浓度为10％的批次培养中，成功筛选到一株颜色明显变红的菌株，命名为酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)m3，其于2020年12月3日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编510070，保藏编号为：gdmccno:61336。
实施例2：突变菌株生产性能
将出发菌株-酿酒酵母bl03，cit1-thmg1，δald6和酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)m3分别划线于新鲜ypd固体培养基中，48小时后，挑取单菌落接种于5mlypd液体培养基中，过夜培养后，按体积比2％接种量分别接种到50mlypd和ypm液体培养基中。其中ypm培养基设置不含乙醇、2％、4％、8％、10％v/v五种不同浓度乙醇，于30℃，200rpm条件下培养96小时。培养结束，按标准的测定方法，分别测定各培养条件下细胞的生长速率、类胡萝卜素含量和生长曲线。
从图2可以看出，酿酒酵母m3相比较出发菌株-酿酒酵母bl03，cit1-thmg1，δald6(图2中的bl03-d-4)，无论是在类胡萝卜素含量、不同浓度乙醇下生长速率、不同乙醇浓度下类胡萝卜素含量都有一定提高。但在无乙醇培养条件下，菌株之间生长并没有明显差别(图2d)，说明不是由于生长导致类胡萝卜素的差异。酿酒酵母m3在摇瓶发酵条件下，ypd培养基中类胡萝卜素含量可以达到19.7mg/g细胞干重，比出发菌株提高5.1倍；而在ypm培养基中类胡萝卜素含量可以达到42.4mg/g细胞干重。
实施例3突变株突变位点的确定
为了确定突变菌株的突变位点，我们对出发菌株-酿酒酵母bl03，cit1-thmg1，δald6和突变菌株-酿酒酵母m3进行了基因组重测序，发现了14个单核苷酸突变，其中有1个有意义突变，并且在pfk1基因内部产生终止密码子，导致基因失活。随后，我们对出发菌株进行反向代谢工程研究，参考文献(chen,y.；xiao,w.；wang,y.；liu,h.；li,x.；yuan,y.,lycopeneoverproductioninsaccharomycescerevisiaethroughcombiningpathwayengineeringwithhostengineering.microbcellfact.2016,15,(1),113.)一步法基因失活方法，利用组氨基酸(his3)缺陷对pfk1(geneid:853155)基因和pfk2(geneid:855245)基因进行敲除，获得pfk1基因敲除的突变菌株be1和pfk2基因敲除的突变菌株be2。
基因敲除和验证引物
将酿酒酵母m3、突变菌株be1、突变菌株be2按照实施例2的方法分别接种到ypm培养基中，30℃，200rpm条件下培养96小时，测定细胞类胡萝卜素含量，计算占干重比，结果如图3所示，从图3可以看出pfk1基因的敲除，可以完全获得与突变菌株m3相当的类胡萝卜素含量，说明pfk1是本发明所获得的新的改造靶点。同时，我们也对pfk2基因也进行了敲除，发现其虽然可以促进类胡萝卜素的积累，但会导致菌株的生长缺陷。
实施例4比较转录组揭示潜在机制
为了解释pfk1失活促进类胡萝卜素合成的潜在机理，我们将出发菌株和突变菌株m3菌株进行转录组测序，进行比较转录组分析。从图4可以看出，总计有199个基因发生了显著变化(大于2倍)，其中37个基因显著上调，162基因显著下调。kegg和go富集分析发现，显著变化基因主要富集于糖酵解途径和细胞壁合成相关基因，并且大部分是显著下调。特别是糖酵解途径中的大部分基因都显著下调。暗示了pfk1的失活可能削弱了糖酵解过程，导致细胞壁的改变，进而改变了细胞膜结构，影响了类胡萝卜素的积累。
以上对本发明所提供的一株高产类胡萝卜素的酿酒酵母突变菌株及其实验室适应性进化筛选方法进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
1.酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)m3，保藏编号为：gdmccno:61336。
2.权利要求1所述的酿酒酵母m3在类胡萝卜素生产中的应用。
3.如权利要求1所述的酿酒酵母m3，其特征在于，是通过乙醇介导的适应性进化获得的。
4.如权利要求1所述的酿酒酵母m3，其特征在于，是通过不断提高乙醇浓度筛选获得。
5.如权利要求1所述的酿酒酵母m3，其特征在于，是在10％乙醇浓度下获得的。
6.一种提高酿酒酵母类胡萝卜素产量的方法，其特征在于，是将酿酒酵母基因组中的pfk1基因突变失活，以其为发酵菌株进行发酵培养获得类胡萝卜素。
7.一种提高酿酒酵母类胡萝卜素产量的方法，其特征在于，是将酿酒酵母基因组中的pfk2基因突变失活，以其为发酵菌株进行发酵培养获得类胡萝卜素。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，是将酿酒酵母基因组中的pfk1基因突变失活的突变株接种到ypd或ypm培养基中进行发酵培养，产类胡萝卜素。
9.将酿酒酵母基因组中的pfk1或pfk2基因突变失活在提高酿酒酵母产类胡萝卜素中的应用。
10.一种突变菌株，其特征在于，是将酿酒酵母基因组中的pfk1或pfk2基因突变失活获得的菌株。
技术总结