一种谷氨酰胺合成酶基因功能缺失的酵母突变体及其制备方法和应用与流程

专利2022-07-08 126

本发明涉及生物技术领域，具体涉及到重组改造酵母技术，尤其涉及一种谷氨酰胺合成酶基因功能缺失的酵母突变体，及其在研发，药物，化工等领域的应用。

背景技术：

目前获得基因突变缺陷型菌株可以通过诱变筛选缺陷型菌株，可以通过基因定点敲除，通过筛选可以高效获得缺陷型菌株，可以通过同源重组精准替换基因序列，获得基因预期改变的突变体缺陷型菌株。

谷氨酰胺合成酶是生物氮代谢的关键酶，以谷氨酸为底物与nh4合成谷氨酰胺，把无机氮转化为有机氮。谷氨酰胺合成酶是除草剂草铵膦的靶标蛋白，草铵膦通过与底物谷氨酸的竞争，占据谷氨酰胺合成酶反应中心，造成谷氨酰胺合成反应终断，使得细胞无法进行氮代谢，还会在细胞内造成nh4的积累，使细胞铵中毒而无法存活，导致植物体死亡，达到除草效果。同样在酵母中谷氨酰胺合成酶基因功能缺失会造成酵母不能生长，且在相应的缺陷型培养基上也难于筛选。随着基因定向进化技术的发展，进化抗草铵膦基因gs也成为可能，进化获得的大量基因的突变体需要进行快速而有效的验证。酵母是一种单细胞真核生物，由于培养操作方便，常被作为模式真核生物用于研究当中，也常常用于医药，化工等等的研究和应用领域。为了消除酵母内源gs基因的影响，需要一种谷氨酰胺合成酶基因功能缺失突变体酵母菌株，用来验证gs基因突变体的抗性和酶活。

技术实现要素：

基于上述现状，本发明的目的在于提供一种关键蛋白基因谷氨酰胺合成酶基因功能缺失的酵母突变体，并且提供了谷氨酰胺合成酶基因功能缺失的酵母突变体的制备方法及其在研发、医药和化工等等领域的应用。

本发明一方面提供了一种谷氨酰胺合成酶基因功能缺失的酵母突变体，所述酵母突变体的gln1基因缺失了gln1基因的部分或全部并导致gln1基因丧失功能；优选地，所述酵母突变体的gln1基因缺失了完整gln1基因的第961位至第2113位的脱氧核苷酸序列，所述完整gln1基因的核苷酸序列为seqidno:1。

在根据本发明的一个实施方案中，所述突变后的gln1基因序列为seqidno:2。

在根据本发明的一个实施方案中，所述酵母突变体细胞中不含外源质粒。

本发明还提供了上述的谷氨酰胺合成酶基因功能缺失的酵母突变体的制备方法，包括：

1)选择gln1基因的靶区段，确定对所述靶区段进行定点敲除的敲除技术，并基于所述敲除技术的操作原则设计敲除载体；优选地，所述敲除技术选自zfn、telen或crispr技术中的任一种；优选地通过crispr的方法构建基因敲除载体；

2)基于其它物种中的gln1同工基因的cds构建功能互补基因载体；

3)基于gln1基因构建含有gln1同源重组供体序列的供体序列；

4)将步骤1)-3)中所述的剪切载体、功能互补基因载体和供体序列同时转化到酵母细胞中；

5)在添加了谷氨酰胺和对应于所述抗性基因抗性成分，且不含组氨酸的sc-h q培养基中培养数日后，通过pcr鉴定选取gln1基因的第961-2113位的敲除的酵母菌株保存，即得如上所述的谷氨酰胺合成酶基因功能缺失的酵母突变体。

在根据本发明的一个实施方案中，所述制备方法还包括：

6)将步骤4)保存的酵母突变体菌株接种于无抗性成分的sc-h q培养中数日，然后分离接种于sc-h q固体培养基，在所述sc-h q固体培养基中挑取若干单菌落，每个单菌落同时接种于sc-h q固体培养基和含有抗性成分的sc-h q固体培养基中，并标记；

7)数日后选取在sc-h q固体培养基上能够生长，而在含有抗性成分的sc-h q固体培养基上不能生长的菌落，并保存；即得到去除了剪切载体质粒的酵母突变体。

在根据本发明的一个实施方案中，所述制备方法还包括：

8)将步骤7)得到的酵母突变体接种于添加了谷氨酰胺的ypad q固体培养基上，培养数日后，挑取单菌落再次接种于另一添加了谷氨酰胺的ypad q固体培养基上，如此继代3-5代后，挑取若干单菌落，分别以无菌水清洗稀释，然后每个单菌落的酵母菌各自分别同时接种于一添加了谷氨酰胺的sc q固体培养基和一sc-h q固体培养基，并标记；选取在sc q固体培养基上能够生长，而在sc-h q固体培养基上不能生长的菌株并保存，即得进一步去除了功能互补基因载体质粒的酵母突变体。

在根据本发明的一个实施方案中，步骤1)中所述敲除技术选自zfn、telen或crispr技术中的任一种；优选为crispr技术。

在根据本发明的一个实施方案中，步骤2)中所述gln1同工基因为水稻osgs1基因，优选为osgs1基因的cds序列seqidno:5；优选地，所述功能互补基因载体中包含依次连接的his3表达盒(核苷酸序列如seqidno:10所示)、tef1启动子(核苷酸序列如seqidno:11所示)、osgs1基因的cds序列(核苷酸序列如seqidno:5所示)和adh1终止子(核苷酸序列如seqidno:12所示)。

在根据本发明的一个实施方案中，步骤3)中所述供体序列是通过包括下述步骤的方法制备得到的：

以某酵母菌株基因组dna为模板，用引物gln1a-f(eqidno:23)和gln1a-r(eqidno:24)进行pcr扩增，得到片段gln1donora，以引物gln1b-f(seqidno:26)和gln1b-r2(seqidno:27)进行pcr扩增得到片段gln1donorb，再以gln1-donora和gln1-donorb混合物作为模板，以引物gln1a-f和gln1b-r2进行重叠延伸pcr扩增，即得到供体序列。

本发明还提供了上述的谷氨酰胺合成酶基因功能缺失的酵母突变体，或者如上所述的制备方法制备得到的谷氨酰胺合成酶基因功能缺失的酵母突变体在酵母的gs功能鉴定、酵母中gs对草铵膦抗性的鉴定或gs的定向进化鉴定中的应用。

本发明提供的技术方案具有以下有益效果：

本发明提供的方法能够精准实现基因片段缺失，使酵母菌的gln1基因功能丧失。同时，考虑到酵母菌的gln1基因功能敲除后，即使在添加了谷氨酰胺的培养基上也很难筛选到突变体的情况，本发明通过转化功能互补基因，使该功能互补基因可以代替酵母gln1的功能，从而可以较容易的筛选到gln1敲除片段的突变菌株。

附图说明

图1为ycplac22载体图；

图2为py24载体图；

图3为py24-osgs1载体图；

图4为py24-osgs2载体图；

图5为py24-gln1载体图；

图6为通过pcr鉴定gln1突变体的凝胶电泳图；

图7为gln1功能缺失验证结果图；其中，1、野生型(wt)：内源gln1未敲除的酵母菌株by4741；2、by4741gln1δ:内源gln1敲除的酵母菌株by4741gln1δ；3、osgs1：gln1敲除后的酵母菌株by4741gln1δ转入py24-osgs1载体；4、osgs2：gln1敲除后的酵母菌株by4741gln1δ转入py24-osgs2载体；5、gln1：gln1敲除后的酵母菌株by4741gln1δ转入py24-gln1载体。

具体实施方式

以下实施例用于说明本申请，并非用来限制本申请的保护范围。

下面将结合附图更详细地描述本申请的具体实施例。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本申请，并且能够将本申请的范围完整的传达给本领域的技术人员。

如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均来自常规生化试剂供应商购买得到。

应当理解，虽然本发明在实施例中使用酵母菌株by4741，但仅为示例的目的，而非限定酵母菌株，使用其他类型的酵母菌株也应在本发明范围之内。

本发明所用酵母培养基：

ypad培养基：

酵母提取物10g/l，蛋白胨20g/l，硫酸腺嘌呤0.1g/l，d-葡萄糖20g/l，ph5.6。固体培养基加入琼脂粉20g/l。

ypad q培养基：

酵母提取物10g/l，蛋白胨20g/l，硫酸腺嘌呤0.1g/l，d-葡萄糖20g/l，l-谷氨酰胺0.5g/l，ph5.6。固体培养基加入琼脂粉20g/l。

sc培养基：

ynb(含硫酸铵无氨基酵母氮源)6.7g/l，d-葡萄糖20g/l，l-谷氨酰胺0.05g/l，l-异亮氨酸0.05g/l，l-甲硫氨酸0.05g/l，l-苯丙氨酸0.05g/l，l-脯氨酸0.05g/l，l-丝氨酸0.05g/l，l-酪氨酸0.05g/l，l-缬氨酸0.05g/l，l-腺嘌呤0.1g/l，l-精氨酸0.1g/l，l-半胱氨酸0.1g/l，l-组氨酸0.1g/l，l-亮氨酸0.1g/l，l-赖氨酸0.1g/l，l-苏氨酸0.1g/l，l-色氨酸0.1g/l，l-尿嘧啶0.1g/l，ph5.6。固体培养基加入琼脂粉20g/l。

sc q培养基：

ynb(含硫酸铵无氨基酵母氮源)6.7g/l，d-葡萄糖20g/l，l-谷氨酰胺0.05g/l，l-异亮氨酸0.05g/l，l-甲硫氨酸0.05g/l，l-苯丙氨酸0.05g/l，l-脯氨酸0.05g/l，l-丝氨酸0.05g/l，l-酪氨酸0.05g/l，l-缬氨酸0.05g/l，l-腺嘌呤0.1g/l，l-精氨酸0.1g/l，l-半胱氨酸0.1g/l，l-组氨酸0.1g/l，l-亮氨酸0.1g/l，l-赖氨酸0.1g/l，l-苏氨酸0.1g/l，l-色氨酸0.1g/l，l-,尿嘧啶0.1g/l，l-谷氨酰胺0.5g/l，ph5.6。固体培养基中还需加入琼脂粉20g/l。

sc-h培养基：

ynb(含硫酸铵无氨基酵母氮源)6.7g/l，d-葡萄糖20g/l，l-谷氨酰胺0.05g/l，l-异亮氨酸0.05g/l，l-甲硫氨酸0.05g/l，l-苯丙氨酸0.05g/l，l-脯氨酸0.05g/l，l-丝氨酸0.05g/l，l-酪氨酸0.05g/l，l-缬氨酸0.05g/l，l-腺嘌呤0.1g/l，l-精氨酸0.1g/l，l-半胱氨酸0.1g/l，l-亮氨酸0.1g/l，l-赖氨酸0.1g/l，l-苏氨酸0.1g/l，l-色氨酸0.1g/l，l-尿嘧啶0.1g/l，ph5.6。固体培养基加入琼脂粉20g/l。

sc-h q培养基：

ynb(含硫酸铵无氨基酵母氮源)6.7g/l，d-葡萄糖20g/l，l-谷氨酰胺0.05g/l，l-异亮氨酸0.05g/l，l-甲硫氨酸0.05g/l，l-苯丙氨酸0.05g/l，l-脯氨酸0.05g/l，l-丝氨酸0.05g/l，l-酪氨酸0.05g/l，l-缬氨酸0.05g/l，l-腺嘌呤0.1g/l，l-精氨酸0.1g/l，l-半胱氨酸0.1g/l，l-亮氨酸0.1g/l，l-赖氨酸0.1g/l，l-苏氨酸0.1g/l，l-色氨酸0.1g/l，l-尿嘧啶0.1g/l，l-谷氨酰胺0.5g/l，ph5.6。固体培养基加入琼脂粉20g/l。

实施例1：制备谷氨酰胺合成酶基因gln1功能缺失突变的酵母菌株。

本实施例通过转化功能互补基因和同源重组的方法，将酵母体内gln1基因(核苷酸序列如seqidno:1所示)的第961-2113位的1153个碱基全部删除，得到了gln1功能缺失突变体。最终的突变体gln1基因的序列如seqidno:2所示。具体的实验步骤如下：

1.gln1基因特异位点敲除载体的构建

定点敲除的方法可以选自且不限于zfn,telen或crispr等基因敲除技术，也可以选自其它可行的敲除方法。酵母中只转化同源重组供体模板就可以实现精准重组修复，转化同源重组供体模板时，同时转化基因定点敲除载体可以增加同源重组修复的频率。

本研究选择crispr的方法说明，酵母gln1基因上设计两个靶点gln1sg3，gln1sg5，(靶点设计参考http://chopchop.cbu.uib.no)。以pcas(addgene编号60847)载体为骨架，通过gibson组装的方法构建获得敲除载体py10，py10含有g418抗性，具体步骤如下，

pcas载体用smai与bglii双酶切回收大片段备用，以pcas为模板，用以下四对引物分别进行pcr扩增，pcas-gf1/gln1sg3-r1扩增产物序列a，gln1sg3-f1/p1sg1-r2扩增产物序列b，p1sg2-f1/gln1sg5-r2扩增产物序列c，gln1sg5-f1/pcas-gr1扩增产物序列d。pcas载体用smai与bglii双酶切回收大片段再与a、b、c、d四个片段通过gibson组装得到载体py10，py10含有两个gln1的靶点，序列如下，

(seqidno:8)gln1sg3atcatgtgtgaaactgtttg；

(seqidno:9)gln1sg5tatctagaactggaccaaag。

2.gln1功能互补基因载体的构建

载体ycplac22(genbank:x75455，如图1所示)的改造，首先通过gibson组装的方法把ycplac22中的trp1用his3表达盒替换，第二步把tef1启动子和adh1终止子与ycplac22连接得到载体py24(如图2所示)。接下来以水稻日本晴cdna为模板，引物y24gs1-f/y24gs1-r进行pcr扩增得到水稻osgs1基因cds，连接到py24载体得到py24-osgs1(如图3所示)。

3.pcr法制备gln1同源重组供体序列gln1donor

以酵母菌株by4741基因组dna为模板，用引物gln1a-f和gln1a-r进行pcr扩增，得到片段gln1donora，以引物gln1b-f和gln1b-r2进行pcr扩增得到片段gln1donorb，再以gln1-donora和gln1-donorb混合物作为模板，用引物gln1a-f和gln1b-r2进行重叠延伸pcr扩增得到gln1donor，核苷酸序列如seqidno:4所示。

4.转化酵母

使用1ug的载体py10，1ug的载体py24-osgs1和5ug的gln1donor热激法共转化酵母by4741，转化后的酵母涂布于含有200mg/lg418的sc-h q平板上，30℃培养3-5天。

5.突变体的筛选

选取在步骤4中获得的平板上生长3-5天后的酵母菌落，用牙签挑取16个菌落接菌到5ml含有200mg/lg418的sc-h q的培养基中，30℃培养1-2天，提取酵母基因组dna。酵母基因组dna做模板，用引物glna-f3/gln1b-r2进行pcr扩增,只挑选能够扩增到243bp长度的菌落，不能扩增到243bp长度的菌落，或同时能扩增到243bp和1396bp长度片断的菌落，或只扩增到1396bp长度片断的菌落均弃去。扩增到243bp长度的菌落用引物glna-f3/gln1b-r2进行测序，从中筛选与seqidno:2相同的序列，所得到的菌落就是gln1基因的第961-2113位的1153个碱基全部删除后的酵母菌株，保存菌株。

6.酵母中剪切载体质粒的去除

根据步骤5的筛选结果，在步骤4中的含有200mg/lg418的sc-h q平板上挑取相对应的酵母突变体菌落，接于5ml的sc-h q培养基中，30℃下培养1-2天。用划线法将过夜培养的菌液划于sc-h q平板上。再在此sc-h q平板上挑取单菌落，接于5ml的sc-h q培养基中，30℃培养1-2天。用划线法将培养的菌液同时分别点sc-h q平板和含有200mg/lg418的sc-h q平板上。如果在sc-h q平板上能够生长，而在含有g418的sc-h q平板上不能生长，说明此菌中的剪切载体质粒已经去除，保存筛选到的酵母菌株。

7.酵母中py24-osgs1载体质粒的去除

根据步骤6的筛选结果，把筛选到的菌株稀释1000倍，取50ul涂布ypad q平板上30℃下培养3-5天，挑取单菌落于1000ml无菌水中打散，取50ul涂布ypad q平板上30℃下培养3-5天。再在此ypad q平板上挑取单菌落于1000ml无菌水中打散，接于取50ul涂布ypad q平板上30℃下培养3-5天。需要继代培养3-5代，挑取单菌落与200ul无菌水打散，以无菌水清洗1-2遍，最后打散在50ul无菌水中，取1ul菌液分别点在sc q平板和sc-h q平板上。如果能够在sc q平板上生长，而在sc-h q平板上不能生长，说明此菌中的py24-osgs1质粒已经去除，所获得的菌落即为所需要的酵母突变体，是gln1基因的第961-2113位的1153个碱基的酵母突变体，保存筛选到的不含py10和py24-osgs1质粒，且gln1基因突变的酵母菌株by4741gln1δ。

实施例2：实施例1中获得的gln1缺失酵母突变体的功能验证

在实施例1中水稻来源的osgs1基因已经可以互补酵母gln1的功能，为了进一步证明gln1突变的功能缺失，再选择水稻来源的osgs2基因(seqidno：6)和酵母内源的基因gln1cds(seqidno：7)来做功能互补验证，osgs2基因是去除信号肽的序列。

gln1功能互补载体的构建，用引物y24gs2-f/y24gs2-r进行pcr扩增获得osgs2，y24gln1-f/y24gln1-r进行pcr扩增获得gln1。osgs2和gln1分别与py24进行gibson组装得到载体py24-osgs2(如图4所示)和py24-gln1(如图5所示)。

所获得的载体py24-osgs1、py24-osgs2和py24-gln1通过热击法分别转化酵母突变体菌株by4741gln1δ，涂sc-h q平板，30℃培养3-5天，选取单菌落接菌在5mlsc-h q培养基中30℃培养1-2天。取50ul菌液用无菌水清洗两遍后稀释到od600约0.1，取1ul分别点于ypad、ypad q、ypad q g418、sc、sc q和sc-h平板上，30℃培养3-5天观察结果，结果如图7所示。

图7模板如下所示：

1、野生型(wt)：内源gln1未敲除的酵母菌株by4741；

2、by4741gln1δ:内源gln1敲除的酵母菌株by4741gln1δ；

3、osgs1：gln1敲除后的酵母菌株by4741gln1δ转入py24-osgs1载体；

4、osgs2：gln1敲除后的酵母菌株by4741gln1δ转入py24-osgs2载体；

5、gln1：gln1敲除后的酵母菌株by4741gln1δ转入py24-gln1载体。

30℃培养3-5天后，在ypad q平板上所有菌都可以生长；在ypad平板上by4741gln1δ没有生长；在ypad q g148平板上所有菌都不能生长，证明py10已经去除；在sc平板上只有by4741gln1δ没有生长；在sc q平板上所有菌都可以生长；在sc-h平板上生长wt和by4741gln1δ不能生长，证明py24-osgs1已经去除。综合菌落生长状况osgs1，osgs2和gln1可以互补by4741gln1δ功能的缺失。此外，by4741gln1δ在液体ypad培养基中可以生长，但生长速度比在ypad q和sc q要慢，by4741gln1δ在液体ypad q和sc q培养基培养24-48小时可以生长，在液体ypda中需要48-72小时，培养条件是30℃，220-250rpm。

应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

本发明所涉及的基因序列

seqidno:1gln1genomesequence，atg上游1000bp,taa下游500bp；

aaacagccatttttcaatatgcgctacccggcggcggaatatcgtcccagctacatgatagccgcttttttgtctctctttgtcccacctgttcaaagacatttggtaatcagtttgtcaggacaatagtaaacaaaagtgcgcaagtacacatgcgctgcacgtgcggccggaacaatggcgcttttggctcgtccggatgatgcgaaagggaaaataaaatctcgcaatcggaaaaacactcgcgagaaccaaaacaaggatcccctaaacccagtacccgcatacggttctcccggggaaaagggggcggaggccggacgatgagtgttacccggataggactacggatcgcttcgcacgtttgtttacaattgatgactgcgctcccctaatagataagataagctcgcgaaggcagaaaaaaaaaagtcttctacagcagttggtccgcacagacgatgccagacggtgttttatcgaaaatttttttcgcatcatagtgccatttgtggtcattattattccccaaatatgcgaaaatagtacactatttttggcaggagagtaggctgatatgccgcattgatgtcctgtgtagcgaaacacaaacaaaaaaagaaaaagtaggatgaaaaaaagaaaagtaatatgaaaaaagagtgaaaaattaattcatttgttagtgtaagcggtcaggtgtaagtagtaggcttgataatgaattaaagatgactccgacgcatattgtttgccatgtttttattttagtttgtagatttctttttttgtaatatataagggagtgattctatatatcgaattctcaggcttggttggttcgtaggttgttctgtctttgttttcgttaggtaagaacatcacacaaagataactatagaatcacatacatatttgtgagaaattaacttcatttcatttatagaagaagttcaaccgaaacaaaaattaaacataatataatataatataatcaaaaatggctgaagcaagcatcgaaaagactcaaattttacaaaaatatctagaactggaccaaagaggtagaataattgccgaatacgtttggatcgatggtactggtaacttacgttccaaaggtagaactttgaagaagagaatcacatccattgaccaattgccagaatggaacttcgacggttcttctaccaaccaagcgccaggccacgactctgacatctatttgaaacccgttgcttactacccagatcccttcaggagaggtgacaacattgttgtcttggccgcatgttacaacaatgacggtactccaaacaagttcaaccacagacacgaagctgccaagctatttgctgctcataaggatgaagaaatctggtttggtctagaacaagaatacactctatttgacatgtatgacgatgtttacggatggccaaagggtgggtacccagctccacaaggtccttactactgtggtgttggtgccggtaaggtttatgccagagacatgatcgaagctcactacagagcttgtttgtatgccggattagaaatttctggtattaacgctgaagtcatgccatctcaatgggaattccaagtcggtccatgtaccggtattgacatgggtgaccaattatggatggccagatactttttgcacagagtggcagaagagtttggtatcaagatctcattccatccaaagccattgaagggtgactggaacggtgccggttgtcacactaacgtttccaccaaggaaatgagacaaccaggtggtatgaaatacatcgaacaagccatcgagaagttatccaagagacacgctgaacacattaagttgtacggtagcgataacgacatgagattaactggtagacatgaaaccgcttccatgactgccttttcttctggtgtcgccaacagaggtagctcaattagaatcccaagatccgtcgccaaggaaggttacggttactttgaagaccgtagaccagcttccaacatcgacccatacttggttacaggtatcatgtgtgaaactgtttgcggtgctattgacaatgctgacatgacgaaggaatttgaaagagaatcttcataagcataatacaatggtgcaaaattttttttaggcaggaactaatctactaataaactaacaataatgcacaggaaatattaatgatttatttatttattttactactatattacattacttttttacataaaaaatttcccatctcacgatcaaaaacaggcatgagaaaaaatcaaaatttataaaattaatttctaataaattaactgtaatgacataaaataagaggctgcgacagtcgaattttttctttttttttttctgcaaagcgacgctgtgttgtatattgctctaaaataattttctattgttttcctcatgccattaccctacctacccgtgcataattacacgagggggagagctttttcttcccaaaccagaccaggaaaaaaaaaaaggtttgataatgaaaaaaaaaaaaagtattgtatatgactgttttcctgataaaagaatgcctgcaataattcaaagacaagagatataaaagtgcactg

seqidno:2gln1kogenomesequence精确敲除cds区后的序列

seqidno:3gln1genomesequence敲除掉的序列1153bp

aaacaaaaattaaacataatataatataatataatcaaaaatggctgaagcaagcatcgaaaagactcaaattttacaaaaatatctagaactggaccaaagaggtagaataattgccgaatacgtttggatcgatggtactggtaacttacgttccaaaggtagaactttgaagaagagaatcacatccattgaccaattgccagaatggaacttcgacggttcttctaccaaccaagcgccaggccacgactctgacatctatttgaaacccgttgcttactacccagatcccttcaggagaggtgacaacattgttgtcttggccgcatgttacaacaatgacggtactccaaacaagttcaaccacagacacgaagctgccaagctatttgctgctcataaggatgaagaaatctggtttggtctagaacaagaatacactctatttgacatgtatgacgatgtttacggatggccaaagggtgggtacccagctccacaaggtccttactactgtggtgttggtgccggtaaggtttatgccagagacatgatcgaagctcactacagagcttgtttgtatgccggattagaaatttctggtattaacgctgaagtcatgccatctcaatgggaattccaagtcggtccatgtaccggtattgacatgggtgaccaattatggatggccagatactttttgcacagagtggcagaagagtttggtatcaagatctcattccatccaaagccattgaagggtgactggaacggtgccggttgtcacactaacgtttccaccaaggaaatgagacaaccaggtggtatgaaatacatcgaacaagccatcgagaagttatccaagagacacgctgaacacattaagttgtacggtagcgataacgacatgagattaactggtagacatgaaaccgcttccatgactgccttttcttctggtgtcgccaacagaggtagctcaattagaatcccaagatccgtcgccaaggaaggttacggttactttgaagaccgtagaccagcttccaacatcgacccatacttggttacaggtatcatgtgtgaaactgtttgcggtgctattgacaatgctgacatgacgaaggaatttgaaagagaatcttcataa

seqidno:4gln1donor用于重组敲除的供体序列

ggcttggttggttcgtaggttgttctgtctttgttttcgttaggtaagaacatcacacaaagataactatagaatcacatacatatttgtgagaaattaacttcatttcatttatagaagaagttcaaccggcataatacaatggtgcaaaattttttttaggcaggaactaatctactaataaactaacaataatgcacaggaa

seqidno:5水稻osgs1基因cds序列

atggcttctctcaccgatctcgtcaacctcaacctctccgacaccacggagaagatcatcgccgagtacatatggatcggtggatctggcatggatctcaggagcaaggctaggactctctccggccctgtgactgatcccagcaagctgcccaagtggaactacgatggctccagcaccggccaggcccccggcgaggacagtgaggtcatcctgtacccacaggctatcttcaaggacccattcaggaagggaaacaacatccttgtcatgtgcgattgctacacgccagccggagaaccgatccccaccaacaagaggcacaatgctgccaagatcttcagctcccctgaggttgcttctgaggagccctggtacggtattgagcaagagtacaccctcctccagaaggacatcaactggccccttggctggcctgttggtggcttccctggtcctcagggtccttactactgtggtatcggtgctgacaagtcttttgggcgtgatattgttgactcccactacaaggcttgcctctatgccggcatcaacatcagtggaatcaacggcgaggtcatgccaggacagtgggagttccaagttggcccgtctgtcggcatttctgccggtgatcaggtgtgggttgctcgctacattcttgagaggatcaccgagatcgccggagtcgtcgtctcatttgaccccaagcccatcccgggagactggaacggtgctggtgctcacaccaactacagcaccaagtcgatgaggaacgatggtggctacgagatcatcaagtccgccattgagaagctcaagctcaggcacaaggagcacatctccgcctacggcgagggcaacgagcgccggctcaccggcaggcacgagaccgccgacatcaacaccttcagctggggagttgccaaccgcggcgcctcggtccgcgtcggccgggagacggagcagaacggcaagggctacttcgaggatcgccggccggcgtccaacatggacccttacatcgtcacctccatgatcgccgagaccaccatcatctggaagccctga

seqidno:6水稻osgs2基因cds序列去除信号肽序列

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seqidno:7酵母gln1基因cds序列

atggctgaagcaagcatcgaaaagactcaaattttacaaaaatatctagaactggaccaaagaggtagaataattgccgaatacgtttggatcgatggtactggtaacttacgttccaaaggtagaactttgaagaagagaatcacatccattgaccaattgccagaatggaacttcgacggttcttctaccaaccaagcgccaggccacgactctgacatctatttgaaacccgttgcttactacccagatcccttcaggagaggtgacaacattgttgtcttggccgcatgttacaacaatgacggtactccaaacaagttcaaccacagacacgaagctgccaagctatttgctgctcataaggatgaagaaatctggtttggtctagaacaagaatacactctatttgacatgtatgacgatgtttacggatggccaaagggtgggtacccagctccacaaggtccttactactgtggtgttggtgccggtaaggtttatgccagagacatgatcgaagctcactacagagcttgtttgtatgccggattagaaatttctggtattaacgctgaagtcatgccatctcaatgggaattccaagtcggtccatgtaccggtattgacatgggtgaccaattatggatggccagatactttttgcacagagtggcagaagagtttggtatcaagatctcattccatccaaagccattgaagggtgactggaacggtgccggttgtcacactaacgtttccaccaaggaaatgagacaaccaggtggtatgaaatacatcgaacaagccatcgagaagttatccaagagacacgctgaacacattaagttgtacggtagcgataacgacatgagattaactggtagacatgaaaccgcttccatgactgccttttcttctggtgtcgccaacagaggtagctcaattagaatcccaagatccgtcgccaaggaaggttacggttactttgaagaccgtagaccagcttccaacatcgacccatacttggttacaggtatcatgtgtgaaactgtttgcggtgctattgacaatgctgacatgacgaaggaatttgaaagagaatcttcataa

seqidno:8gln1sg3靶序列

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seqidno:9gln1sg5靶序列

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seqidno:10his3表达盒序列

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seqidno:11tef1启动子序列

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seqidno:12adh1终止子序列

cgaatttcttatgatttatgatttttattattaaataagttataaaaaaaataagtgtatacaaattttaaagtgactcttaggttttaaaacgaaaattcttattcttgagtaactctttcctgtaggtcaggttgctttctcaggtatagcatgaggtcgctc

引物名称及引物核苷酸序列(5’-3’)

seqidno:13y24gs1-f

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seqidno:14y24gs1-r

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seqidno:15pcas-gf1

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seqidno:16gln1sg3-r1

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seqidno:17gln1sg3-f1

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seqidno:18p1sg1-r2

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seqidno:19p1sg2-f1

cggtgcttttgatggccggcatggtcccagcctcct

seqidno:20gln1sg5-r2

ctttggtccagttctagataaaagtcccattcgccacccgaaggtg

seqidno:21gln1sg5-f1

tatctagaactggaccaaaggttttagagctagaaatagcaagtt

seqidno:22pcas-gr1

ggacgaggcaagctaaacagatctctagacctatatccactagac

seqidno:23gln1a-f

ggcttggttggttcgtaggttgt

seqidno:24gln1a-r

tgtattatgccggttgaacttcttctataaatgaaatg

seqidno:25glna-f3

taatatataagggagtgattctatatatc

seqidno:26gln1b-f

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seqidno:27gln1b-r2

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seqidno:28y24gs2-f

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seqidno:29y24gs2-r

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seqidno:30y24gln1-f

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seqidno:31y24gln1-r

attcgcgagctcggtacccctatgaagattctctttcaaattccttcgt

序列表

<110>科稷达隆生物技术有限公司

<120>一种谷氨酰胺合成酶基因功能缺失的酵母突变体及其制备方法和应用

<160>31

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>2613

<212>dna

<213>酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)

<400>1

aaacagccatttttcaatatgcgctacccggcggcggaatatcgtcccagctacatgata60

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ttctttttttgtaatatataagggagtgattctatatatcgaattctcaggcttggttgg840

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aaacaaaaattaaacataatataatataatataatcaaaaatggctgaagcaagcatcga1020

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atacgtttggatcgatggtactggtaacttacgttccaaaggtagaactttgaagaagag1140

aatcacatccattgaccaattgccagaatggaacttcgacggttcttctaccaaccaagc1200

gccaggccacgactctgacatctatttgaaacccgttgcttactacccagatcccttcag1260

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aaagggtgggtacccagctccacaaggtccttactactgtggtgttggtgccggtaaggt1500

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ttctggtattaacgctgaagtcatgccatctcaatgggaattccaagtcggtccatgtac1620

cggtattgacatgggtgaccaattatggatggccagatactttttgcacagagtggcaga1680

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cggttgtcacactaacgtttccaccaaggaaatgagacaaccaggtggtatgaaatacat1800

cgaacaagccatcgagaagttatccaagagacacgctgaacacattaagttgtacggtag1860

cgataacgacatgagattaactggtagacatgaaaccgcttccatgactgccttttcttc1920

tggtgtcgccaacagaggtagctcaattagaatcccaagatccgtcgccaaggaaggtta1980

cggttactttgaagaccgtagaccagcttccaacatcgacccatacttggttacaggtat2040

catgtgtgaaactgtttgcggtgctattgacaatgctgacatgacgaaggaatttgaaag2100

agaatcttcataagcataatacaatggtgcaaaattttttttaggcaggaactaatctac2160

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tattacattacttttttacataaaaaatttcccatctcacgatcaaaaacaggcatgaga2280

aaaaatcaaaatttataaaattaatttctaataaattaactgtaatgacataaaataaga2340

ggctgcgacagtcgaattttttctttttttttttctgcaaagcgacgctgtgttgtatat2400

tgctctaaaataattttctattgttttcctcatgccattaccctacctacccgtgcataa2460

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taatgaaaaaaaaaaaaagtattgtatatgactgttttcctgataaaagaatgcctgcaa2580

taattcaaagacaagagatataaaagtgcactg2613

<210>2

<211>1460

<212>dna

<213>酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)

<400>2