本发明是有关一种组合物以及其用途，特别是一种用于美白功效的含乳酸菌发酵物的组合物以及其用途。
背景技术：
爱美是人类的天性，拥有白皙亮丽的肌肤是许多东方女性所梦寐以求的梦想。皮肤长期暴露在污染物质、致癌物质及紫外线之下，难免会对皮肤产生伤害。为了减少这些物质对皮肤的伤害，皮肤中的黑色素细胞会产生黑色素。黑色素能吸收大部分紫外线，从而保护和减轻紫外线光引起的皮肤急性和慢性损伤。
黑色素堆积在皮肤，皮肤细胞会产生细胞代谢机制来去除基底层中的黑色素，其原理主要是透过皮肤细胞新陈代谢，以新的皮肤细胞增生取代旧有的黑色素堆积细胞，将被日晒后的皮肤恢复成原本的颜色。然而，随着年龄增长、睡眠不足、紫外线、生活压力等外在或内在因素持续刺激皮肤，往往让黑色素的生成超过了皮肤可以代谢的速度而加速皮肤老化，导致皮肤暗沉或黑斑、皮肤癌等疾病。
综上所述，发展出一种安全且可长期使用的具有美白功效的营养补充品或药妆品有其迫切性。而乳酸菌的发酵物一般来说是安全且有益健康的，因此，找出具有美白功效的乳酸菌发酵物便是目前极需努力的目标。
技术实现要素：
本发明提供一种含乳酸菌发酵物的组合物，其具有抑制黑色素生成的活性效果，因而能够减少黑色素堆积，进而具有皮肤美白的功效并改善肤质。
本发明一实施例的用于美白功效的含乳酸菌发酵物的组合物包含以乳酸菌菌株所发酵产生的具有美白功效的乳酸菌发酵物以及赋形剂、稀释剂或载体，其中乳酸菌菌株选自以下至少其中之一经分离的乳酸菌菌株：短双歧杆菌(bifidobacteriumbreve)bv-889菌株，保藏编号为cgmccno.16145(其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心cgmcc；保藏日期2018年07月23日；地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)、长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacteriumlongumsubsp.infantis)bli-02菌株，保藏编号为cgmccno.15212(其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心cgmcc；保藏日期2018年01月15日；地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)、动物双歧杆菌(bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)cp-9菌株，保藏编号为cctccno：m2014588(其保藏于中国典型培养物保藏中心cctcc；保藏日期2014年11月24日；地址为中国武汉武汉大学，430072)、两歧双歧杆菌(bifidobacteriumbifidum)bf-688菌株，保藏编号为cgmccno.17953(其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心cgmcc；保藏日期2019年06月18日；地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)、唾液乳酸杆菌(lactobacillussalivariussubsp.salicinius)ap-32菌株，保藏编号为cctccno：m2011127(其保藏于中国典型培养物保藏中心cctcc；保藏日期2011年04月10日；地址为中国武汉武汉大学，430072)及副干酪乳酸杆菌(lactobacillusparacasei)gl-156菌株，保藏编号为cctccno：m2014590(其保藏于中国典型培养物保藏中心cctcc；保藏日期2014年11月24日；地址为中国武汉武汉大学，430072)。
本发明另一实施例的以含乳酸菌发酵物的组合物作为美白功效的用途，其中含乳酸菌发酵物的组合物包含以乳酸菌菌株所发酵产生的具有美白功效的乳酸菌发酵物以及赋形剂、稀释剂或载体，其中乳酸菌菌株选自以下至少其中之一经分离的乳酸菌菌株：短双歧杆菌(bifidobacteriumbreve)bv-889菌株，保藏编号为cgmccno.16145、长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacteriumlongumsubsp.infantis)bli-02菌株，保藏编号为cgmccno.15212、动物双歧杆菌(bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)cp-9菌株，保藏编号为cctccno：m2014588、两歧双歧杆菌(bifidobacteriumbifidum)bf-688菌株，保藏编号为cgmccno.17953、唾液乳酸杆菌(lactobacillussalivariussubsp.salicinius)ap-32菌株，保藏编号为cctccno：m2011127以及副干酪乳酸杆菌(lactobacillusparacasei)gl-156菌株，保藏编号为cctccno：m2014590，上述乳酸菌菌株分别保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)以及中国典型培养物保藏中心(cctcc)。
以下通过具体实施例配合所附的附图详加说明，当更容易了解本发明的目的、技术内容、特点及其所达成的功效。
附图说明
图1为本发明乳酸菌菌株的乳酸菌发酵物的抑制黑色素形成能力的试验结果。
图2为本发明乳酸菌菌株的乳酸菌发酵物的抑制酪氨酸酶活性分析的试验结果。
用于专利程序的培养物保藏：
1、本发明的bv-889菌株
保藏日期：2018年07月23日
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101
保藏编号：cgmccno.16145
分类命名：短双歧杆菌(bifidobacteriumbreve)
2、本发明的bli-02菌株
保藏日期：2018年01月15日
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101
保藏编号：cgmccno.15212
分类命名：长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacteriumlongumsubsp.infantis)
3、本发明的cp-9菌株
保藏日期：2014年11月24日
保藏单位：中国典型培养物保藏中心
保藏单位地址：中国武汉武汉大学，430072
保藏编号：cctccno：m2014588
分类命名：动物双歧杆菌(bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)
4、本发明的bf-688菌株
保藏日期：2019年06月18日
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101
保藏编号：cgmccno.17953
分类命名：两歧双歧杆菌(bifidobacteriumbifidum)
5、本发明的ap-32菌株
保藏日期：2011年04月10日
保藏单位：中国典型培养物保藏中心
保藏单位地址：中国武汉武汉大学，430072
保藏编号：cctccno：m2011127
分类命名：唾液乳酸杆菌(lactobacillussalivariussubsp.salicinius)
6、本发明的gl-156菌株
保藏日期：2014年11月24日
保藏单位：中国典型培养物保藏中心
保藏单位地址：中国武汉武汉大学，430072
保藏编号：cctccno：m2014590
分类命名：副干酪乳酸杆菌(lactobacillusparacasei)
具体实施方式
以下将详述本发明的各实施例，并配合附图作为例示。除了这些详细说明的外，本发明亦可广泛地施行于其它的实施例中，任何所述实施例的轻易替代、修改、等效变化都包含在本发明的范围内，并以请求保护范围为准。在说明书的描述中，为了使读者对本发明有较完整的了解，提供了许多特定细节；然而，本发明可能在省略部分或全部特定细节的前提下，仍可实施。此外，众所周知的步骤或组件并未描述于细节中，以避免对本发明形成不必要的限制。附图中相同或类似的组件将以相同或类似符号来表示。特别注意的是，附图仅为示意之用，并非代表组件实际的尺寸或数量，有些细节可能未完全绘出，以求附图的简洁。
本发明所述的乳酸菌菌株的冷冻干燥培养物已分别保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)以及中国典型培养物保藏中心(cctcc，地址为中国武汉武汉大学，430072)。保藏的详细资料如表1所示：
表1乳酸菌菌株的保藏资料
如表1所列已保藏的短双歧杆菌bv-889菌株、长双歧杆菌婴儿亚种bli-02菌株、动物双歧杆菌cp-9菌株、两歧双歧杆菌bf-688菌株、唾液乳酸杆菌ap-32菌株以及副干酪乳酸杆菌gl-156菌株的发酵物，被发现具有抑制黑色素形成及抑制黑色素合成酶的效果。可以理解的是，抑制黑色素形成具有皮肤美白淡斑的活性效果，而抑制黑色素合成酶则具有预防黑色素形成的活性效果。为了简化说明，在未特别说明的情况下，以美白功效可代表抑制黑色素形成以及抑制黑色素合成酶的效果。
于一实施例中，表1所列的乳酸菌菌株的发酵物可作为美白功效的用途。举例而言，本发明一实施例的用于美白功效的含乳酸菌发酵物的组合物包含由乳酸菌菌株所发酵产生的发酵物以及赋形剂、稀释剂或载体。该乳酸菌菌株选自以下至少其中之一经分离的乳酸菌菌株：短双歧杆菌bv-889菌株，保藏编号为cgmccno.16145、长双歧杆菌婴儿亚种bli-02菌株，保藏编号为cgmccno.15212、动物双歧杆菌cp-9菌株，保藏编号为cctccno：m2014588、两歧双歧杆菌bf-688菌株，保藏编号为cgmccno.17953、唾液乳酸杆菌ap-32菌株，保藏编号为cctccno：m2011127以及副干酪乳酸杆菌gl-156菌株，保藏编号为cctccno：m2014590。上述乳酸菌菌株已分别保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)以及中国典型培养物保藏中心(cctcc)。于一实施例中，赋形剂、稀释剂或载体可为生理上可接受的赋形剂、稀释剂或载体，使本发明的含乳酸菌发酵物的组合物作为一食品组合物使用。或者，赋形剂、稀释剂或载体可为药妆品上可接受的赋形剂、稀释剂或载体，使本发明的含乳酸菌发酵物的组合物作为一药妆品组合物使用。
于食品组合物的实施例中，生理上可接受的赋形剂、稀释剂或载体可为一食品。举例而言，食品可包含但不限于乳制饮品、茶、咖啡、口香糖、洁牙糖(例如口含片、咀嚼锭、软糖等)或以上的组合，其中乳制饮品可包含发酵乳、优格、奶酪或乳制饮品乳粉等。
于药妆品组合物的实施例中，药妆品上可接受的赋形剂、稀释剂或载体可为：1)液状化妆品，例如沐浴液、洗发液、化妆水、香水等；2)乳液状化妆品；3)膏霜状化妆品，例如润面霜、粉底霜、洗发膏；4)粉状化妆品，例如香粉、爽身粉；5)块状化妆品，例如粉饼、化妆盒；6)棒状化妆品，例如口红、发蜡。
于一实施例中，本发明的乳酸菌菌株所发酵产生的发酵物可包含去活性菌株或去除菌体的发酵液或其干燥粉末。举例而言，发酵液可为发酵上清液或乳清发酵液等。于一实施例中，本发明的用于美白功效的含乳酸菌发酵物的组合物中乳酸菌发酵物的粉剂含量为0.5％以上；或者，乳酸菌发酵物的溶液含量为2.5％以上。
实施例1：乳酸菌菌株的形态学以及一般性质
根据16srdna序列分析以及api细菌鉴定系统分析结果来确认菌株在分类学上的特征。本发明的乳酸菌菌株在形态学及一般性质上的特征详细列于表2：
表2本发明的乳酸菌菌株的形态学及一般性质特征
实施例2：乳酸菌发酵物的收集与保存
本发明的乳酸菌菌株所发酵产生的发酵物是以短双歧杆菌bv-889菌株、长双歧杆菌婴儿亚种bli-02菌株、动物双歧杆菌cp-9菌株、两歧双歧杆菌bf-688菌株、唾液乳酸杆菌ap-32菌株以及副干酪乳酸杆菌gl-156菌株至少其中之一进行发酵以产生其发酵物，再经由离心、过滤、加热杀菌等步骤，最后纯化出发酵液。依据需求，发酵液可进一步干燥成乳酸菌发酵物粉末。发酵液的粉剂或水溶液可保存于常温。本发明所使用的短双歧杆菌bv-889菌株、长双歧杆菌婴儿亚种bli-02菌株、动物双歧杆菌cp-9菌株、两歧双歧杆菌bf-688菌株分离自人类母乳。唾液乳酸杆菌ap-32菌株分离自人类粪便。副干酪乳酸杆菌gl-156菌株分离自人类肠道。
实施例3：乳酸菌发酵物的抑制黑色素形成能力分析
黑色素瘤细胞(b16-f10)被广泛的应用在分析黑色素生成的细胞模型，实验中可以利用紫外光的照射诱发生成黑色素。黑色素瘤细胞也可以透过加入黑色素细胞刺激激素α-msh(melanocyte-stimulatinghormones)诱发黑色素瘤细胞的活化，进而产生黑色素。所生成的黑色素可以利用测量od400nm来加以定量。简言之，将细胞溶解，萃取出黑色素，然后利用分光亮度仪分析od400nm吸光值，吸光值越大代表黑色素瘤细胞所产生的黑色素越多。
本次实验是将本发明的短双歧杆菌bv-889菌株、长双歧杆菌婴儿亚种bli-02菌株、动物双歧杆菌cp-9菌株、两歧双歧杆菌bf-688菌株、唾液乳酸杆菌ap-32菌株或副干酪乳酸杆菌gl-156菌株的发酵物粉剂2.5％或7.5％水溶液混合100nm黑色素细胞刺激激素，接着加入黑色素瘤细胞(b16-f10)共培养48小时。熊果素(arbutin)可抑制黑色素生成，因此以1mm及2mm熊果素(arbutin)混合黑色素细胞刺激激素的黑色素瘤细胞作为阳性对照组，此外，只用黑色素细胞激素刺激的黑色素瘤细胞作为阴性对照组。将细胞溶解后，利用测量od400nm计算各组相对的黑色素生成量。
请参照图1，其为本发明的乳酸菌发酵物抑制黑色素生成的试验结果，其中符号**表示p值<0.01，亦即统计学上具有非常显著的差异；符号*表示p值<0.05，亦即统计学上具有显著差异。由图1的结果可知(最上方虚线为阴性对照组、下方两条虚线为阳性对照组)，本发明的短双歧杆菌bv-889菌株、长双歧杆菌婴儿亚种bli-02菌株、动物双歧杆菌cp-9菌株、两歧双歧杆菌bf-688菌株、唾液乳酸杆菌ap-32菌株或副干酪乳酸杆菌gl-156菌株的发酵物可以有效抑制由黑色素细胞刺激激素所诱发的黑色素生成，其效果与熊果素相当。本发明的乳酸菌菌株所发酵产出的发酵物具有美白功效。
实施例4：乳酸菌发酵物的抑制酪氨酸酶活性分析
酪氨酸酶(tyrosinase)在黑色素的合成中扮演着重要的角色。酪氨酸酶是一种氧化酶，是调控黑色素生成的限速酶。这种酶参与黑色素合成的两个反应：第一步将单酚羟基化为二酚，第二步将邻二酚氧化为邻二醌。邻二醌再经过几个步骤反应后就变为黑色素。因此，酪氨酸酶的活性越高，所生成的黑色素就越多，呈正比关系。而透过抑制酪氨酸酶则可降低黑色素的生成，例如可使用曲酸(kojicacids)来抑制酪氨酸酶活性，达到美白的效果。本实验是将本发明的短双歧杆菌bv-889菌株、长双歧杆菌婴儿亚种bli-02菌株、动物双歧杆菌cp-9菌株、两歧双歧杆菌bf-688菌株、唾液乳酸杆菌ap-32菌株或副干酪乳酸杆菌gl-156菌株的发酵物粉剂配置成20％水溶液进行酪氨酸酶活性抑制分析。另外，以水作为作为空白试验组，浓度0.75mm曲酸及2mm熊果素做为阳性对照组；100nm黑色素细胞刺激激素作为阴性对照组。酪氨酸酶活性抑制分析是使用tyrosinaseinhibitorscreeningkit(biovision)，所有实验流程皆依照kit的说明书建议进行分析。
请参照图2，以说明本发明的乳酸菌发酵物的抑制酪氨酸酶活性的试验结果，其中符号***表示p值<0.005，即统计学上具有非常显著的差异。由图2的试验结果可知，相较于不具抑制酪氨酸酶活性的阴性对照组(黑色素细胞刺激激素组)以及空白对照组，本发明的短双歧杆菌bv-889菌株、长双歧杆菌婴儿亚种bli-02菌株、动物双歧杆菌cp-9菌株、两歧双歧杆菌bf-688菌株、唾液乳酸杆菌ap-32菌株或副干酪乳酸杆菌gl-1565的发酵物具有抑制酪氨酸酶活性的功能，且其抑制的功效可以媲美具有皮肤美白作用的曲酸(kojicacids)及熊果素，甚至更好。
综合上述，本发明的短双歧杆菌bv-889菌株、长双歧杆菌婴儿亚种bli-02菌株、动物双歧杆菌cp-9菌株、两歧双歧杆菌bf-688菌株、唾液乳酸杆菌ap-32菌株或副干酪乳酸杆菌gl-1565菌株所发酵产出的发酵物具有抑制黑色素生成以及抑制黑色素合成酶的能力。因此，本发明的短双歧杆菌bv-889菌株、长双歧杆菌婴儿亚种bli-02菌株、动物双歧杆菌cp-9菌株、两歧双歧杆菌bf-688菌株、唾液乳酸杆菌ap-32菌株或副干酪乳酸杆菌gl-1565菌株所发酵产出的发酵物具有皮肤美白淡斑的活性效果，且能够预防生成黑色素。
以上所述的实施例仅是为说明本发明的技术思想及特点，其目的在使熟习此项技艺的人士能够了解本发明的内容并据以实施，当不能以之限定本发明的专利范围，即大凡依本发明所揭示的精神所作的均等变化或修饰，仍应涵盖在本发明的专利范围内。
1.一种用于美白功效的含乳酸菌发酵物的组合物，其包含：
以乳酸菌菌株所发酵产生的具有美白功效的发酵物，该乳酸菌菌株选自以下至少其中之一经分离的乳酸菌菌株：短双歧杆菌(bifidobacteriumbreve)bv-889菌株，保藏编号为cgmccno.16145、长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacteriumlongumsubsp.infantis)bli-02菌株，保藏编号为cgmccno.15212、动物双歧杆菌(bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)cp-9菌株，保藏编号为cctccno：m2014588、两歧双歧杆菌(bifidobacteriumbifidum)bf-688菌株，保藏编号为cgmccno.17953、唾液乳酸杆菌(lactobacillussalivariussubsp.salicinius)ap-32菌株，保藏编号为cctccno：m2011127以及副干酪乳酸杆菌(lactobacillusparacasei)gl-156菌株，保藏编号为cctccno：m2014590，上述乳酸菌菌株分别保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)以及中国典型培养物保藏中心(cctcc)；以及
赋形剂、稀释剂或载体。
2.如权利要求1所述的用于美白功效的含乳酸菌发酵物的组合物，其中该发酵物为包含去活性菌株或去除菌体的发酵上清液、乳清发酵液、或以上的干燥粉末。
3.如权利要求1所述的用于美白功效的含乳酸菌发酵物的组合物，其中该赋形剂、稀释剂或载体为生理上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
4.如权利要求1所述的用于美白功效的含乳酸菌发酵物的组合物，其中该赋形剂、稀释剂或载体为一食品。
5.如权利要求4所述的用于美白功效的含乳酸菌发酵物的组合物，其中该食品包含发酵乳、优格、奶酪、乳制饮品乳粉、茶、咖啡、口香糖、洁牙糖或以上的组合。
6.如权利要求1所述的用于美白功效的含乳酸菌发酵物的组合物，其中该赋形剂、稀释剂或载体为药妆上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
7.如权利要求1所述的用于美白功效的含乳酸菌发酵物的组合物，其为液状化妆品、乳液状化妆品、膏霜状化妆品、粉状化妆品、块状化妆品或棒状化妆品。
8.如权利要求1所述的用于美白功效的含乳酸菌发酵物的组合物，其为沐浴液、洗发液、化妆水、香水、润面霜、粉底霜、洗发膏、香粉、爽身粉、粉饼、化妆盒、口红或发蜡。
9.一种以含乳酸菌发酵物的组合物作为美白功效的用途，其中该含乳酸菌发酵物的组合物包含：
以乳酸菌菌株所发酵产生的具有美白功效的发酵物，该乳酸菌菌株选自以下至少其中之一经分离的乳酸菌菌株：短双歧杆菌(bifidobacteriumbreve)bv-889菌株，保藏编号为cgmccno.16145、长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacteriumlongumsubsp.infantis)bli-02菌株，保藏编号为cgmccno.15212、动物双歧杆菌(bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)cp-9菌株，保藏编号为cctccno：m2014588、两歧双歧杆菌(bifidobacteriumbifidum)bf-688菌株，保藏编号为cgmccno.17953、唾液乳酸杆菌(lactobacillussalivariussubsp.salicinius)ap-32菌株，保藏编号为cctccno：m2011127以及副干酪乳酸杆菌(lactobacillusparacasei)gl-156菌株，保藏编号为cctccno：m2014590，上述乳酸菌菌株分别保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)以及中国典型培养物保藏中心(cctcc)；以及
赋形剂、稀释剂或载体。
10.如权利要求9所述的以含乳酸菌发酵物的组合物作为美白功效的用途，其中该发酵物为包含去活性菌株或去除菌体的发酵上清液、乳清发酵液、或以上的干燥粉末。
11.如权利要求9所述的以含乳酸菌发酵物的组合物作为美白功效的用途，其中该赋形剂、稀释剂或载体为生理上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
12.如权利要求9所述的以含乳酸菌发酵物的组合物作为美白功效的用途，其中该赋形剂、稀释剂或载体为一食品。
13.如权利要求12所述的以含乳酸菌发酵物的组合物作为美白功效的用途，其中该食品包含发酵乳、优格、奶酪、乳制饮品乳粉、茶、咖啡、口香糖、洁牙糖或以上的组合。
14.如权利要求9所述的以含乳酸菌发酵物的组合物作为美白功效的用途，其中该赋形剂、稀释剂或载体为药妆上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
15.如权利要求9所述的以含乳酸菌发酵物的组合物作为美白功效的用途，其中含乳酸菌发酵物的组合物为液状化妆品、乳液状化妆品、膏霜状化妆品、粉状化妆品、块状化妆品或棒状化妆品。
16.如权利要求9所述的以含乳酸菌发酵物的组合物作为美白功效的用途，其中该含乳酸菌发酵物的组合物为沐浴液、洗发液、化妆水、香水、润面霜、粉底霜、洗发膏、香粉、爽身粉、粉饼、化妆盒、口红或发蜡。
技术总结