本发明涉及受污染场地生物降解处理技术领域，尤其是涉及一种降解高环多环芳烃的菌株及其污染修复应用。
背景技术：
多环芳烃是一类含有两个或两个以上苯环的芳烃，具有三致作用——致癌、致畸、致突变。世界范围内每年由约4.3万吨多环芳烃释放到大气中，同时有23万吨进入海洋环境。由于其较高的亲脂性，进入环境中的多环芳烃易分配到生物体中，并通过食物链进入人体，对人类健康和生态环境构成极大威胁。
四个苯环以上组成的多环芳烃化合物为高环多环芳烃。苯并[a]芘是五个苯环组成的一种多环芳烃化合物，具有很高的辛醇-水分配系数，生物可利用性低，使其成为一种很难降解的持久性污染物。世界卫生组织国际癌症研究中心经大量的动物试验以及临床观察分析，指定其为一级致癌物质。苯并[a]芘是一切含碳燃料和有机物热解过程中的产物，一般认为在800～1200℃供氧不足的燃烧中产生最多。炼油厂区的土壤中苯并[a]芘含量可高达12mg/kg以上，焦化厂区可高达20mg/kg以上。
多年的研究表明:微生物修复技术能有效的去除污染土壤中的低环多环芳烃，但可降解高环多环芳烃的优势菌株很少。迄今为止，已经富集分离并鉴定的降解高环多环芳烃的细菌主要包括：鞘氨醇菌属(sphingomonassp.)、假单胞菌属(pseudomonassp.)和分枝杆菌属(mycobacteriumsp.)。其中，大多数降解菌能以芘(四环)为唯一碳源和能源生长,以苯并芘(五环)为唯一碳源和能源的单株降解菌的相关文献报道很少。微生物主要以共代谢方式对苯并芘进行降解。微生物共代谢是指微生物利用初级能源物质维持自身生长，通过酶催化作用降解某些非微生物生长所需的有机化合物的生物降解过程。
技术实现要素：
本发明的第一个目的在于提供一种降解高环多环芳烃的菌株，为降解土壤中多环芳烃污染物提供新的种质资源。
为了解决上述第一个技术问题，本发明提供了一种降解高环多环芳烃的菌株，该菌株为微杆菌属，保藏名称为microbacteriumsp.bs-1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.18248。
优选地，所述降解高环多环芳烃的菌株的生物学特性为革兰氏阳性菌，菌落呈黄色，圆形，凸起，边缘整齐，光滑湿润。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明菌株microbacteriumsp.bs-1具有高效降解高环多环芳烃(包括芘和苯并[a]芘)的能力，可用于多环芳烃污染修复，对多环芳烃降解具有广谱性，对于实际多环芳烃污染土壤也具有较好的降解效果，且无需添加其他共代谢碳源。
本发明的第二个目的在于提供一种降解高环多环芳烃的菌株与表面活性剂协同在多环芳烃污染土壤或地下水修复中的应用，可高效降解土壤中多环芳烃污染物。
为了解决上述第二个技术问题，本发明提供了一种降解高环多环芳烃的菌株与表面活性剂协同在多环芳烃污染土壤或地下水修复中的应用。
优选地，所述高环多环芳烃选自萘、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并(a)蒽、苯并(b)荧蒽、苯并(k)荧蒽、苯并(a)芘、茚并(1,2,3-cd)芘、二苯并(a,h)蒽、苯并(g,h,i)苝中的一种或两种或两种以上。
优选地，所述表面活性剂选自tween-80、鼠李糖脂、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精中的一种或两种或两种以上。
优选地，所述菌株的接种量为103～105cfu/ml，所述表面活性剂加入量为0.02％～0.2％。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处描述和示出的本发明实施例的组件能够以各种不同的配置来布置和设计。
因此，以下对本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本实施方式提供一种降解高环多环芳烃的菌株，该菌株为微杆菌属，保藏名称为microbacteriumsp.bs-1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.18248。
所述菌株的生物学特性为革兰氏阳性菌，菌落呈黄色，圆形，凸起，边缘整齐，光滑湿润。
本实施方式还提供一种如前所述的降解高环多环芳烃的菌株与表面活性剂协同在多环芳烃污染土壤或地下水修复中的应用。
所述高环多环芳烃选自萘、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并(a)蒽、苯并(b)荧蒽、苯并(k)荧蒽、苯并(a)芘、茚并(1,2,3-cd)芘、二苯并(a,h)蒽、苯并(g,h,i)苝中的一种或两种或两种以上。
所述表面活性剂选自tween-80、鼠李糖脂、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精中的一种或两种或两种以上。
所述菌株的接种量为103～105cfu/ml，所述表面活性剂加入量为0.02％～0.2％。
实施例1：本发明菌株的富集培养、纯化、筛选及鉴定
(1)无机盐培养基
na2hpo42.44g、kh2po41.52g、(nh4)2so40.5g、mgso40.2g、cacl20.05g、feso42mg、znso410mg、去离子水1000ml，ph＝7.0-7.2，121℃灭菌20min。
(2)菌株的富集培养、纯化
取10g山东某焦化厂污染土壤样品，按1:9加入无机盐培养基，加入0.1％tween-80，ph＝7.0，30℃恒温培养，摇床转速为160r/min，培养一周。后续转接到加入苯并(a)芘的无机盐培养基，苯并(a)芘初始浓度为5mg/l，多次转接，苯并(a)芘浓度提高至20mg/l。
(3)菌种的分离与纯化
将富集的培养液稀释成合适梯度，涂布平板检测优势种群，挑选优势单菌落转接至加入苯并(a)芘的无机盐培养基中进行培养，苯并(a)芘初始浓度为5mg/l，多次转接，苯并(a)芘浓度提高至20mg/l，获得具有相同菌落特征的菌株。
(4)菌种鉴定
①对本发明菌株microbacteriumsp.bs-1进行革兰氏染色，为阳性，菌落呈黄色、圆形、凸起、边缘整齐、光滑湿润。
②从菌株中提取基因组dna，利用16srdna、rpob基因和gyrb基因对菌株进行序列分析：
16srdna利用通用引物27f(5’-agtttgatcmtggctcag-3’)和1492r(5’-ggttaccttgttacgactt-3＇)进行pcr扩增。
gyrb基因利用gyrb-2f(5’-accgtcgagttcgactacga-3’)和gyrb-4r(5’-cctcggtgttgccg/carctt-3’)进行pcr扩增。
rpob基因利用rpob-2fa(5’-acbgtsttyatgggygaytt-3’)和rpob-5r(5’-cgatgaanccgaasgvgttg-3’)进行pcr扩增。
通过与ncbigenbank数据库进行对比，见表1至表3，16srdna与微杆菌属相似度100％，gyrb基因和rpob基因相似度约90％，因此初步确定菌株为微杆菌属，并将其命名为microbacteriumsp.bs-1。
表1菌株bs-116srdna序列对比结果
表2菌株bs-1gyrb基因序列对比结果
表3菌株bs-1rpob基因序列对比结果
实施例2：菌株bs-1在多环芳烃重度污染土壤修复中的应用
本试验所用土样采集于山东某焦化厂，采集回来的土样经自然风干后，剔除石块、树枝等杂质，过2mm样品筛。将＞2mm的土块粉碎后过2mm样品筛，混匀，待用。
菌悬液制备：将菌株转接至加入苯并[a]芘(10mg/l)的无机盐培养基，培养48-72h。将培养的菌液5000rpm离心10min收集菌体，用生理盐水洗涤3次后制成菌悬液。
称取10g实验土壤到150ml锥形瓶中，加入40ml基础无机盐培养基，加入0.1％tween-80。按104cfu/ml的菌株接种量接种到实验土壤中，ph＝7.0，30℃恒温培养，摇床转速为160r/min，培养14d。共做4个重复，每7d取两个重复样品混合，冻干去除水份后检测多环芳烃含量。空白对照样如上述实验过程，不接种，不培养，做2个重复，当天混合、冻干去除水份后，检测多环芳烃含量。空白对照样和接种土样检测结果及其降解率如表4。
表4菌株bs-1对多环芳烃污染土壤的生物修复实验结果
单位：mg/kg
表4实验数据表明在实际污染土壤成分复杂的情况下，菌株bs-1对多环芳烃具有很好的降解效果。实验14d，萘、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并(a)蒽、苯并(b)荧蒽、苯并(k)荧蒽、苯并(a)芘、茚并(1,2,3-cd)芘的降解率均达到95％以上。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
1.一种降解高环多环芳烃的菌株，其特征在于，该菌株为微杆菌属，保藏名称为microbacteriumsp.bs-1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.18248。
2.根据权利要求1所述的降解高环多环芳烃的菌株，其特征在于，所述菌株的生物学特性为革兰氏阳性菌，菌落呈黄色，圆形，凸起，边缘整齐，光滑湿润。
3.一种权利要求1所述的降解高环多环芳烃的菌株与表面活性剂协同在多环芳烃污染土壤或地下水修复中的应用。
4.根据权利要求3所述的降解高环多环芳烃的菌株与表面活性剂协同在多环芳烃污染土壤或地下水修复中的应用，其特征在于，所述高环多环芳烃选自萘、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并(a)蒽、苯并(b)荧蒽、苯并(k)荧蒽、苯并(a)芘、茚并(1,2,3-cd)芘、二苯并(a,h)蒽、苯并(g,h,i)苝中的一种或两种或两种以上。
5.根据权利要求3所述的降解高环多环芳烃的菌株与表面活性剂协同在多环芳烃污染土壤或地下水修复中的应用，其特征在于，所述表面活性剂选自tween-80、鼠李糖脂、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精中的一种或两种或两种以上。
6.根据权利要求3至5任一项所述的降解高环多环芳烃的菌株与表面活性剂协同在多环芳烃污染土壤或地下水修复中的应用，其特征在于，所述菌株的接种量为103～105cfu/ml，所述表面活性剂加入量为0.02％～0.2％。
技术总结